二氢叶酸合成酶及其衍生物的应用，以及制备和检测方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种二氢叶酸合成酶在检测磺胺类药物残留中的应用，以及提供利用二氢叶酸合成酶建立磺胺类药物的快速检测方法。一种可检测磺胺类药物残留的二氢叶酸合成酶，其为SEQIDNO.1序列中所示的氨基酸序列。与传统的检测方法相比较，本发明的优点在于：(1)本发明所公开和应用的二氢叶酸合成酶，来源广泛，只要是含有二氢叶酸合成酶核心序列的蛋白片段均可以应用，可以通过基因工程的方法迅速、稳定获得。（2)利用本发明的所公开的二氢叶酸合成酶的新应用，可以建立检测含有对位氨基苯磺酰胺母核结构的所有磺胺类药物的快速检测方法。
【专利说明】二氢叶酸合成酶及其衍生物的应用，以及制备和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及了一种二氢叶酸合成酶在药物残留检测中的新应 用。
【背景技术】
[0002] 二氢叶酸合成酶（DHPS)是细菌合成二氢叶酸的必须催化酶，在细菌生长和繁殖 中具有重要作用。通常细菌生长需要利用环境中的对氨苯甲酸（PABA)和二氢喋啶、谷氨酸 在菌体内的二氢叶酸合成酶催化下合成二氢叶酸。如果环境中存在与PABA结构类似物时， 必然会对二氢叶酸合成产生抑制。
[0003] 磺胺类药物（Sulfonamides)是一大类人工合成的抗菌药，用于临床已近50年，它 具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便、生产时不耗用粮食等优点。该类药物拥有的共同结 构为对氨基苯磺酰胺（结构式见图1)，具有与对氨苯甲酸（PABA)类似的结构，可以与PABA 竞争二氢叶酸合成酶，影响了二氢叶酸的合成，因而使细菌生长和繁殖受到抑制。
[0004] 近些年来，由于用药剂量和类型变化，细菌与药物反复接触后，对药物的敏感性下 降甚至消失。细菌对磺胺类药物更易产生抗药性，尤其在用量或疗程不足时更易出现。产生 抗药性的原因，可能是细菌改变代谢途径，如产生较多二氢叶酸合成酶，或能直接利用环境 中的叶酸。由于磺胺类药物的结构特性，细菌对各类磺胺药物之间有交叉抗药性，即细菌对 某一磺胺药产生耐药后，对另一种磺胺药也无效，但与其它抗菌药或者临床药物间无交叉 抗药现象。由此可见二氢叶酸合成酶与磺胺类药物之间的结合反应属于特异性专属反应。 利用这种特异性专属反应对开发各种基于DHPS的磺胺类药物检测方法非常有益。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种二氢叶酸合成酶在检测磺胺类药物残留中的应用，以 及提供利用二氢叶酸合成酶建立磺胺类药物的快速检测方法。
[0006] 本发明所述的二氢叶酸合成酶，来源广泛，存在于诸如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 等各类微生物中，是微生物生长代谢必不可少的关键合成酶。其氨基酸序列如SEQ. ID. No. 1 所示，可以通过如SEQ. ID. No. 2所示的基因克隆表达。
[0007] 本发明中所公开的二氢叶酸合成酶，还包括含有二氢叶酸合成酶或同源性达95% 以上的酶，或者经过生物标记后的用于示踪的活性蛋白质，如利用辣根过氧化物酶（HRP)、 碱性磷酸酶（AP)、纳米金颗粒（Colloid gold)或者荧光素（FITC)等标记的二氢叶酸合成 酶蛋白。
[0008] 利用本发明中所公开的二氢叶酸合成酶及其衍生物，可以建立磺胺类药物的快速 检测试剂盒，检测方法可以是酶联免疫检测法、免疫胶体金检测法、免疫荧光检测法、化学 发光检测法、电化学检测法、生物传感器法等，检测的样本可以是食品（包括牛奶、蜂蜜、动 物组织等）、土壤和水样等。
[0009] 其具体发明技术方案如下：
[0010] 一种可检测磺胺类药物残留的二氢叶酸合成酶，其为SEQ ID NO. 1序列中所示的 氨基酸序列。
[0011] 进一步，所述的二氢叶酸合成酶是与二氢叶酸合成酶及其同源酶同源性大于80% 的蛋白片段。
[0012] 进一步，上述二氢叶酸合成酶其可用于磺胺类药物残留。
[0013] 进一步，二氢叶酸合成酶的衍生物，该衍生物为以下a?d中的任意一种：
[0014] a)将所述二氢叶酸合成酶经过辣根过氧化物酶（HRP)生物标记后的用于示踪的 活性蛋白质；
[0015] b)将所述二氢叶酸合成酶经过碱性磷酸酶（AP)生物标记后的用于示踪的活性蛋 白质；
[0016] c)将所述二氢叶酸合成酶经过胶体金标记后的用于示踪的活性蛋白质；
[0017] d)将所述二氢叶酸合成酶经过荧光素（FITC)生物标记后的用于示踪的活性蛋白 质；
[0018] 进一步，二氢叶酸合成酶的衍生物，其可用于磺胺类药物残留。
[0019] 进一步，二氢叶酸合成酶或其衍生物，其所述磺胺类药物为含有对位氨基苯磺酰 胺母核结构的化合物。
[0020] 同时，本发明还包括如下方法：
[0021] 一种的二氢叶酸合成酶的克隆、表达及纯化方法，具体步骤如下：
[0022] 1)根据Genebank公开的编号为EDV67101对应基因序列设计引物，上游引物 Pl(5' CGCGGATCC ATGAAACTCTTTGC3'）和下游引物 P2(5' AACTGCAGTTACTCATAGCGTTTG3'） 分别含有BamHl和PstI酶切位点；从大肠菌病病鸡分离的大肠杆菌中分离得到大肠杆菌 Fll培养后挑取单菌落接种于LB培养液中，培养至0D600nm在0. 4左右，取菌液50 μ 1高速 离心，其转速为l〇〇〇〇r/min，离心时间为lmin，弃去上清，加入100 μ I PBS悬浮，然后再次 离心并悬浮，重复3次后加入100 μ 1双蒸水，并离心再次以双蒸水悬浮，而后进行PCR扩增 目标基因，SDS电泳检测产物；
[0023] 2)用DNA回收试剂盒回收PCR产物，用BamHI和PstI双酶切PCR产物和载体DNA， 双酶切后产物用胶回收试剂盒回收，并用Τ4连接酶16°C连接过夜，将连接产物转化至活化 的感受态细胞E Coli DH5a中并均匀涂在Amp抗性的LB平板上，37°C培养16小时后菌落 PCR鉴定；将初步鉴定的菌落提取质粒双酶切鉴定，阳性结果进行测序，并与报道的序列进 行比对；确认后将重组质粒转化至表达菌株BL21 (DE3)中，以IPTG进行诱导表达，电泳检测 表达结果；大量表达后以镍柱纯化，纯化蛋白除盐后冻存。
[0024] 还包括一种二氢叶酸合成酶的制备，所述的标记方法为戊二醛法，具体步骤如 下：
[0025] 1)称取5mg HRP(sigma，P8375)溶解于0. 5ml蒸馈水中，并向其中加入0. 5ml新 配的0. IM NaKM溶液，混匀，4°C静置30分钟使HRP充分活化；
[0026] 2)加入0. 16M乙二醇水溶液0. 5ml，混勻，静置30分钟；
[0027] 3)将二氢叶酸合成酶用生理盐水溶解成2. 5mg/ml的溶液，取Iml逐滴加入前述 HRP溶液中；
[0028] 4)充分混匀，置于pH9. 5碳酸盐缓冲液透析4°C透析过夜；
[0029] 5)加0. 2M赖氨酸0. 25ml，混匀后，置室温2小时，然后以饱和硫酸铵沉淀蛋白后 取沉淀物溶于〇. IM PBS中；
[0030] 6)将溶解有标记物的PBS溶液装入透析袋，继续透析3h除去铵离子，然后高速离 心，其离心转速大于SOOOrpm，除去沉淀，上清液即为HRP标记号的二氢叶酸合成酶；分装后 保存于_80°C备用；
[0031] 还包括一种HRP标记二氢叶酸合成酶检测水体中的磺胺类药物的方法，具体步骤 如下：
[0032] 1)将对氨基苯磺酰胺通过重氮化法与卵清蛋白OVA偶联得到包被原SAS-OVAJf 其用以pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至1 μ g/mL浓度作为包被液，以100 μ 1每孔包被酶标板， 4°C孵育过夜；完毕后甩出液体，以PBS-T洗板，拍干加入封闭液，所述封闭液为1 %脱脂奶 粉100 μ 1，37°C孵育2小时，甩出液体后拍干备用；
[0033] 2)磺胺标准品配置浓度为 0 μ g/L，1 μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L，27 μ g/L 和 81 μ g/L ;
[0034] 测定时按照以下步骤进行：
[0035] (1)加标准品：将磺胺标准品以50 μ 1每孔加入到包被好的酶标板中，将将HRP标 记的重组二氢叶酸合成酶蛋白以ΡΗ7. 2的0. IM PBS稀释至1 μ g/mL，以50 μ 1每孔加入到 包被好的酶标板中，轻轻振荡混匀后置37°C孵育60分钟；
[0036] (2)完毕后取出酶标板，倒出其中液体，以吸水纸拍干后，加入显色底物液 100 μ L/孔，再置于37°C孵育15分钟；
[0037] (3)取出后用酶标仪于450nm处读取吸光度值，以双对数曲线绘制标准曲线。
[0038] 还包括一种利用胶体金标记二氢叶酸合成酶检测牛奶中的磺胺类药物的方法，具 体步骤如下：
[0039] 1)胶体金标记二氢叶酸合成酶
[0040] 采用朽1檬酸还原法制备得到20_40nm范围的纳米金颗粒溶液，调节pH值至8. 0 备用；取一定量的纳米金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的二氢叶酸合成酶以 PBS按照1:2000的比例稀释后加入纳米金溶液中搅拌反应20-30分钟，然后将PEG10000溶 液加入混合反应液中，使PEG的最终浓度约为1 %，置于冷冻离心机，其温度为4°C，在速度 为1500?2500rpm的转速下离心20分钟后弃去上清液；将下层沉淀用PBS反复洗涤并继 续离心弃去多余上清液；最后将沉淀物以PBS缓冲液重新悬浮，使最终的DHPS蛋白浓度约 为SOyg/ml左右，保存于4°C备用；
[0041] 2)胶体金试纸条的组装
[0042] (1)粘贴：将样品垫、纤维素膜、吸水垫和保护膜按一定顺序逐一贴在支持背板 上；样品垫与纤维素膜相接，纤维素膜与吸水垫相接，同时在样品垫和吸水垫上分别贴有保 护膜，其中样品垫的保护膜印有"MAX"标记，方便检测使用；纤维素膜上分别标记了控制线 (C线）和检测线（T线）；C线标记的是二氢叶酸合成酶特异性单克隆抗体，而T线标记的 是牛血清白蛋白标记的磺胺类药物；
[0043] (2)切条：将粘贴好的试纸条大板用切条机进行切割，每个试纸条的宽度为 0. 8cm，偏差范围为0. 78?0. 82cm，切割好的试纸条储藏在室温下备用；
[0044] (3)微孔试剂的组装：将纳米金颗粒标记的二氢叶酸合成酶用全自动化加样装置 定量加到塑料微孔后，置于冻干机冷冻干燥；冷冻干燥的微孔试剂用塑料微孔盖盖好，储藏 于4-8°C备用；
[0045] (4)试纸条和微孔试剂的组装：将制备好的试纸条和微孔试剂按照1:1的比例密 封于包装袋或者包装瓶中，密封好后存放于4-8°C备用；
[0046] 3)利用胶体金标记法检测牛奶样本
[0047] (1)将待测的牛奶样本和从冷藏环境中拿出来的试纸条放置在室温下至少 30min ；
[0048] (2)加样：将准备好的样品用一次性塑料吸管或者微量移液器吸取200 μ 1，加入 到已经去掉盖的微孔试剂中；所述的一个微孔试剂对应一个试纸条，只能检测一个样品，不 能重复使用；
[0049] (3)混合：用微量移液器或者一次性塑料吸管上下吸打微孔试剂中的液体使之充 分混匀；混匀后的微孔应呈现粉红色或者浅粉色等；
[0050] (4)插条：取出试纸条并将其的带有"MAX"标记的一端插入微孔中；
[0051] (5)计时：插条后开始计时3分钟，观察C线是否出现，如果3min内C线已经出现， 即可判读结果；如果C线没有出现，请延长2分钟使液体爬升至C线出现后判读结果；
[0052] (6)进行结果判定：阴性：C线显色，T线也显色；阳性：C线显色，T线不显色；无 效：C线不显示。
[0053] 与传统的检测方法相比较，本发明的优点在于：
[0054] (1)本发明所公开和应用的二氢叶酸合成酶，来源广泛，只要是含有二氢叶酸合成 酶核心序列的蛋白片段均可以应用，可以通过基因工程的方法迅速、稳定获得。
[0055] (2)利用本发明的所公开的二氢叶酸合成酶的新应用，可以建立检测含有对位氨 基苯磺酰胺母核结构的所有磺胺类药物的快速检测方法。
[0056] (3)所述的检测方法不局限于某一种类，只要是利用蛋白质和小分子特异性结合 作用的方法均可以建立。
[0057] (4)所述的检测方法检测样本不受限制，只要能提取净化目标药物，均可以进行检 测。
【专利附图】
【附图说明】
[0058] 图1为磺胺类药物的共同结构对氨基苯磺酰胺，其中R为取代基团，不同磺胺类药 物，R基因不同；
[0059] 图2为对氨苯甲酸的结构，其与图1中的对氨基苯磺酰胺具有类似结构；
[0060] 图3为HRP标记的二氢叶酸合成酶检测磺胺类药物含量的标准曲线示意图，其中 X轴为浓度对数，Y轴为Logit值。
[0061] 图4 :胶体金标记的二氢叶酸合成酶检测牛奶中的磺胺类药物结果判定示意图。
【具体实施方式】
[0062] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0063] 实施例1 :二氢叶酸合成酶的克隆、表达及纯化
[0064] 根据Genebank公开的编号为EDV67101对应基因序列设计引物，上游引物 Pl(5' CGCGGATCC ATGAAACTCTTTGC3'）和下游引物 P2(5' AACTGCAGTTACTCATAGCGTTTG3'） 分别含有BamHl和PstI酶切位点。从大肠菌病病鸡分离的大肠杆菌中分离得到大肠杆菌 Fll培养后挑取单菌落接种于LB培养液中，培养至0D600nm在0. 4左右，取菌液50 μ 1高速 离心（转速l〇〇〇〇r/min，Imin)，弃去上清，加入100 μ I PBS悬浮，然后再次离心并悬浮，重 复3次后加入100 μ 1双蒸水，并离心再次以双蒸水悬浮，而后进行PCR扩增目标基因，SDS 电泳检测产物。
[0065] 用DNA回收试剂盒回收PCR产物，用BamHI和PstI双酶切PCR产物和载体DNA， 用DNA回收试剂盒回收双酶切产物，并用Τ4连接酶16°C连接过夜，将连接产物转化至活化 的感受态细胞E Coli DH5a中并均匀涂在Amp抗性的LB平板上，37°C培养16小时后菌落 PCR鉴定。将初步鉴定的菌落提取质粒双酶切鉴定，阳性结果进行测序，并与报道的序列进 行比对。确认后将重组质粒转化至表达菌株BL21(DE3)中，以IPTG进行诱导表达，电泳检 测表达结果。大量表达后以镍柱纯化，纯化蛋白除盐后冻存。
[0066] 2) HRP标记二氢叶酸合成酶的制备
[0067] 将纯化好的二氢叶酸合成酶用辣根过氧化物酶（HRP)标记。标记方法采用戊二醛 法，具体如下：
[0068] (1)称取5mgHRP(sigma，P8375)溶解于0· 5ml蒸馈水中，并向其中加入0· 5ml新 配的0. IM NaKM溶液，混匀，4°C静置30分钟使HRP充分活化；
[0069] (2)加入0· 16M乙二醇水溶液0· 5ml，混勻，静置30分钟；
[0070] (3)将二氢叶酸合成酶用生理盐水溶解成2. 5mg/ml的溶液（此浓度可以适当调整 以获得较高的标记率），取Iml逐滴加入前述HRP溶液中；
[0071] (4)充分混匀，置于ρΗ9· 5碳酸盐缓冲液透析4°C透析过夜；
[0072] (5)加0· 2M赖氣酸0· 25ml，混勾后，直室温2小时，然后以饱和硫酸按沉淀蛋白后 取沉淀物溶于〇. IM PBS中；
[0073] (6)将溶解有标记物的PBS溶液装入透析袋，继续透析3h除去铵离子，然后高速离 心（转速大于SOOOrpm)，除去沉淀，上清液即为HRP标记号的二氢叶酸合成酶。分装后保存 于-80°C备用。
[0074] 实施例3 :利用HRP标记二氢叶酸合成酶检测水体中的磺胺类药物
[0075] 将对氨基苯磺酰胺（V900101，sigma)通过重氮化法与卵清蛋白OVA偶联得到包被 原SAS-0VA，将其用以pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至1 μ g/mL浓度作为包被液，以100 μ 1每孔 包被酶标板，4°C孵育过夜。完毕后甩出液体，以PBS-T洗板，拍干加入封闭液（1%脱脂奶 粉）100μ 1，37°C孵育2小时，甩出液体后拍干备用。
[0076] 磺胺标准品配置浓度为 0 μ g/L，1 μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L，27 μ g/L 和 81 μ g/L。
[0077] 测定时按照以下步骤进行：
[0078] (1)加标准品：将磺胺标准品以50 μ 1每孔加入到包被好的酶标板中，将将HRP标 记的重组二氢叶酸合成酶蛋白以ΡΗ7. 2的0. IM PBS稀释至1 μ g/mL，以50 μ 1每孔加入到 包被好的酶标板中，轻轻振荡混匀后置37°C孵育60分钟；
[0079] (2)完毕后取出酶标板，倒出其中液体，以吸水纸拍干后，加入显色底物液 100 μ L/孔，再置于37°C孵育15分钟；
[0080] (3)取出后用酶标仪于450nm处读取吸光度值，以双对数曲线绘制标准曲线。
[0081] 标准曲线如图3所示，其中X轴为标准品浓度对数，Y轴为吸光度值，从曲线计算 可知，磺胺类药物的50%抑制浓度为4. 1 μ g/L。由于我国目前磺胺类药物的残留限量规定 为100 μ g/L,因此完全满足检测需要。
[0082] 实施例4 :利用胶体金标记二氢叶酸合成酶检测牛奶中的磺胺类药物
[0083] 1、胶体金标记二氢叶酸合成酶
[0084] 采用朽1檬酸还原法制备得到20_40nm范围的纳米金颗粒溶液，调节pH值至8. 0备 用。取一定量的纳米金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的二氢叶酸合成酶以 PBS按照1:2000的比例稀释后加入纳米金溶液中搅拌反应20-30分钟，然后将PEG10000溶 液加入混合反应液中，使PEG的最终浓度约为1 %，置于冷冻离心机（4°C )上慢速（速度为 1500?2500rpm)离心20分钟后弃去上清液。将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去 多余上清液。最后将沉淀物以PBS缓冲液重新悬浮，使最终的DHPS蛋白浓度约为50 μ g/ml 左右，保存于4°C备用。
[0085] 2、胶体金试纸条的组装
[0086] (1)粘贴：将样品垫、纤维素膜、吸水垫和保护膜按一定顺序逐一贴在支持背板 上。样品垫与纤维素膜相接，纤维素膜与吸水垫相接，同时在样品垫和吸水垫上分别贴有保 护膜，其中样品垫的保护膜印有"MAX"标记，方便检测使用。纤维素膜上分别标记了控制线 (C线）和检测线（T线）。C线标记的是二氢叶酸合成酶特异性单克隆抗体，而T线标记的 是牛血清白蛋白标记的磺胺类药物。
[0087] (2)切条：将粘贴好的试纸条大板用切条机进行切割，每个试纸条的宽度为 0. 8cm，偏差范围为0. 78?0. 82cm，切割好的试纸条储藏在室温下备用。
[0088] (3)微孔试剂的组装：将纳米金颗粒标记的二氢叶酸合成酶用全自动化加样装置 定量加到塑料微孔后，置于冻干机冷冻干燥。冷冻干燥的微孔试剂用塑料微孔盖盖好，储藏 于4-8°C备用。
[0089] (4)试纸条和微孔试剂的组装：将制备好的试纸条和微孔试剂按照1:1的比例密 封于包装袋或者包装瓶中，密封好后存放于4-8°C备用。
[0090] 3、利用胶体金标记法检测牛奶样本
[0091] (1)将待测的牛奶样本和从冷藏环境中拿出来的试纸条放置在室温下至少 30min〇
[0092] (2)加样：将准备好的样品用一次性塑料吸管或者微量移液器吸取200 μ 1，加入 到已经去掉盖的微孔试剂中。注意：一个微孔试剂对应一个试纸条，只能检测一个样品，不 能重复使用。
[0093] (3)混合：用微量移液器或者一次性塑料吸管上下吸打微孔试剂中的液体使之充 分混匀。混匀后的微孔应呈现粉红色或者浅粉色等。
[0094] (4)插条：取出试纸条并将其的带有"MAX"标记的一端插入微孔中。请不要用手 指或者其他物体触碰试纸条的中段，即含有检测限和控制线的纤维素膜段。
[0095] (5)计时：插条后开始计时3分钟，观察C线是否出现，如果3min内C线已经出现， 即可判读结果；如果C线没有出现，请延长2分钟使液体爬升至C线出现后判读结果。
[0096] (6)结果判定（图4):
[0097] 阴性：C线显色，T线也显色；
[0098] 阳性：C线显色，T线不显色；
[0099] 无效：C线不显示。
[0100] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，本发明涉及的材 料均为已知材料，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种可检测磺胺类药物残留的二氢叶酸合成酶，其为SEQ ID NO. 1序列中所示的氨 基酸序列。
2. 如权利要求1所述的二氢叶酸合成酶，是与二氢叶酸合成酶及其同源酶同源性大于 80 %的蛋白片段。
3. 如权利要求2所述的二氢叶酸合成酶，其可用于磺胺类药物残留。
4. 一种如权利要求1所述二氢叶酸合成酶的衍生物，该衍生物为以下a?d中的任意 一种： a) 将所述二氢叶酸合成酶经过辣根过氧化物酶（HRP)生物标记后的用于示踪的活性 蛋白质； b) 将所述二氢叶酸合成酶经过碱性磷酸酶（AP)生物标记后的用于示踪的活性蛋白 质； c) 将所述二氢叶酸合成酶经过胶体金标记后的用于示踪的活性蛋白质； d) 将所述二氢叶酸合成酶经过荧光素（FITC)生物标记后的用于示踪的活性蛋白质。
5. 如权利要求4所述的二氢叶酸合成酶的衍生物，其可用于磺胺类药物残留。
6. 根据权利要求1、3或5所述的二氢叶酸合成酶或其衍生物，其所述磺胺类药物为含 有对位氨基苯磺酰胺母核结构的化合物。
7. -种如权利要求1所述的二氢叶酸合成酶的克隆、表达及纯化方法，具体步骤如下： 1) 根据Genebank公开的编号为EDV67101对应基因序列设计引物，上游引物 Pl(5' CGCGGATCC ATGAAACTCTTTGC3'）和下游引物 P2(5' AACTGCAGTTACTCATAGCGTTTG3'） 分别含有BamHl和PstI酶切位点；从大肠菌病病鸡分离的大肠杆菌中分离得到大肠杆菌 Fl 1培养后挑取单菌落接种于LB培养液中，培养至0D600nm在0. 4左右，取菌液50 μ 1高速 离心，其转速为l〇〇〇〇r/min，离心时间为lmin，弃去上清，加入100 μ I PBS悬浮，然后再次 离心并悬浮，重复3次后加入100 μ 1双蒸水，并离心再次以双蒸水悬浮，而后进行PCR扩 增目标基因，SDS电泳检测产物； 2) 用DNA回收试剂盒回收PCR产物，用BamHI和PstI双酶切PCR产物和载体DNA，用 DNA回收试剂盒回收双酶切产物，并用Τ4连接酶16°C连接过夜，将连接产物转化至活化的 感受态细胞E Coli DH5a中并均匀涂在Amp抗性的LB平板上，37°C培养16小时后菌落 PCR鉴定；将初步鉴定的菌落提取质粒双酶切鉴定，阳性结果进行测序，并与报道的序列进 行比对；确认后将重组质粒转化至表达菌株BL21 (DE3)中，以IPTG进行诱导表达，电泳检测 表达结果；大量表达后以镍柱纯化，纯化蛋白除盐后冻存。
8. -种如权利要求4所述的HRP标记二氢叶酸合成酶的制备，所述的标记方法为戊二 醛法，具体步骤如下： 1) 称取5mgHRP(sigma，P8375)溶解于0. 5ml蒸馏水中，并向其中加入0. 5ml新配的 0. IM NaKM溶液，混匀，4°C静置30分钟使HRP充分活化； 2) 加入0. 16M乙二醇水溶液0. 5ml，混匀，静置30分钟； 3) 将二氢叶酸合成酶用生理盐水溶解成2. 5mg/ml的溶液，取Iml逐滴加入前述HRP溶 液中； 4) 充分混匀，置于pH9. 5碳酸盐缓冲液透析4°C透析过夜； 5) 加0. 2M赖氨酸0. 25ml,混匀后,置室温2小时,然后以饱和硫酸铵沉淀蛋白后取沉 淀物溶于0. IM PBS中； 6)将溶解有标记物的PBS溶液装入透析袋，继续透析3h除去铵离子，然后高速离心，其 离心转速大于SOOOrpm，除去沉淀，上清液即为HRP标记号的二氢叶酸合成酶；分装后保存 于-80°C备用。
9. 一种根据权利要求8所述的HRP标记二氢叶酸合成酶检测水体中的磺胺类药物的方 法，具体步骤如下： 1) 将对氨基苯磺酰胺通过重氮化法与卵清蛋白OVA偶联得到包被原SAS-OVA，将其用 以PH9. 6碳酸盐缓冲液稀释至1 μ g/mL浓度作为包被液，以100 μ 1每孔包被酶标板，4°C 孵育过夜；完毕后甩出液体，以PBS-T洗板，拍干加入封闭液，所述封闭液为1 %脱脂奶粉 100 μ 1，37°C孵育2小时，甩出液体后拍干备用； 2) 磺胺标准品配置浓度为0 μ g/L，1 μ g/L，3 μ g/L，9 μ g/L，27 μ g/L和81 μ g/L ;测定 时按照以下步骤进行： (1) 加标准品：将磺胺标准品以50 μ 1每孔加入到包被好的酶标板中，将将HRP标记的 重组二氢叶酸合成酶蛋白以ΡΗ7. 2的0. IM PBS稀释至1 μ g/mL，以50 μ 1每孔加入到包被 好的酶标板中，轻轻振荡混匀后置37°C孵育60分钟； (2) 完毕后取出酶标板，倒出其中液体，以吸水纸拍干后，加入显色底物液100 μ L/孔， 再置于37°C孵育15分钟； (3) 取出后用酶标仪于450nm处读取吸光度值，以双对数曲线绘制标准曲线。
10. 根据权利要求4所述的一种检测牛奶中的磺胺类药物的方法，具体步骤如下： 1) 胶体金标记二氢叶酸合成，其特征在于所用示踪物为胶体金标记的重组二氢叶酸 合成酶酶 采用柠檬酸还原法制备得到20-40nm范围的纳米金颗粒溶液，调节pH值至8. 0备用； 取一定量的纳米金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的二氢叶酸合成酶以PBS 按照1:2000的比例稀释后加入纳米金溶液中搅拌反应20-30分钟，然后将PEG10000溶液 加入混合反应液中，使PEG的最终浓度约为1 %，置于冷冻离心机，其温度为4°C，在速度为 1500?2500rpm的转速下离心20分钟后弃去上清液；将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续 离心弃去多余上清液；最后将沉淀物以PBS缓冲液重新悬浮，使最终的DHPS蛋白浓度约为 5(^ 8/1111左右，保存于41：备用； 2) 胶体金试纸条的组装 (1) 粘贴：将样品垫、纤维素膜、吸水垫和保护膜按一定顺序逐一贴在支持背板上；样 品垫与纤维素膜相接，纤维素膜与吸水垫相接，同时在样品垫和吸水垫上分别贴有保护膜， 其中样品垫的保护膜印有"MAX"标记，方便检测使用；纤维素膜上分别标记了控制线（C线） 和检测线（T线）；C线标记的是二氢叶酸合成酶特异性单克隆抗体，而T线标记的是牛血清 白蛋白标记的磺胺类药物； (2) 切条：将粘贴好的试纸条大板用切条机进行切割，每个试纸条的宽度为0. 8cm，偏 差范围为0. 78?0. 82cm，切割好的试纸条储藏在室温下备用； (3) 微孔试剂的组装：将纳米金颗粒标记的二氢叶酸合成酶用全自动化加样装置定量 加到塑料微孔后，置于冻干机冷冻干燥；冷冻干燥的微孔试剂用塑料微孔盖盖好，储藏于 4-8 °C备用； (4)试纸条和微孔试剂的组装：将制备好的试纸条和微孔试剂按照1:1的比例密封于 包装袋或者包装瓶中，密封好后存放于4-8°C备用； 3)利用胶体金标记法检测牛奶样本 (1) 将待测的牛奶样本和从冷藏环境中拿出来的试纸条放置在室温下至少30min ; (2) 加样：将准备好的样品用一次性塑料吸管或者微量移液器吸取200 μ 1，加入到已 经去掉盖的微孔试剂中；所述的一个微孔试剂对应一个试纸条，只能检测一个样品，不能重 复使用； (3) 混合：用微量移液器或者一次性塑料吸管上下吸打微孔试剂中的液体使之充分混 匀；混匀后的微孔应呈现粉红色或者浅粉色等； (4) 插条：取出试纸条并将其的带有"MAX"标记的一端插入微孔中； (5) 计时：插条后开始计时3分钟，观察C线是否出现，如果3min内C线已经出现，即 可判读结果；如果C线没有出现，请延长2分钟使液体爬升至C线出现后判读结果； (6) 进行结果判定：阴性：C线显色，T线也显色；阳性：C线显色，T线不显色；无效：C 线不显示。
【文档编号】G01N33/532GK104212773SQ201410447196
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】杨春江, 刘勇, 朱文壮, 孟赓, 秦堃, 莫勋, 马孝斌 申请人:北京纳百景弈生物科技有限公司