专利名称：：一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药生物活性成分的提取领域，涉及从植物裂叶荨麻中用溶解、提取、萃取、离心和吸附、洗脱的分离方法制备有效植物成分。以及对前列腺等疾病有潜在的治疗作用。
背景技术：
：Kraus与Wu等[1—2]从大荨麻中鉴定出了13个木脂素类化合物(+)_新橄榄树脂素、(-)-开环异落叶松脂素、异落叶松脂素、松醋醇、3，4-二香草基四氢吠喃、新橄榄树脂素-4-0-13-D-葡萄糖苷、9_乙酰基-新橄榄树脂素、9_乙酰基-新橄榄树脂素-4-0-13-D-葡萄糖苷、9，9'-二乙酰基-新橄榄树脂素、9，9'-二乙酰基-新橄揽树脂素-4-0-13-D-葡萄糖苷、(_)-开环异落叶松脂素-9-0-13-D-葡萄糖苷、(_)-开环异落叶松脂素-4-0-13-D-葡萄糖苷、新橄榄树脂素-9-0-13-D-葡萄糖苷。其结构类型主要有新橄榄树脂素及其苷类和开环落叶松脂素、落叶松脂素及其苷类，其中新橄榄树脂素及其苷类结构如下新橄榄树脂素-9-0-13-D-葡萄糖苷9-乙酰基-新橄榄树脂素39，9—_二乙酰基_新橄榄树脂素、9-乙酰基-新橄榄树脂素-4-0-P_D_葡萄糖苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(-)-开环异落叶松脂素(_)_开环异落叶松脂素-9-0-13-D-葡萄糖苷异落叶松脂素有研究表明从大荨麻根中分离到(+)_新橄榄树脂素、(-)_开环异落叶松脂素、脱氢二松柏醇、异落叶松脂素、松脂醇和3，4_二香草基四氢呋喃，并检验了以上几种物质体外性激素结合球蛋白(SBHG)的亲和作用，结果除松脂醇外，其余化合物都有亲合力，其中3，4-二香草基四氢呋喃的亲合作用最强，浓度为250iig/ml时抑制率为95%。提示大荨麻根中木脂素类是治疗BPH(良性前列腺增生的简称，下同)的活性成分之一。本发明的课题组曾对国产的8种荨麻属植物根的不同提取物进行了抗前列腺增生的生物活性筛选，结果表明滇藏荨麻根的20%和95%乙醇提取物能显著地抑制前列腺增生大鼠的病变组织。虽然国外报道了荨麻中木脂素类具有一定抗Bra活性，但作用较弱，而裂环荨麻木脂素类结构特殊，作用与阳性药非那雄胺相当。[l]KrausR，SpitellerG.PhenoliccompoundsfromrootofUrticadioica.Phytochem，1990,29(5):1653-659.[2]Jian-linWu，NaLi，ToshiakiHasegawa，etal.BioactiveSecolignansfromP印eromiadindygulensis.J.Nat.Prod.2006，69，790-794.[3]SchottnerM，GanberD，SpitellerG.LigansfromtherootsofUrticadioicaandtheirmetabolitesbindtohumansexhormonebindingglobulia(SHBG).PlantaMedica.1997,63(6):529-532.
发明内容本发明/实用新型的目的在于提供一种本发明的目的是在前期研究的基础上，为了进一步研究提取物抗前列腺增生的活性部位和作用机理，选取前列腺组织中一个关键酶_5a-还原酶为作用靶点，采用酶联免疫(Enzyme-linkedi匪nospecificassayELISA)的方法，建立抑制5a-还原酶体夕卜模型，从大鼠前列腺组织中提取5a-还原酶，与底物睾酮以及供氢体NADra共同组成了一种微量反应体系，利用酶标仪检测双氢睾酮(DHT)的含量，以DHT的含量来判断荨麻提取物是否有抑制5a-还原酶的活性。本发明从裂叶荨麻中分离得到了荨麻裂环木脂素苷D，该成分的结构不同于上述木脂素类成分，为一种新的裂环木脂素类成分，对其抑制5a-还原酶作用研究发现具有较强活性，是一种潜在的抗前列腺增生药物成分。本发明的技术方案是一种5_a还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D，其分子结<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>上述的5-a还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D的制备方法是以裂叶荨麻为原料，制备步骤如下(1)将裂叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用6-8倍量质量浓度为95%的工业乙醇回流提取，过滤后减压浓縮；(2)将醇提取物用8-10倍量热水混悬，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取三次；(3)萃余水层采用D101大孔吸附树脂分离纯化，以乙醇_水梯度(水一30%乙醇—50%乙醇一95%乙醇)洗脱，收集洗脱液；(4)乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为氯仿甲醇=30:1、io:1、5:i、2:i的梯度洗脱，收集洗脱液，采用薄层色谱法(tlc)检测将组成相同的组分进行合并；(5)步骤(4)的洗脱液经反相硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为甲醇水=3:7的溶液洗脱，每0.5个保留体积收集成l份，收集第20-25份洗脱液，合并浓縮后得到荨麻裂环木脂素苷D。采用核磁共振(nmr)等波谱技术测定其结构，荨麻裂环木脂素苷D的波谱数据见表l:表1荨麻裂环木脂素苷D的^和13cnmr数据NO.D(CD3OD)23471'2'6'r2"3"4"6"r"2"'3〃'4"'6'"3',3〃-OCH34'，4〃-OCH33c180.748.041.772.956.568.6135.9113.0149.2146.6116.5121.8137.3113.5150.8149.5116.5121.2104.775.178.071.678.062.756.6,56.656.72.57，1H,成^7.3,3.33.65，1H11.8,7.44.35,m3.88,1H,必,8.8,6.73.80,lH,rf,m3.75,]H,必声10.4,2.83.35,1H,^/，^10.3,3.86.93，1H,4/=1.96.74,1H,《/=8.16.84，IH,浙片I,1.96.94，1H，《声2.06.90,1H,《V=8.36.99,1H，必,声8.3,2.04.11,1H'《J:7,83.16,lH，m3.21,IH,w3.31,1H，w3.31,lH,w3.87，1H,cW,/=11.5，2.33,71,1H,必，月1.9,5.33.79，3.8，both3H,s3.84,3H,s荨麻裂环木脂素苷D可以用于制备抗前列腺增生药物，将有效计量的荨麻裂环木脂素苷D与药用载体混合并制成适当剂型的药物。本发明的有益效果是目前前列腺增生药物中植物药作用弱，治疗效果差，而合成药一般副作用较强，裂环木脂素类原料为纯天然植物根，安全易得，方法简单易操作，不引入有毒物质，成本低廉，虽来源于植物但作用较强，在抗前列腺增生药物研究开发上具有非常重要的意义。以下用实施例对本发明作进一步的说明。具体实施方式实施例1裂叶荨麻药材采集自四川省阿巴州。从裂叶荨麻中制备荨麻裂环木脂苷C方法步骤如下(1)将裂叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用质量浓度为95%的工业乙醇回流提取，料液比(kg/1)=1:8，提取温度9(TC，提取时间3h，提取次数3次，合并提取液，过滤后减压浓縮至无醇味；(2)将醇提物200g用2L热水混悬，依次用2L的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取3次；(3)萃余水层萃取物30g经D101大孔树脂(lkg)分离，以乙醇-水梯度(水一30%乙醇一50%乙醇一95%乙醇)洗脱，收集洗脱液10L;(4)乙醇洗脱液浓縮至干得5g，以甲醇溶解后加入10g硅胶拌样后用硅胶柱色谱(硅胶i50g)分离纯化，采用体积比为氯仿甲醇=30:i、io:1、5:1、2:i梯度洗脱，收集每个比例洗脱液1L;(5)步骤(4)的洗脱液浓縮至干得lg，以甲醇溶解然后经反相硅胶柱色谱(反相硅胶30g)分离纯化，采用甲醇水=3:7梯度洗脱，每25ml收集成1份，合并15-20份洗脱液，浓縮后得到荨麻裂环木脂素苷D120mg。实施例2测试了实施例1制得的荨麻裂环木脂素苷D的5-a还原酶抑制作用。5-a还原酶抑制作用实验步骤如下(1)5-a还原酶的制备雄性SD大鼠3只，体重200士10g，大连医科大学实验动物中心提供，禁食不禁水过夜处死，迅速取出腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(蔗糖0.73mol，L一1，氯化钙1.91mmol*L—0在玻璃匀浆器中匀浆，在4"下以10000rpm低温高速离心20min，取上清液再以16000rpm低温高速离心30min，即得5a-还原酶提取物。采用lowry法测定蛋白含量，以酶提物中的总蛋白含量表示5a-还原酶提取物的含量，将提取物放入小离心管在-7(TC下保存，备用。(2)5a-还原酶抑制活性测定操作分两部分完成，即①将反应成分37t:恒温缓冲液、睾酮、实施例1制备的荨麻裂环木脂苷C样品、阳性对照药、NADra及酶组织液依次加入96孔板内，使之微量化，设置不同反应孔和对照孔板。反应温度为37°C(相对饱和湿度)，反应时间为60min。②采用ELISA法定量测定产物DHT，以产物的生成量大小反映酶活性的强弱。受试样品管中DHT的含量低于酶反应管中DHT含量时，则视为具有抑制5a-还原酶的活性。检测方法及计算参照睾酮试剂盒(购于AdlitteramDiagnosticLaboratories公司)使用说明进行。所有实验孔均为双复孔操作。在已经确定的反应体系基础上，辅酶NADPH浓度为lmmolL—、睾酮浓度为0.5iimol*L—、结合睾酮试剂盒微量测定的特点，将整个反应体系的总量定为200iU。酶反应体系中各组分的原始浓度分别为缓冲溶液(PBS20mmo1L-l，蔗糖0.2mo1L一1，EDTANa21,1L—、p朋.8);NADPH浓度(20,1L—0;粗酶浓度(4.3mgm1—1);睾酮浓度(20iimolL—0;非那雄胺(1.3,1L—0。测定结果见表2:表2荨麻裂环木脂素苷D抑制5a-还原酶作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从上表可以看出荨麻裂环木脂素D能显著抑制DHT的生成，作用略低于阳性药非那雄胺。权利要求一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D，是以三角叶荨麻地下部分为原料，经过醇提，醇提物热水混悬，石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，萃余水层萃取物经大孔树脂分离和洗脱，以及硅胶柱色谱分离纯化而得；其分子的结构式为F2009102199589C0000011.tif2.如权利要求l所述5-a还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D的制备方法，其特征在于，该方法是以三角叶荨麻为原料，其工艺步骤如下(1)将裂叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用6-8倍量质量浓度为95%的工业乙醇回流提取，过滤后减压浓縮；(2)将醇提取物用3-5倍量热水混悬，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取三次；(3)萃余水层采用D101大孔吸附树脂分离纯化，以乙醇_水梯度(水一30%乙醇—50%乙醇一95%乙醇)洗脱，收集洗脱液；(4)乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为氯仿甲醇=30:i、io:i、5:1、2:i的梯度洗脱，收集洗脱液，采用薄层色谱法(TLC)检测将组成相同的组分进行合并；(5)步骤(4)的洗脱液经反相硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为甲醇水=3:7的溶液洗脱，每0.5个保留体积收集成1份，其中第20-25份洗脱液采用TLC法检测为单一成分，合并浓縮后得到荨麻裂环木脂素苷D。3.如权利要求l所述5-a还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D的用途，其特征在于能显著抑制5a-还原酶作用；抑制DHT的生成，与阳性药非那雄胺相当，对前列腺疾病有潜在的医疗用途。全文摘要一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷D及其制备方法与用途。是以三角叶荨麻地下部分为原料，经过醇提，醇提物热水混悬，石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，萃余水层萃取物经大孔树脂分离和洗脱，以及硅胶柱色谱分离纯化而得。荨麻裂环木脂素苷D能显著抑制DHT的生成，与阳性药非那雄胺相当，对前列腺疾病有潜在的预防和治疗用途。对裂环木脂素类原料为纯天然植物根，安全易得，方法简单易操作，不引入有毒物质，成本低廉，虽来源于植物但作用较强，在抗前列腺增生药物研究开发上具有非常重要的意义。文档编号A61P13/00GK101717419SQ200910219958公开日2010年6月2日申请日期2009年11月16日优先权日2009年11月16日发明者冯宝民,鞠冠华申请人:大连大学