专利名称：：茶树中二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶的快速检测方法
技术领域：
：本发明涉及茶树中二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)和花青素还原酶(ANR)的检测方法。
背景技术：
：茶(0^^//^^^"^0叶片富含黄酮类、生物碱类和其他重要次生代谢物质，对人体有重要的生理保健功效，如抗过敏、抗肿瘤和抗衰老等[1]，是流行世界的大众保健饮料。二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)和花青素还原酶(ANR)是黄酮类化合物合成下游途径中的重要酶类，也是非酯型儿茶素合成的直接酶类，在茶树儿茶素途径中具有重要的调节作用。目前国内外有关二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)、花青素还原酶(ANR)酶的测定方法，多采用高效液相色谱(HPLC)检测产物积累[2'3]。但高效液相色谱(HPLC)存在以下缺点1.方法烦琐。需要对反应产物进行萃取分离、纯化和浓縮。2.成本高。由于产物形成的浓度较低，为了能达到产物的检测限，通常设计DFR/LAR和ANR的反应体系较大，是本发明设计体系的15-20倍。而目前二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)和花青素还原酶(ANR)反应体系中的底物价格昂贵，如每10毫克氯化翠雀啶需人民币8000元。3.需要昂贵的仪器和试剂，如高效液相色谱仪(HPLC)，旋转蒸发仪，乙酸乙酯、甲醇、乙腈、乙酸等，另外有机溶剂易于污染环境。4.分析的时间较长，测定一个样品需要2-3小时。也有采用灵敏度较高的放射性标记检测产物的，它也需要专门的仪器设备[4]。利用酶促反应中辅酶变化进行酶活性测定，是生物化学中的方法之一，但这种方法的采用必须排除影响辅酶测定的干扰因子。如底物、辅酶、产物的酶性和非酶性的氧化还原反应。为了排除这些干扰，可以在体系中加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(NADPH)再生系统[5]，或增加体系中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(NADPH)的浓度^，这两种措施都无法方便地检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(NADra)在340nm吸收峰的变化。
发明内容为了解决检测茶树中二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)和花青素还原酶(ANR)的酶活性方法烦琐、成本高、检测时间长的问题，本发明提供一种操作简便的茶树鲜叶中二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶和花青素还原酶的快速检测方法。实现上述目的的技术方案如下茶树中二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶的快速检测方法包括以下操作步骤(1)酶提取液制备取称2克茶树鲜叶或嫩茎或根系，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮、0.5克石英砂及10毫升预冷的pH7.0的磷酸缓冲液研磨成匀浆，在离心机速度为15000Xg、4-C条件下离心15分钟，得到上清液即为酶提取液；(2)酶提取液中蛋白质含量的测定酶蛋白含量采用市售的考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒的操作程序测定；(3)酶活性的测定二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶反应体系包括下列原料缓冲液0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液抗氧化剂20mmol/L维生素C酶提取液步骤(1)取得的酶提取液底物2mmol/L二氢槲皮素溶液或二氢杨梅素溶液辅酶20mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸具体操作取三只洁净的试管，在试管l中按顺序分别加入磷酸缓冲液1400微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升；在试管2中按顺序分别加入磷酸缓冲液1325微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升、辅酶75微升；在试管3中按顺序分别加入磷酸缓冲液1250微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升、底物75微升、辅酶75微升；将上述3只试管，摇匀后，立刻倒入0.5厘米的石英比色杯，置于45'C下反应，以1号管调零，用紫外分光光度计在15分钟内记录试管2和试管3的340nm处吸光度的变化，按下面公式计算酶活性即可，单位为AA340nm/分钟/毫克蛋白，二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶活性^AA3-AA2)/15/P式中AA3表示15分钟内试管3的340nm吸光度的下降值；AA2表示15分钟内试管2的340nm吸光度的下降值；15表示反应15分钟；P表示60微升酶提取液中的蛋白含量。茶树中花青素还原酶的快速检测方法包括以下操作步骤(1)酶提取液制备取称2克茶树鲜叶或嫩茎或根系，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮、0.5克石英砂及10毫升预冷的pH7.0的磷酸缓冲液研磨成匀浆，在离心机速度为15000Xg、4'C条件下离心15分钟，得到上清液即为酶提取液；(2)酶提取液中蛋白质含量的测定酶蛋白含量采用市售的考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒的操作程序测定；(3)酶活性的测定花青素还原酶反应体系中包括下列原料，缓冲液0.1mol/LpH6.5磷酸缓冲液抗氧化剂20mmol/L维生素C酶提取液步骤(1)取得的酶提取液底物3mmol/L氯化氢啶或氯化翠雀啶辅酶20mmol/L还原型烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸具体操作取三只洁净的试管，在试管1中按顺序分别加入磷酸缓冲液1400微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升；在试管2中按顺序分别加入磷酸缓冲液1325微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升、辅酶75微升；在试管3中按顺序分别加入磷酸缓冲液1275微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升、底物50微升、辅酶75微升；将上述3只试管，摇匀后，立刻倒入0.5厘米的石英比色杯，置于45'C下反应，以1号管调零，用紫外分光光度计在25分钟内记录试管2和试管3的340nm处吸光度的变化；按下面公式计算酶活性即可，单位为AA340nm/分钟/毫克蛋白，花青素还原酶活性=(^八3-AA2)/25/P式中AA3表示25分钟内试管3的340nm吸光度的下降值；AA2表示25分钟内试管2的340nm吸光度的下降值；25表示反应25分钟；P表示60微升酶提取液中的蛋白含量。本发明方法具有几方面的优点1.方法简单，不需要萃取浓縮；2.成本低，用分光光度法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(NADPH)的消耗来检测酶活性，总体积只需要1.5毫升；3.时间短，检测时间15-25分钟即可完成；4.不需要昂贵的仪器和药品，紫外分光光度计即可进行活性测定；5.环保安全，不需要使用有毒的有机溶剂；6.测定的准确性较高，可以对酶活性的变化进行连续检测，增加了测定的准确性。图1底物为二氢杨梅素溶液(DHM)的二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系(左:添加Vc，右不添加Vc)，图2底物为二氢杨梅素溶液(DHM)的二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系的高效液相图谱(上添加Vc，下不添加Vc)，图3二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系(不含Vc)中二氢槲皮素溶液(DHQ)的最适浓度图，图4二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系(不含Vc)中二氢杨梅素溶液(DHM)的最适浓度图，图5二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)酶活性变化的时间曲线图，图6花青素还原酶(ANR)酶活性变化的时间曲线图，图7二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)和花青素还原酶(ANR)反应体系的最适温度图，图8烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(NADra)消耗法测定的二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)，花青素还原酶(ANR)的最适pH图，图9底物氯化氢啶(CYA)不同浓度下花青素还原酶(ANR)酶活变化图，图10二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(NADPH)的最适浓度图，图11花青素还原酶(ANR)反应体系中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(騰PH)的最适浓度图，图12为酶反应体系中影响340nm吸光度变化的因子表3。具体实施例方式下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。实施例1:主要设备l.紫外可见分光光度计；2.恒温水浴锅；3.电子称；4.离心机；5.pH计。材料与试剂1.材料茶树鲜叶、嫩茎、根系等材料。在-8(TC保存备用。2.主要试剂(1)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP):用来吸附沉淀粗酶液中的多酚类物质，保持酶蛋白的较高活性。(2)石英砂增加摩擦力，提高酶蛋白的提取率。(3)0.1mol/LpH7.0的磷酸缓冲液(PBS):A溶液称取磷酸二氢钠(NaH2P04)27.8克，溶解于1000毫升的蒸馏水中，备用。B溶液称取磷酸氢二钠(Na2HP04.7H20)53.62克，溶解于1000毫升的蒸馏水中，备用o临用前，取A溶液39毫升和B溶液61毫升混合，用水稀释至200毫升。再在pH计下，用0.lmmol/L的盐酸或氢氧化钠溶液将溶液精确调节pH值到7.0，即为0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液(PBS)。(4)2mmol/L二氢杨梅素溶液(DHM):称取0.64毫克DHM，加入1毫升蒸馏水，震荡至完全溶解，4x:避光保存。(5)2mmol/L二氢槲皮素溶液(DHQ):称取0.61毫克DHQ，加入1毫升蒸馏水，震荡至完全溶解，4'C放置保存。(6)20mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(NADPH):避光下称取16.668毫克NADPH，加入1毫升蒸馏水，振荡至完全溶解，现配现用。(7)20mmol/L维生素C溶液(Vc):称取3.522毫克Vc，加入1毫升蒸馏水，振荡至完全溶解，现配现用。(8)考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒市售。操作方法1.酶提取液制备称2克茶树鲜叶或嫩茎或根系，放在研钵中，倒入液氮快速研磨成粉末状，然后加入2克PVPP、0.5克石英砂及10毫升预冷的pH7.0的PBS缓冲液研磨成匀浆，在离心机速度为15000Xg、4。C条件下离心15分钟，得到的上清液即为酶提取液。酶提取液置于0'C保存备用。2.酶提取液中酶蛋白含量测定酶蛋白含量采用市售的考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒的操作程序测定。3.酶活性的测定二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系包括下列原料缓冲液0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液抗氧化剂20mmol/L维生素C酶提取液操作方法1取得的酶提取液底物2mmol/L二氢槲皮素溶液或二氢杨梅素溶液辅酶20mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸取3支洁净烘干的试管，将上述物质按表1顺序添加，将配制好的1-3试管摇匀，倒入0.5厘米的石英比色杯，以1号管调零，于45'C下反应，在紫外分光光度计340nm处立即检测吸光度变化，每隔1分钟记录一次，共记录15分钟。按下面公式计算酶活性即可，单位为厶A340ran/分钟/毫克蛋白，二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶活性^AA3-AA2)/15/P表1:DFR/LAR反应体系加入量(微升)管体系0.lmol/L20咖ol/L酶提2mmol/L20睡1/L号PBS(pH7.0)Vc取液卿或DHM腳PH1PBS+Vc+酶液14004060002PBS+Vc+酶液+NADPH132540600753PBS+Vc+酶液+底物+NADPH125040607575式中AA3表示15分钟内3号管340nm吸光度的下降值；AA2表示15分钟内2号管340nm吸光度的下降值；15表示反应15分钟；P表示60微升酶提取液中的蛋白含9量。实施例2:主要设备同实施例l材料与试剂1.材料同实施例l2.主要试剂(1)0.1mol/LpH6.5的磷酸缓冲液(PBS):A溶液称取磷酸二氢钠(NaH2P04)27.8克，溶解于1000毫升的蒸馏水中，备用。B溶液称取磷酸氢二钠(Na2HP04.7H20)53.62克，溶解于1000亳升的蒸馏水中，备用。临用前，取A溶液68.5毫升和B溶液31.5毫升混合，用水稀释至200毫升。再在pH计下，用O.lmmol/L的盐酸或氢氧化钠溶液将溶液精确调节pH值到6.5，即为0.1mol/LpH6.5磷酸缓冲液(PBS)。(2)3mmol/L氯化氢啶(CYA)溶液称取1毫克CYA，加入1毫升甲醇振荡至完全溶解，4'C避光保存。(3)3mmol/L氯化翠雀啶(DEL)溶液称取1毫克DEL,加入1毫升甲醇振荡至完全溶解，4"C避光保存。其余的同实施例1操作方法1.酶提取液制备同实施例l2.酶提取液中酶蛋白含量测定同实施例l3.酶活性的测定花青素还原酶(ANR)反应体系中包括下列原料缓冲液0.1mol/LpH6.5磷酸缓冲液抗氧化剂20mmol/L维生素C酶提取液实施例1中操作方法1取得的酶提取液底物3mmol/L氯化氢啶或氯化翠雀啶辅酶20mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸取3支洁净烘干的试管，将上述物质按表2顺序添加，将配制好的l-3试管摇匀，倒入0.5厘米的石英比色杯，以1号管调零，于45t:下反应，在紫外分光光度计340nm处立即检测吸光度变化，每隔1分钟记录一次，共记录25分钟。按下面公式计算酶活性即可，单位为AA340nm/分钟/毫克蛋白。花青素还原酶活性=(AA3-AA2)/25/P式中AA3表示25分钟内3号管340nm吸光度的下降值；厶A2表示25分钟内2号管340nm吸光度的下降值；25表示反应25分钟；P表示60微升酶提取液中的蛋白含表2ANR反应体系加入量(微升)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>技术特点说明1.酶反应的原理二氢黄垸醇4-还原酶(DFR)、无色花青素还原酶(LAR)和花青素还原酶(ANR)均属于氧化还原性酶类，都需要还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的参与才能完成。由于在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的作用下，二氢黄垸醇4-还原酶(DFR)的产物无色花青素很快被无色花青素还原酶(LAR)作为底物催化转变成儿茶素，因此二氢黄垸醇4-还原酶(DFR)、无色花青素还原酶(LAR)通常被作为二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)—体酶而被同时检测[2'4]。酶活性大小通常可以通过酶反应体系中产物形成、底物消耗、辅酶变化来定量。在酶的作用下，辅酶和底物之间进行氧化还原反应，底物被辅酶还原形成产物，同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)被氧化形成氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液(NADPH)的特征吸收峰在340nm，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)则在此处没有吸收峰，因此340nm的吸收峰的变化反应了氧化还原酶活性的大小。由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)变化较为迅速，检测相对简单，且反应体系不需浓縮，因此利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)变化反应酶活性大小不失为一个简单可行的方法。酶反应体系的340nm吸收峰的变化是否能准确反应中二氢黄烷醇4-还原酶(DFR)、无色花青素还原酶(LAR)和花青素还原酶(ANR)的变化，其干扰因子的排除，是决定酶活性测定准确性的关键。2.酶反应体系中影响340nm吸光度变化的因子在二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)和花青素还原酶(ANR)反应体系中，除了酶反应本身以外，影响340nm变化的主要因子是酶蛋白、底物DHM和CYA,如表3中的处理1、处理3和处理5。而灭活的酶蛋白、底物DHQ和DEL与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)之间不存在反应，如表3中的处理2、处理4和处理6。酶蛋白与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作用，推测的原因可能有，一是由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为辅酶的氧化还原酶促反应属于双底物反应，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)可能先与酶结合形成中间产物，再与底物结合，并进一步形成产物；二是茶树酶提取液中，存在可以直接氧化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的酶。酶蛋白与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作用的干扰可以通过设置对照来排除，如表1和表2中的管号2。从表3看出，底物二氢杨梅素溶液(DHM)和氯化氢啶(CYA)与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)之间存在的是非酶性的氧化还原作用。为了减少底物和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)之间的相互作用，可以在体系中加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生系统[5]，或增加体系中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的浓度，这两种措施都无法方便地检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在340nm吸收峰的变化。本发明发现这种干扰作用可以采用在反应体系中最低添加0.5mmol/L维生素C而被消除，如表3中的处理7和8。图l进一步说明，不加Vc的二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系中积累了许多水溶性的红色氧化产物,高效液相色谱分析也显示添加维生素C的二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系中的产物形成大于、底物消耗小于不添加维生素C的体系(图2)。从图3和图4的结果看，在不含维生素C的二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系中的二氢杨梅素溶液(DHM)的最适浓度为1.5mmol/L，而DHQ的最适浓度为0.6mmol/L，其可能的原因是二氢杨梅素溶液(DHM)与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)发生了非酶性的氧化还原反应。3.反应测定时间图5表明，二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应速率在15分钟内呈线性变化，图5表明，花青素还原酶(ANR)反应速率在25分钟达到最高，因此二氢黄垸醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)和花青素还原酶(ANR)反应时间分别控制在15和25分钟。4.反应温度图7结果表明二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)和花青素还原酶(ANR)的最适温度均为45'C。低于或高于此温度，酶活性均有下降5.反应pH图8结果表明二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)的最适pH为7.0-7.5，花青素还原酶(ANR)-氯化氢啶(CYA)的最适pH为6.5。6.反应底物及辅酶浓度从图3，4看，二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)反应体系的底物浓度并不是最适浓度，但高底物浓度会提高体系340nm吸收的本底值，超出紫外分光光度计的检测范围，增加酶活性检测的难度，所以本试验体系的底物浓度设计为0.lranol/L。图9表明，花青素还原酶(ANR)体系中存在底物抑制现象，所以本试验体系的底物浓度也设计为0.1mmol/L。图10和图11结果表明，二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶(DFR/LAR)体系的最适还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)高于花青素还原酶(ANR)，但同样高的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)浓度会提高体系340nm吸收的本底值，超出紫外分光光度计的检测范围，增加酶活性检测的难度，所以本试验体系的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)浓度均设计为lmmol/L。参考文献宛晓春.茶叶生物化学.北京:中国农业出社,2003，9-15,107-116,132-147，319-330[2]谢德育，丽莎，杰克逊等.对在苜蓿科植物中能编码二氢黄烷醇4-还原酶的两个cDNA克隆链的分子与生物化学水平上的分析.植物生理学，2004,134:979-994(XieDY,LisaA，Jackson,et.MolecularandBiochemicalAnalysisofTwocDNAClonesEncodingDihydroflavonol-4-ReductasefromMedicagotnmcatula.Plantphysiol,2004,134:979-994[3]谢德育,萨玛，帕维亚等.由BANYULS编码的花青素还原酶在植物黄酮类物质生物合成中的作用.科学，2003,299:396-399(XieDY,SharmaSB,PaivaNL,et.Roleofanthocyanidinreductase,encodedbyBANYULSinplantflavonoidbiosynthesis.Science,2003,299:396-399[4]皮尔亚斯，埃博森格，库马尔.类黄酮物质在茶树中的合成及重要儿茶素EC和C合成酶的性质与合成途径.生化与生理学论文集，2004(431):22-30(PunyasiriPAN,AbeysingheISB，KumarV.FlavonoidbiosynthesisintheteaplantGz膨战aw'"e"s/s:propertiesofenzymesoftheprominentepicatechinandcatechinpathways.ArchivesofBiochemandBiophy,2004(431):22-30[5]斯塔福德A海伦,雷斯特H胡珀.黄垸-3-醇的合成利用道格拉斯冷杉的悬浮细胞培养物中的还原酶将二氢槲皮素和无色花青素转变成儿茶素.植物生理，1984,76，184-186(StaffordHA，LesterHH，Flavan-3-olbiosynthesis:Theconversionof(+)-dihydroquercetinandflavan-3,4-cis-diol(leucocyanidin)to(+)-catechinbyreductasesextractedfromcellsuspensionculturesofdouglasfir.PlantPhysiol,1984,76,184-186)[6]林高桥，田村等.提高二氢黄垸醇4-还原酶和NAD平衡增加转基因水稻耐细胞凋亡能力，PNAS,2005,102:7020-7025(HayashiM,TakahashiH,TamuraK,etalEnhanceddihydroflavonol-4-reductaseactivityandNADhomeostasisleadingtocelldeathtoleranceintransgenicrice.PNAS，2005,102:7020-7025)。权利要求1、茶树中二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶的快速检测方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)酶提取液制备取称2克茶树鲜叶或嫩茎或根系，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮、0.5克石英砂及10毫升预冷的pH7.0的磷酸缓冲液研磨成匀浆，在离心机速度为15000×g、4℃条件下离心15分钟，得到上清液即为酶提取液；(2)酶提取液中蛋白质含量的测定酶蛋白含量采用市售的考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒的操作程序测定；(3)酶活性的测定二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶反应体系包括下列原料缓冲液0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液抗氧化剂20mmol/L维生素C酶提取液步骤(1)取得的酶提取液底物2mmol/L二氢槲皮素溶液或二氢杨梅素溶液辅酶20mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸具体操作取三只洁净的试管，在试管1中按顺序分别加入磷酸缓冲液1400微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升；在试管2中按顺序分别加入磷酸缓冲液1325微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升、辅酶75微升；在试管3中按顺序分别加入磷酸缓冲液1250微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升、底物75微升、辅酶75微升；将上述3只试管，摇匀后，立刻倒入0.5厘米的石英比色杯，置于45℃下反应，以1号管调零，用紫外分光光度计在15分钟内记录试管2和试管3的340nm处吸光度的变化，按下面公式计算酶活性即可，单位为△A340nm/分钟/毫克蛋白，二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶活性＝(△A3-△A2)/15/P式中△A3表示15分钟内试管3的340nm吸光度的下降值；△A2表示15分钟内试管2的340nm吸光度的下降值；15表示反应15分钟；P表示60微升酶提取液中的蛋白含量。2、茶树中花青素还原酶的快速检测方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)酶提取液制备取称2克茶树鲜叶或嫩茎或根系，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮、0.5克石英砂及10毫升预冷的pH7.0的磷酸缓冲液研磨成匀浆，在离心机速度为15000Xg、4。C条件下离心15分钟，得到上清液即为酶提取液；(2)酶提取液中蛋白质含量的测定酶蛋白含量采用市售的考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒的操作程序测定；(3)酶活性的测定花青素还原酶反应体系中包括下列原料，缓冲液0.1mol/LpH6.5磷酸缓冲液抗氧化剂20mmol/L维生素C酶提取液步骤(1)取得的酶提取液底物3mmol/L氯化氢啶或氯化翠雀啶辅酶20mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸具体操作取三只洁净的试管，在试管1中按顺序分别加入磷酸缓冲液1400微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升；在试管2中按顺序分别加入磷酸缓冲液1325微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升、辅酶75微升；在试管3中按顺序分别加入磷酸缓冲液1275微升、抗氧化剂40微升、酶提取液60微升、底物50微升、辅酶75微升；将上述3只试管，摇匀后，立刻倒入0.5厘米的石英比色杯，置于45'C下反应，以1号管调零，用紫外分光光度计在25分钟内记录试管2和试管3的340nm处吸光度的变化；按下面公式计算酶活性即可，单位为AA340nm/分钟/毫克蛋白，花青素还原酶活性"AA3-AA2)/25/P式中AA3表示25分钟内试管3的340nm吸光度的下降值；厶A2表示25分钟内试管2的340nm吸光度的下降值；25表示反应25分钟；P表示60微升酶提取液中的蛋白含量。全文摘要本发明涉及茶树中二氢黄烷醇4-还原酶/无色花青素还原酶和花青素还原酶的快速检测方法，解决了公知技术中酶活性检测方法操作繁琐、成本高、检测时间长的问题。本发明方法包括酶提取液制备、酶提取液中蛋白质含量的测定和酶活性的测定三个步骤，其中利用检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(NADPH)的消耗来检测酶活性，在反应体系中加入维生素C可以降低底物DHM和CYA对酶活性检测的干扰。本发明方法简单，成本低，检测时间15-25分钟即可完成；采用紫外分光光度计即可进行活性测定；环保安全，不需要使用有毒的有机溶剂；测定的准确性较高，可以对酶活性的变化进行连续检测，增加了测定的准确性。文档编号G01N21/33GK101482500SQ200910116179公开日2009年7月15日申请日期2009年2月6日优先权日2009年2月6日发明者涛夏,张宪林,高丽萍申请人:安徽农业大学