专利名称：Cntf(睫状神经营养因子)受体激活物在治疗肥胖症上的用途的制作方法
CNTF(睫状神经营养因子)受体激活物在治疗肥胖症上的
用途 本申请是专利号为97180757. 4、发明名称为"CNTF(睫状神经营养因子)受体激活 物在治疗肥胖症上的用途"、申请日为1997年11月18日的专利申请的分案申请。
本发明的主题是激活CNTF(睫状神经营养因子)受体的分子_例如hCNTF(人 CNTF)或hCNTF的突变体_作为有效成分在制备适于治疗肥胖症和与其相关的疾病之药物 组合物上的用途。术语hCNTF突变体意指理论上可以从hCNTF经一个或多个氨基酸取代衍 生的氨基酸序列。 在工业国家中影响成年人口 30%的肥胖症，是一个主要的公共卫生问题，因为它 与II型糖尿病、高血压、血脂过多和增加的死亡率有关。肥胖症是阳性能量平衡的结果，即 热量摄入与能量消耗提高的比例的结果。由于在故意的和非故意的改变后恢复脂肪群的机 制的操作，治疗一般是不成功的(1)。脂郁积(lipostasis)理论提出体脂肪贮存的多少由 反馈环调节，所说的反馈环由脂细胞来源的循环分子构成，这些分子作用于下丘脑降低食 欲并增加能量消耗(2)。 最近鉴定的16-千道尔顿血浆蛋白质l印tin满足许多从这样的脂郁积激素预期 的标准(3)。在啮齿类和人类中，它在脂肪组织中表达，并且其血浆水平与体重指数密切相 关(4)。在肥胖(ob/ob)突变小鼠中缺乏l印tin导致体脂肪大量增加，这可以由全身施用 重组蛋白质逆转(5，6，7)。然而，人肥胖症似乎不是由于l印tin缺损的表达，因为相对于瘦 人而言，在胖人中显示增加的l印tin信使核糖核酸和血浆蛋白质水平(4)。这样，胖人可 能对l印tin的脂郁积作用不灵敏，有可能是因为在l印tin转运水平，l印tin受体活性，或 后_受体性信号机制上有缺陷(8)。 这样，在这一特殊领域中需要一些在对l印tin具有抵抗力的人群中能够治疗肥 胖症的新药剂。 L印tin抗性是糖尿病(db/db)小鼠突变体的特征，该突变体表达缺乏大多数胞质 内结构域的l印tin受体的截短的形式(9)。更密切类似人肥胖症的动物模型是由饲喂高脂 肪食物产生的小鼠(DI0小鼠)的模型。类似于人肥胖症患者，DIO小鼠具有提高的l印tin 的血浆水平(4)，说明它们对激素的体重减轻作用比较不灵敏。 本发明提供了生物活性的抗肥胖剂，其可以逆转肥胖，以及与此相联系的血糖过 多和血胰岛素增多。 因此，本发明的主题是激活CNTF受体的物质在制备适于治疗肥胖症和与其相关 的疾病之药物上的用途。这些物质可以是hCNTF(人睫状神经营养因子；SEQ ID N0:1)自身 或者其突变体(参见例如SEQ IDN0:2-28)。采用hCNTF突变体(Serl66Asp/Glnl67His)， 已经获得了良好的结果，该突变体在159位到178位，具有下列氨基酸序列(如所附序列 表中SEQID N0:5所示)丄eu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser IleHis Asp Leu Arg Phe [为简便起见，这一 hCNTF突变体在下文也将称为DH-CNTF]。为 简便起见，在所附序列表中，仅标明了突变体SEQID NO :2-22的159-位到178位的部分。
本发明的另一个主题是编码hCNTF或其突变体的DNA在制备用于治疗肥胖症和与其相关的疾病的组合物上的用途。 本发明也具有作为其主题的用于治疗肥胖症和减轻体重的药物，该药物含有作为至少一种有效成分的hCNTF或其突变体，并且含有药学上可接受的载体。药学上可接受的载体指对患者不危险，不降解或不使有效成分失活或者不干扰有效成分的作用的载体。优选的载体是生理盐溶液，但是也可以施用其它药学上可接受的载体，并且易于由本领域技术人员所确定。在已显示出好的结果的实施方案中，hCNTF或其突变体可以用于与l印tin组合在这种情况下，野生型或突变型CNTF/l印tin的比率可以在1 : 500-1 : 5，优选地
在i : ioo-i : 25的范围内选择。 hCNTF或hCNTF变体可以以约1_10， 000 y g/kg体重范围内的剂量施用给需要治疗的患者。优选的剂量在10和1000 ii g/kg体重之间。成年人典型的日剂量在1和100mg之间。按照本发明的有效成分的必需量可以以每日一次用药或全天多次用药来施用。治疗方案可以需要延长期的施用。所施用的剂量大小须由医生确定，并且取决于一些因素，如疾病的性质与特性，患者的年龄和健康状况，患者对药物自身的耐受性。 在特定的实施方案中，为了获得快速体重的显著的降低(5-10% )(使用适当的膳食和/或体育锻炼可以持续保持这种状态)，可以借助短期(1-2周)每日施用hCNTF或其突变体来治疗肥胖患者。 活性蛋白质分子可以配制来供肠胃外，鼻，支气管或眼施用。按照本发明的药物组合物优选地是借助注射肠胃外施用。在优选的实施方案中，肠胃外施用是皮下或肌内施用。其它施用的有效方法是施用静脉内注射剂，缓释肠胃外制剂，吸入雾剂，或栓剂。在缓释制剂中，主要溶剂可以是含水或非水类型的。此外，载体可以含有保持或改变制剂的pH值，粘度，澄清度，颜色，无菌性，稳定性，分解速度或气味的其它药理学上可接受的赋形剂。同样，载体也可以含有改变或保持有效成分的稳定性，分解速度，释放，或吸收的其它药理学上可接受的赋形剂。这些赋形剂是通常用来配制供肠胃外施用的药剂(单剂形式和多剂形式)的物质。 如上所提及的，按照本发明的制剂的优选的肠胃外施用形式是皮下或肌内。最优选的肠胃外施用形式是皮下。为了获得有效成分的所需日剂量，采取单次或重复皮下或肌内注射是可能的。在本发明的一个优选的实施方案中，有效成分的剂量在10和1000 ii g/kg/天之间。为了治疗肥胖症，周期性地施用有效成分可能是合乎需要的。周期性地施用可以采取每月，每一两周，每周，每日或每小时施用一次的形式。施用所需的频率对基于标准的观测技术治疗患者的医生而言是显而易见的。 考虑按照本发明的药物制剂的口服也是可能的。在这种情况下，所施用的有效成分优选地是胶囊化的。可以胶囊化的有效成分可以用或不用通常用于制备固体药剂的载体配制。优选地，当生物利用度被最大化，同时前_系统降解被最小化时，胶囊以使得制剂的活性部分在胃肠道中释放的方式制备。所说的制剂也可以包含以有利于有效成分的吸收为目的的其它赋形剂。使用稀释剂，调味剂，低熔点蜡，植物油，润滑剂，悬浮剂，胶囊分解剂和结合剂也是可能的。 特定的剂量按照患者的近似体重计算，而不依赖于施用方法。确定适当的治疗剂量所需的计算的其它工作由本领域普通技术人员按常规进行，他们可以获得这些结果而不需要过度的实验，尤其是在本文所提供的试验和用药信息的教导下。
按照本发明，对肥胖患者施用治疗有效量的有效成分。如上所提及的，所需的剂量可以由本领域技术人员确定而无须过度的实验。 〃 治疗有效量〃 可以被定义为足以引起足够的体重减轻并且导致代谢参数(如肥胖患者的血液葡萄糖水平)后续正常化的有效成分的量。 到现在为止，已经给出了本发明的一般性描述。借助于下列实施例，参照特定的实施方案，以下给出更详细的说明，目的是为了更好地理解本发明的目的，特征，优点和操作方法。然而，无意于将本发明的范围限定在此范围内。
附图描述 图lhCNTF和l印tin在遗传性肥胖小鼠(ob/ob和db/db)和患饮食诱导的肥胖症(DIO)的小鼠中对体重(左边组)和食物摄取(右边组)的抗肥胖效果。在第0天开始，小鼠每日接受腹膜内注射的载体或蛋白质(数量以Pg/只小鼠表示)。体重以在-2天的原始体重的百分数表示，并表示为平均值± s. e. m(对ob/ob和db/db n = 3，对DI0小鼠n=5)。每一组载体处理的动物的基线重量(克)为ob/ob，49.3士0.3 ;db/db，39. 1±2.5 ;DIO， 42. 6±0. 8。由重复测量AN0VA确定统计学显著性。对于所有组，处理的作用，时间以及时间X处理的P-值分别是P < 0. 05， P < 0. 0001和P < 0. 01。 图2在DI0小鼠中，单独施用或组合施用hCNTF(2ii g/只小鼠)和l印tin (100 y g/
只小鼠)对体重减轻的作用。小鼠每日接受腹膜内注射的所示的药剂。 图3在肥胖对瘦小小鼠中，DH-CNTF对体重和食物摄取的作用的持续时间。以5
只一组圈养的C57BL/KS db/db小鼠(圆圈)或年龄和性别搭配的C57BL/KS+/+小鼠(方
块)，接受每日腹膜内注射载体(空心符号)或10yg DH-CNTF(实心符号)，共25天。从
第26天起，所有小鼠用载体处理。食物摄取是每组所消耗的克数除以5。 图4DH-CNTF处理肥胖小鼠对尸体组成的影响。小鼠每日腹膜内注射载体或10 y g
DH-CNTF处理10天。结果为平均值±s. e. m. (n = 5) 。 *P < 0. 05 ;**P < 0. 01 (对载体，
由t-检验)。 图51印tin和hCNTF在神经元细胞系中对STAT因子活化的影响。人OB-Rb的表达载体转染的GT-l-7和SN-56细胞在存在或不存在指示细胞因子(100ng/ml)下培养10分钟。细胞STAT因子的活化由电迁移率变换测定法测定。箭头指结合的STAT3同二聚体，STAT1:STAT3杂二聚物，以及STATI同二聚体迁移的位置。 图6由原位杂交测定的l印tin(0B-Rb)和CNTF(CNTF受体-([CNTFRa和LIFR)的受体亚单位在小鼠下丘脑中的表达。A，弓状核；P，副室核。(X100) 图71印tin和hCNTF在小鼠下丘脑中对tis-ll表达的影响。接受腹膜内注射载体，l印tin(100 ii g)或DH-hCNTF(10 y g)的三只ob/ob小鼠组在1小时后经颈部脱位宰杀。采用对鼠tis-ll特异性的35S-标记的cRNA探针，在载体或蛋白质处理的小鼠的冰冻冠脑切片上完成原位杂交。 实施例lhCNTF和其突变体DH-CNTF的抗肥胖作用
方法 蛋白质产生。如以前的描述(11)在大肠杆菌BL21中产生重组人类CNTF和DH-CNTF。按照Stemmer等的方法(12)利用合成寡脱氧核糖核酸经PCR装配人l印tin的DNA编码序列，并且亚克隆进细菌表达质粒pRSET-5d(13)。利用与hCNTF相同的方案产生人l印tin。为了除去细菌酯多糖，经反相HPLC(ll)纯化所有的蛋白质。当用鲎属阿米巴样细胞测定(西格玛)时，纯化的制剂含有不到5毫微克内毒素/mg蛋白质。
动物研究。采用雄性10-11周龄C57BL/6J ob/ob和C57BL/KSdb/db小鼠，以及19周龄AKR/J小鼠进行实验，所说AKR/J小鼠通过从12周开始进食高脂肪食物(14)表现出肥胖。除了以其它方式注明的外，在12小时光照-黑暗循环(7:30时开始光照，19:30时停止)下，将动物在单个笼子中圈养，随时可得到水和标准的或高脂肪的(AKR小鼠)啮齿动物食物。在开始用载体或细胞因子治疗(0天)之前，对它们习惯性地每日(9:00)腹膜内注射载体(0. 9%盐水，0. 2mg/ml无内毒素牛血清清蛋白)两天。注射后称量动物，通过记录在食物盘子中余下的食物的量确定食物摄取量。
结果 人睫神经营养因子(hCNTF)，其突变体DH-CNTF (10) [ (Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF];对CNTF a -受体具有40-倍高的亲和性的hCNTF的突变体)和人l印tin在遗传性肥胖小鼠以及饮食诱导的肥胖症的小鼠(DIO)中试验生物学活性。这些肥胖症和糖尿病模型在本领域一般被接受为肥胖病态的指示。在这些模型中显示抗肥胖作用的药剂在其它哺乳动物(特别是人)中将显示类似的作用。 如在以下将更清楚地看到的，本发明的化合物在以上所论及的所有生物学试验中是活性的，并且也发现它们是抗肥胖剂。此外，它们在逆转与肥胖症相联系的血糖过多与血胰岛素增多中是活性的。因此认为这些化合物在人糖尿病的血糖过多的治疗中也将有用。
依据以前的实验和结果(6-8， 15)，发现对不表达功能性l印tin的突变ob/ob小鼠全身性施用l印tin逆转与l印tin缺损有关的肥胖以及饮食过多。对ob/ob小鼠每日腹膜内施用hCNTF(在2和50 ii g/只小鼠之间；相对于40-1000 y g/kg体重)也产生体重的逐步和剂量依赖性降低，并且产生食物摄取的迅速降低(图l)。在实验的最高剂量(50 ii g ;1000 ii g/kg)时，hCNTF在7天之后引起体重降低16% (与载体处理的对照中5%增加相比)，并引起食物摄取的5-倍降低。这些作用在大小上与100 yg(2000 yg/kg)剂量的l印tin的作用是可比较的(在体重和食物摄取上分别为13%和95%降低；t-检验P< 0. 0001)。在剂量低于hCNTF的约5倍时，hCNTF变体DH-CNTF在体重和食物摄取上产生类似的降低。这一结果与具有降低的受体相互作用(数据未显示出)的hCNTF变体的活性缺乏(11) 一起表明，hCNTF的抗肥胖作用是由特异性CNTF受体的活化介导的。
db/db突变小鼠对l印tin不产生反应(6-8， 15)，这是因为编码l印tin受体0B-R的基因的突变，其导致产生具有截短的胞质内结构域的受体剪接变体(9，29)。相反以hCNTF治疗db/db小鼠引起剂量和时间依赖性重量丧失和食物摄取抑制(
图1)。超激动剂DH-CNTF在约hCNTF 1/5剂量时，引发可比较的作用。在ob/ob和db/db小鼠中获得的结果显示不是通过剌激l印tin释放或通过直接激活l印tin受体起作用。 经进食高脂肪食物患有肥胖症的AKR小鼠(DI0小鼠)以前已报道对l印tin的重量和食欲降低作用不如ob/ob小鼠敏感(7)。这一发现以及在DI0小鼠中的l印tin血浆水平高于瘦弱小鼠中的观察结果，导致提出这样一种观点食物诱导的肥胖与l印tin抗性相关(4， 17)。如图1所示，用人l印tin (100 ii g， 2500 ii g/kg)处理DI0小鼠5天引起体重(7±l%;p <0.05，对载体)和食物摄取(27±2%;p < 0.05)中等程度的降低。相反，hCNTF(50ii g， 1250ii g/kg)和DH-CNTF(10 ii g， 250 ii g/kg)引起体重(分别为19±1%和24±1% ;p < 0. 0001)和食物摄取(分别为76±4% ;和73±7% ;p < 0. 0005)上更强烈的降低。在db/db和DIO小鼠两者中hCNTF可以逆转肥胖的发现对治疗人肥胖症具有重要意义，这种肥胖症已被认为与l印tin的抗性相关(4， 18， 19)。 可以看到，肥胖小鼠每日接受腹膜内施用hCNTF或突变DH-CNTF，剂量从2到50 ii g，相当于50到1000 ii g/kg体重。在最高剂量时，在治疗5天后，化合物引起体重10%以上的降低。因此，为诱导体重快速降低(5-10% )对患有肥胖症的患者施用在1000 g/kg以下的hCNTF或DH-CNTF，优选的剂量是约100 y g/kg。此外，在优选的实施方案的这一形式中，每天施用hCNTF或DH-CNTF —次，连续处理几天，直到获得所需的体重减轻。
实施例2在DIO小鼠中l印tin与hCNTF协作增加抗肥胖作用
对肥胖DIO小鼠每日腹膜内注射l印tin(100 iig;相当于2500 ii g/kg)以及小剂量的(2y g相当于50iig/kg)的hCNTF。两种药剂本身均不产生明显的体重减轻。这一处理具有产生强的，协同的体重减轻的作用(图2)。这一结果证明，小剂量的hCNTF可以用于在与l印tin抗性相关的肥胖模型中给出明显增加的l印tin作用。
实施例3DH-CNTF的抗肥胖作用的持续时间和特异性
述 行为研究。通过记录在3小时的黑暗的循环期间小鼠跨过其笼子中央的次数测定运动活性(21:00hr-24:00hr)。采用0到3级分类(O，没有活性；1，弱；2，正常；3，超活)，通过在笼子中的集中观察(在30分钟光照循环期间各在1分钟内观察5次)估价Grooming行为。采用具有作为新味道的O. 1%糖精的两瓶样品完成对调节的味道厌恶测定。
身体组成。将屠体匀浆，并将2-克等分试样冻干，然后在9(TC下烘干直到重量恒定。然后以乙醚/乙醇(20 : 1，v/v)提取脂肪(21)。从脱水和脂肪提取后的重量差异分
别计算水和脂肪质量，瘦肉质量定义为剩下的屠体量。
题 以前报道hCNTF在正常的小鼠中引起瞬时的体重减轻和食物摄取降低(22)，此后，还没有研究其对肥胖动物的作用。因此确定它对肥胖小鼠的作用是否敏感是重要的。如图3所示，DH-hCNTF产品在肥胖小鼠中产生延长的作用。以DH-CNTF 25-天处理db/db小鼠导致体重逐渐和稳步地减轻，至第8天达到相应于年龄和性别相对的野生型小鼠的水平。平行地，DH-CNTF引起食物摄取约50X的降低，在整个处理期间均保持。在用hCNTF处理17天的ob/ob小鼠中获得了类似的结果(未显示数据)。相反，在种系匹配的野生型小鼠中，DH-CNTF仅引起瞬时作用。这样，在瘦弱小鼠中DH-CNTF迅速降低食物摄取和体重改变比率，但是这些作用在大约5和10天的处理后分别减弱(图3)。 在肥胖和瘦弱动物之间所观察到的区别的 一 种可能的解释是hCNTF，类似于l印tin(5，6)，有效地耗尽脂肪组织群体，以便其作用的程度和期限依赖于脂肪沉积的大小。事实上，与载体处理的对照相比，DH-CNTF在ob/ob和db/db小鼠中特异性地降低身体脂肪的百分比，而增加身体的水和瘦肉(图4)。由DH-CNTF诱导的绝对重量损失可以通过体脂肪的有效损失(伴随着水质量的小量减轻(参见图4中的绝对重量))计量。在ob/ob小鼠中l印tin产生类似的作用(5，6)。这样，在肥胖小鼠中，hCNTF引起特异性抗脂肪作用。相反，已报道hCNTF在瘦弱小鼠中引起肌肉(23)和蛋白质(24)重量的减轻。对这一明显差异的一种似是而非的解释是hCNTF的有效的脂肪-消耗作用导致瘦弱动物中体脂肪几乎全部损失(参见(23)和我们未出版的结果)，这引起作为次要事件的蛋白质损失。
hCNTF不产生毒性，不舒服或疾病。不可逆毒性由以下发现排除，在db/db(图2G，H)和ob/ob小鼠(数据未显示)两者中，在中断蛋白质施用后，体重和食物摄取迅速回到处理前的水平。与载体处理的对照比较，以DH-CNTF(10ii g)处理db/db小鼠3天不明显改变运动活性(活性得分分别为43±6和49±6 ;n = 5)。同样地，DH-CNTF处理不改变grooming行为(活性得分对DH-CNTF和载体处理的分别为1. 2±0. 6和1. 0±0. 4)。此夕卜，DH-CNTF不引起任何习惯性行为的形成。蛋白质引起对味道厌恶的可能性采用两瓶具有作为新味道的0. 1 %糖精的样品在DIO小鼠中检查。类似于l印tin(已报道其在ob/ob小鼠(5)中降低水摄取)，DH-CNTF(10iig)在调节2天后导致DI0小鼠水摄取的降低(1. 8±0. lml对在载体处理的对照中的2. 8±0. 2ml ;n = 9 ;P < 0. 001)。然而，DH-CNTF不引起对味道的讨厌(糖精摄取为总液体的49±2%对对照的51±4%)。这些结果表明DH-CNTF的饱食作用不是因为细胞因子诱导的疾病行为。
实施例4hCNTF和DH-CNTF肥胖相关代谢缺陷的逆转
方法 小鼠接受每日腹膜内注射载体，l印tin(100ii g)， hCNTF(50iig)或DH-CNTF(10iig)。在配对饲喂实验(2和4)中，在前面的24小时期间，载体处理的小鼠随意饲喂或饲喂相同量的由DH-CNTF-处理的小鼠消耗的食物。在最后注射后的24小时(实验1和3)，或在最后注射和移去食物后7小时(实验2和4)取血样。用葡糖氧化酶方法测定血清葡萄糖，并且利用大鼠胰岛素作为标准，用放射免疫测定法(Amersham)测定血清胰岛素。 题 除重量和食欲调节作用外，hCNTF和DH-CNTF能够逆转与ob和db突变相关的血糖过多与血胰岛素增多。 携带有在C57BL/6背景上的ob突变的小鼠显示出强的血胰岛素增多(在2_3月龄时具有几乎正常葡萄糖水平)(25)，这可以通过l印tin处理予以纠正(5，6， 15)。用hCNTF或DH-CNTF处理ob/ob小鼠也导致血清胰岛素水平的大的降低(表1，实验1和2)。在C57BL/KS背景上的db/db突变体以严重的血糖过多为特征(在2-3月龄时具有几乎正常的胰岛素水平)(26)。如以前所报道的(5， 6， 15) ， l印tin不能在db/db小鼠中逆转血糖过多。相反hCNTF和DH-hCNTF导致添加的和耐久的血清葡萄糖水平两者上2_3_倍的降低，而不影响已经低水平的胰岛素(表1，实验3和4)。对细胞因子-处理的动物的食物摄取，DH-CNTF的体重减轻和抗糖尿病作用超过由配对饲喂ob/ob或db/db小鼠引起的那些(表1，实验2和4)。这些结果显示hCNTF的作用，类似于l印tin (6， 27， 28)，不单独因为降低的食物摄取。 在肥胖小鼠中l印tin， hCNTF和配对饲喂 对体重改变和血清胰岛素和葡萄糖的影响
处理重量改变血清葡萄糖胰岛素
—(g)(mM)(ng/ml)
实验1
(ob/ob,7天)
栽体+ 1. 6±0. 1nd63. 3±12. 7
一6. 5±0. 4*本nd8. 1±9. 1 +
hCNTF一8. 2±0. 1+木nd4. 3±1. 0*
DH-C,_7. 7±0. 8*氺nd3， 2±2. 9*
实验2
(ob/ob，4天)
栽体+0. 5±0. 5nd72. 5±25. 7
DH-C野一8- 4±0. 5*本§nd8. 1±0. 2*亇
配对_7. 0±0. 5"nd11. 1±0. 4氺
实验3
(db/db,7天)
栽体+0. 2±0. 423. 3±0. 89. 1±4. 2
Leptin-O. 8±0.528. 7±0. 8*9. 7±2. 6
hCNTF一6. 8±0. 5木木8. 4±1. 7**8. 2±2. i
实验4
(db/db，4天)
栽体0. 0±0. 330. 1±2. 0nd
DH-CNTF-6. 8±0.彬§12, 3±1-9*"nd
配对-5. 3±0. 4林24. 8±5. 4nd 数据是每个处理组3到6只动物的平均值±s. e. m. 。 nd，未测定。*P < 0. 05对载体**P < 0. 001对载体§ P < 0. 05对配对t P < 0. 001对配对(t-检验)
实施例5hCNTF和l印tin激活重迭神经元信号系统
方法 STAT活化测定。将GT-l-7和SN-56细胞保持在完全培养基(Dulbecco' s改进的Eagle培养基，含有10%胎牛血清，青霉素，谷酰胺；和(对SN-55细胞)丙酮酸钠)中。将细胞平板接种在100mm平皿上，当半汇合时，24小时后使用。如以前的描述(30)制备含有人0B-R(29)的整个编码区(核苷酸141-3770)的表达载体，并且按照制造者的说明经Lipofectamine(Gibco BRL)将其转染进细胞。24小时后，将细胞分布在60mm含有完全培养基的培养皿中，在另外的24小时后，如下详细描述的用不同的效应物处理10分钟前，除去血清4小时。然后用含有50mM NaF的冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，由离心收集，并且在液氮中冻结。如以前的描述(31)制备整个细胞抽提物。利用10i!g细胞抽提物，按照Sadowsky和Gilman的电迁移变换测定法(33)测定活化的STAT体内对高亲和性SIE m67寡核苷酸(32)的结合。通过在[a-32p]dATP和[a-32p]dCTP(3000Ci/mmo1)存在下用克列诺酶填补5'突出端来标记寡核苷酸探针。将复合物在5%聚丙烯酰胺/2. 5%甘油/0. 5XTBE(45mM Tris-硼酸盐)，O. 5mM乙二胺四乙酸，pH 7.8)凝胶上分离，将其干燥并进行放射自显影。 原位杂交。在含有弓形和副室下丘脑核的区域制备系列冠脑段。利用"S-标记的cRNA探针按照以前的描述(34)进行原位杂交。通过利用合适的寡核苷酸引物，经RT-PCR扩增小鼠脑RNA获得对小鼠0B-Rb， CNTFRa， LIFR和tis-l 1特异性的探针，相应于各自编码序列的核苷酸2850-3407， 246-856 (按照人序列编号)，2620-3217和1-950。
题 部分具有hCNTF和l印tin的生物活性说明这些蛋白质通过类似的信号机制起作用。hCNTF与l印tin调节STAT转录因子DNA结合活性的能力在两种神经元细胞系，SN-56(35)和GT-l-7(36)中检测，所说的细胞系分别衍生自小鼠间隔以及下丘脑神经元。用人OB-Rb(OB-R的足够产生信号的长形剪接变体(30， 37， 38))的表达载体转染细胞。在两种神经元细胞系上，hCNTF和l印tin触发STAT因子的类似模式的活化，具有STAT3同二聚体和较低程度的STAT1同二聚体和STAT1/STAT3杂二聚物的的有效的DNA结合(图5)。这一模式是gP130-信号细胞因子的特征(39)，与序列相似性一致，包括存在JAK激酶的共有基元和STAT因子相互作用位点(在0B-Rb和gpl30家族受体之间(9))。
l印tin和hCNTF的重叠代谢作用的一种可能的解释是这些蛋白质剌激人脑区域中的普通效应物途径，其牵涉到能量摄取和消耗。长形OB-Rb剪接变体在这样的区域有效地表达，包括弓形、腹内侧和副室下丘脑核(40,41)。为了确定下丘脑饱食中心是否也可以是hCNTF的耙，采用对鼠OB-Rb， CNTF a和LIFR特异性的cRNA探针进行原位杂交。如图6所示，小鼠下丘脑弓形和副室核表达l印tin和CNTF受体亚单位的mRNA。初步的结果表明CNTFRa和LIFR在其它核(包括腹内侧下丘脑)中表达。 与存在对中央饱食中心的细胞因子信号途径相一致，全身性施用l印tin在小鼠下丘脑中激活早期信号反应(42， 43)。如果hCNTF的作用机理类似于l印tin，则下丘脑反应的早期活化也应该在外周施用hCNTF后可检测。tis-ll原初应答基因(44)(其由hCNTF和其它Stat3-依赖性细胞因子(45)迅速诱导)被用作细胞活化的标记。在腹膜内注射l印tin或DH-CNTF之后1小时，与载体处理的对照比较，ob/ob小鼠的下丘脑tis-ll信使核糖核酸被发现明显提高。原位杂交揭示弓形核是tis-ll被两种细胞因子诱导的主要的位点(图7)。 这一结果说明，全身性施用hCNTF和l印tin可以在已经被认为是l印tin作用的重要的靶的脑区域中诱导早期信号反应(15，41)。不排除细胞因子间接地激活下丘脑细胞，例如通过外周介导物或经由传入神经。目前，这一作用的迅速性，以及在弓形核中hCNTF和l印tin的特异性受体的表达证明是细胞因子进入下丘脑的直接作用的结果。hCNTF(46)和l印tin(47)两者可以横越血脑屏障。经由特异性转运系统，细胞因子可以穿透人脑，如对l印tin所报道的(47)。通过位于血脑屏障外部的周围器官(例如邻近弓形核的中央隆起)(48)，它们也可以接近下丘脑神经元。总之，现在结果与部分具有hCNTF和l印tin的生物学活性牵涉作用的相关机制的概念是一致的。
实施例6hCNTF和hCNTF变体的CNTFR a结合活性 如以前的描述(10)，通过固相结合测定法测定对hCNTF和不同hCNTF变体的CNTF受体-a (CNTFRa)的相对结合亲和性。如表2所示， 一些hCNTF变体具有比野生型hCNTF对CNTFR a更大的亲和性。这些变体，与DH-CNTF—样，具有对治疗肥胖症和与其相关的疾病，如糖尿病的增加的实用性。 表2. hCNTF和hCNTF变体对CNTF受体a的结合
SEQ ID NO:名 称缩写/注相对结合(hCNTF二l)
1hCNTF野生型1. 1±0. 3
2(Glnl67Thr) hCNTF11. 8土0. 3
3(LysL60Gln/GirU67Thr)hCNTF3. 1±1. 0
4(Glnl67Tyr) hC,9. 6±2. 6
5(Serl66Asp/Glnl67His)hC證DH-CNTF22. 8±3. 5
6(Glnl63Ser/Glnl67His)hCNTF4. 1±1. 1
(Glnl67Ala) hCNTF9. 0±0. 7
8(SerL66Ala/Glnl67Ala)hCNTF8. 1±2. 8
9(Serl66Gly/Glnl67Ala)hCNTF7. 5±2. 2
10(Serl66Asn/Glnl67Ala)hCNTF12. 4±1. 2
11(Serl66His/Glnl67Ala)hCNTF8. 8±2. 6
12(Serl66Asp/Glnl67Ala)hCNTF13. 5±1. 7
13(Vall61Lcju/Glnl67Ala)hCNTF8. 8±0. 4
14(Lysl60Gln/Glnl67Ala)hC野11. 7±3, 2
15(Glnl67Ala/Hisl74Ala)hC,3. 6±0. 8
16(GlrU67Ala/Argl77Leu)hCNTFU. 7±3. 3
17(Glnl67Ala/Thrl69Ser)hCNTF6. 9±1. 3
18(GliU67Ala/Thrl6礼eu)hCNTF9. 6±2. 2
19(Glnl67Ala/Thrl69Leu/Phe1781le)hC8. 4±0. 4
20(Serl66Asp/Glnl67Ala/Thrl69Leu)fiC21. 0±1. 6
21(Serl66Asp/Glnl67Ala/Argl77Phe)hC13. 1±2. 0
22(Vall70Arg/Hisl74Ala)hCNTF3. 3±0. 4
23(Phel52Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hC32±11
24(Lysl55Ala/Serl66Asp/Clnl67His) hC51±19
25(Gln63Arg) hCNTF2. 0±0. 3
26(Gln63Arg/Seri66Asp/Glnl67His)hCN66±16
27(Asp30Gln/Serl66Asp/Glnl67His)hCN30±5
28(Thrl69Ue/Hisl74ALa)hCNTF0. 07±0. 01 参考文献 1. Weigle， D. S. (1994)FASEB J. 8， 302—310。
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于治疗肥胖和与其相关的疾病的药物上的用途(iii)序列数28(iv)邮寄地址:(A)收信人Societa' Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra，39(C)城市罗马(D)国家意大利(E)邮区代码:1-00186(V)计算机可读形式(A)介质类型3.5"软盘1.44兆(B)计算机:IBM PC兼容机(C)操作系统PC-D0S/MS-D0S Riv. 5. 0(D)软件微软Word 6.0(viii)代理人信息(A)姓名DI CERB0 Mario (Dr.)(B)证书号RM/X88924/PC-DC(ix)电讯信息
(A)电话
06/6785941
(B) 传真06/6794692
(C) 电传:612287 ROPAT (l)SEQ ID NO :1的信息:
(i) 序列特征
(A) 长度200个氨基酸
(B) 类型氨基酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构未知
(ii) 分子类型蛋白质 (ix)特征:
(A) 名称hCNTF野生型
(B) 其它信息hCNTF序列从1位到200位
(xi)序列描述SEQ ID NO :1 :
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu
1
Leu Cys Ser Arg
Leu Thr Ala Leu
Lys Asn lie Asn
Thr Asp Gin Trp
Asn Leu Gin Ala
Leu Glu Asp Gin
His Gin Ala lie
Tyr Gin lie Glu
Arg Asn Glu Ala
Leu Phe Glu Lys
Ser Gin Trp Thr
Ser His Gin Thr
5
Ser
20
Thr
35
Leu
50
Ser
65
Tyr
80
Gin
95
His
110
Glu
125
Asp
140
Lys
155
Val
170
Gly
lie Trp Leu Ala
Glu Ser Tyr Val
Asp Ser Ala Asp
Glu Leu Thr Glu
Arg Thr Phe His
Val His Phe Thr
Thr Leu Leu Leu
Leu Met lie Leu
Gly Met Pro lie
Leu Trp Gly Leu
Arg Ser lie His
lie Pro Ala Arg
Thr
10
Arg
25
Lys
40
Gly
55
Ala
70
Val
85
Pro
100
Gin
115
Leu
130
Asn
145
Lys
160
Asp
175
Gly
Pro Lys His Met Glu Leu Thr Val Glu Val Val Leu Ser
His Arg lie Arg Gin Gly Pro Val Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ala Ala Tyr Lys Gly Asp Leu Gin Arg Phe His Tyr
Arg Asp 15
Ser Asp
30 Leu Asn
45 Ala Ser
60 Gin Glu
75 Arg Leu
90 Asp Phe
105 Phe Ala
120 lie Pro
135 Gly Gly
150 Glu Leu
165 lie Ser
180 lie Ala:0181] 185 190 195
:0182] Asn Asn Lys Lys Met
:0183] 200
:0184] (2)SEQ ID NO :2的信息
:0185] (i)序列特征
:0186] (A)长度20个氨基酸
:0187] (B)类型氨基酸
:0188] (C)链型单链
:0189] (D)拓扑结构未知
:0190] (ii)分子类型蛋白质
:0191] (ix)牛寺征
:0192] (A)名称(Glnl67Thr)hCNTF
:0193] (B)其它信息(Glnl67Thr)hCNTF序列从159位到178位
:0194] (xi)序列描述SEQ ID NO :2 :
:0195] Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Thr Trp Thr Val Arg Ser lie
:0196] 15 10 15
:0197] His Asp Leu Arg Phe :0198] 20
:0199] (3)SEQ ID NO :的信息:3 :
:0200] (i)序列特征
:0201] (A)长度20个氨基酸
:0202] (B)类型氨基酸
:0203] (C)链型单链
:02(H] (D)拓扑结构未知
:0205] (ii)分子类型蛋白质
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:0207] (A)名称(Lysl60Gln/Glnl67Thr)hCNTF
:0208] (B)其它信息(Lysl60Gln/Glnl67Thr)hCNTF序列从159位到178位
:0209] (xi)序列描述SEQ ID NO :3 :
:0210] Leu Gin Val Leu Gin Glu Leu Ser Thr Trp Thr Val Arg Ser lie
:0211] 15 10 15
:0212] His Asp Leu Arg Phe
:0213] 20
:0214] (4)SEQ ID NO :4的信息
:0215] (i)序列特征
:0216] (A)长度20个氨基酸
:0217] (B)类型氨基酸
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:0219] (D)拓扑结构未知
(ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Glnl67Tyr)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Tyr)hCNTF序列从159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :4 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Tyr Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (5)SEQ ID NO :5的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF (B)其它信息(Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :5 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (6)SEQ ID NO :6的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Glnl63Ser/Glnl67His)hCNTF (B)其它信息(Glnl63Ser/Glnl67His)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :6 : Leu Lys Val Leu Ser Glu Leu Ser His Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15
(7)SEQ ID NO :7的信息 (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala)hCNTF序列从159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :7 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (8)SEQ ID NO :8的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Serl66Ala/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66Ala/Glnl67Ala)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :8 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ala Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (9)SEQ ID NO :9的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知
(ii)分子类型蛋白质 (ix)牛寺征 (A)名称(Serl66Gly/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66Gly/Glnl67Ala)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :9 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Gly Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (IO)SEQ ID NO :10的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)牛寺征 (A)名称(Serl66Asn/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66Asn/Glnl67Ala) hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :10 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asn Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (ll)SEQ ID NO :11的信息 (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征: (A)名称(Serl66His/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66His/Glnl67Ala)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :11 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu His Ala Trp Thr Val Arg Ser lie
(12)SEQ ID NO :12的信息 (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Serl6 GAsp/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Serl66Asp/Glnl67Ala)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :12 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (13)SEQ ID NO :13的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Vall61Leu/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Vall61Leu/Glnl67Ala)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :13 : Leu Lys Leu Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (14)SEQ ID NO :14的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸
(C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)牛寺征 (A)名称(Lysl60Gln/Glnl67Ala)hCNTF (B)其它信息(Lysl60Gln/Glnl67Ala)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :14 : Leu Gin Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (15)SEQ ID NO :15的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)牛寺征 (A)名称(Glnl67Ala/Hisl74Ala)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Hisl74Ala)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :15 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 Ala Asp Leu Arg Phe 20 (16)SEQ ID NO :16的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Glnl67Ala/Argl77Leu)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Argl77Leu)hCNTF序列从159 位到178位
(xi)序列描述SEQ ID NO :16 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Leu Phe 20 (17)SEQ ID NO :17的信息 (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Glnl67Ala/Thrl69Ser)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Thrl69Ser)hCNTF序列从 159位到178 (xi)序列描述SEQ ID NO :17 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Ser Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (18)SEQ ID NO :18的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Glnl67Ala/Thrl69Leu)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Thrl69Leu)hCNTF序列从159 位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :18 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe
20 (19)SEQ ID NO :19的信息: (i)序列特征[O454] (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Glnl67Ala/Thrl69Leu/Phel78Ile)hCNTF (B)其它信息(Glnl67Ala/Thrl69Leu/Phel78Ile)hCNTF 序列从159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :19 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg lie 20 (20)SEQ ID NO :20的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Serl66Asp/Glnl67Ala/Thrl69Leu)hCNTF (B)其它信息(Serl66Asp/Glnl67AIa/Thrl69Leu)hCNTF 序列从159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :20 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp Ala Trp Leu Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Arg Phe 20 (21)SEQ ID NO :21的信息: (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Serl66Asp/Glnl67Ala/Argl77Phe)hCNTF
(B)其它信息(Serl66Asp/Glnl67Ala/Argl77Phe) hCNTF序列从159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :21 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser lie 15 10 15 His Asp Leu Phe Phe 20 (22)SEQ ID NO :22的信息 (i)序列特征 (A)长度20个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Vall70Arg/Hisl74Ala)hCNTF (B)其它信息(Vall70Arg/Hisl74Ala)hCNTF序列从 159位到178位 (xi)序列描述SEQ ID NO :22 : Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu Ser Gin Trp Thr Arg Arg Ser lie 15 10 15 Ala Asp Leu Arg Phe 20 (23)SEQ ID NO :的信息23 : (i)序列特征 (A)长度200个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Phel52Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF (B)其它信息(Phel52Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF 序列从1位到200 (xi)序列描述SEQ ID NO :23 : Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp 15 10 15 Leu Cys Ser Arg Ser lie Trp Leu Ala Arg Lys lie Arg Ser Asp
20 25 30
LeuThrAlaLeuThrGluSerTyr ValLysHisGin Gly Leu Asn354045LysAsnlieAsnLeuAspSerAla Asp GlyMetPro Val Ala Ser505560ThrAspGinTrpSerGluLeuThr GluAlaGluArg Leu Gin Glu657075AsnLeuGinAlaTyrArgThrPhe HisValLeuLeu Ala Arg Leu808590LeuGluAspGinGinValHisPhe ThrProThrGlu Gly Asp Phe95100105HisGinAlalieHisThrLeuLeu LeuGinValAla Ala Phe Ala110115120TyrGinlieGluGluLeuMetlie LeuLeuGluTyr Lys lie Pro125130135ArgAsnGluAlaAspGly MetPro lieAsnValGly Asp Gly Gly140145150LeuAlaGluLysLysLeu TrpGly Leu GinValLeu Gin Glu Leu155160165AspHisTrpThrValArgSerlie His AspLeuArg Phe lie Ser170175180SerHisThrThrGlylieProAla ArgGlySerHis Tyr lie Ala185190195AsnAsnLysLysMet200 (24)SEQ ID NO :24的信息: (i)序列特征 (A)长度200个氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Lysl55Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF (B)其它信息(Lysl55Ala/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF 序列从1位到200位 (xi)序列描述SEQ ID NO :24 : Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp 15 10 15 Leu Cys Ser Arg Ser lie Trp Leu Ala Arg Lys lie Arg Ser Asp
202530LeuThrAlaLeuThrGluSerTyr ValLysHisGin Gly Leu Asn354045LysAsnlieAsnLeuAspSerAla Asp GlyMetPro Val Ala Ser505560ThrAspGinTrpSerGluLeuThr GluAlaGluArg Leu Gin Glu657075AsnLeuGinAlaTyrArgThrPhe HisValLeuLeu Ala Arg Leu808590LeuGluAspGinGinValHisPhe ThrProThrGlu Gly Asp Phe95100105HisGinAlalieHisThrLeuLeu LeuGinValAla Ala Phe Ala110115120TyrGinlieGluGluLeuMetlie LeuLeuGluTyr Lys lie Pro125130135ArgAsnGluAlaAspGly MetPro lieAsnValGly Asp Gly Gly140145150LeuPheGluLysAlaLeu TrpGly Leu LysValLeu Gin Glu Leu155160165AspHisTrpThrValArgSerlie His AspLeuArg Phe lie Ser170175180SerHisGinThrGlylieProAla ArgGlySerHis Tyr lie Ala185190195AsnAsnLysLysMet200(25) SEQID NO :25的{認 (i)序列特征 (A)长度200个氨基酸 (B)类型氨基酸 (C)链型单链 (D)拓扑结构未知 (ii)分子类型蛋白质 (ix)特征 (A)名称(Q63R)hCNTF (B)其它信息(Q63R) hCNTF序列从1位到200位 (xi)序列描述SEQ ID NO :25 : Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp 15 10 15 Leu Cys Ser Arg Ser lie Trp Leu Ala Arg Lys lie Arg Ser Asp20 Leu Thr
35 Asn Leu
50 Trp Ser
65 Ala Tyr
80 Gin Gin
95 lie His 110 Glu Glu 125 Ala Asp 140 Lys Lys 155 Thr Val 170 Thr Gly 185 Lys Met 200
(26)SEQ ID NO :26的信息
(i) 序列特征
(A) 长度:200个氨基酸
(B) 类型氨基酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构未知
(ii) 分子类型蛋白质 (ix)特征:
(A) 名称(Gln63Arg/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF
(B) 其它信息(Gln63Arg/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF 序列从1位到200位
(xi)序列描述SEQ ID NO :26
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg 1 5 10
Leu Thr Ala Lys Asn lie Thr Asp Arg Asn Leu Gin Leu Glu Asp His Gin Ala Tyr Gin lie Arg Asn Glu Leu Phe Glu Ser Gin Trp Ser His Gin Asn Asn Lys
25
Glu Ser Tyr Val Lys 40
Asp Ser Ala Asp Gly 55
Glu Leu Thr Glu Ala 70
Arg Thr Phe His Val 85
Val His Phe Thr Pro 100
Thr Leu Leu Leu Gin 115
Leu Met lie Leu Leu 130
Gly Met Pro lie Asn 145
Leu Trp Gly Leu Lys 160
Arg Ser lie His Asp 175
lie Pro Ala Arg Gly 190
His Met Glu Leu Thr Val Glu Val Val Leu Ser
Gin Gly Pro Val Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ala Ala Tyr Lys Gly Asp Leu Gin Arg Phe His Tyr
30 Leu Asn
45 Ala Ser
60 Gin Glu
75 Arg Leu
90 Asp Phe
105 Phe Ala
120 lie Pro
135 Gly Gly
150 Glu Leu
165 lie Ser
180 lie Ala
195
Arg Asp 15
Ser 20 Thr 35 Leu 50 Ser 65 Tyr 80 Gin 95 His 110 Glu 125 Asp 140 Lys 155 Val 170 Gly 185 Met 200
(27)SEQ ID NO :27的信息
(i) 序列特征
(A) 长度:200个氨基酸
(B) 类型氨基酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构未知
(ii) 分子类型蛋白质 (ix)特征:
(A) 名称(Asp30Gln/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF
(B) 其它信息(Asp30Gln/Serl66Asp/Glnl67His)hCNTF 序列从1位到200位
(xi)序列描述SEQ ID NO :27 :
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp
Leu Cys Ser Leu Thr Ala Lys Asn lie Thr Asp Arg Asn Leu Gin Leu Glu Asp His Gin Ala Tyr Gin lie Arg Asn Glu Leu Phe Glu Asp His Trp Ser His Gin Asn Asn Lys
Arg Leu Asn Trp Ala Gin lie Glu Ala Lys Thr Thr Lys
lie Trp Leu Ala Arg Lys lie Arg Ser Asp
25 30 Glu Ser Tyr Val Lys His Gin Gly Leu Asn
40 45 Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser
55 60 Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gin Glu
70 75 Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu
85 90 Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe
100 105 Thr Leu Leu Leu Gin Val Ala Ala Phe Ala
115 120 Leu Met lie Leu Leu Glu Tyr Lys lie Pro
130 135 Gly Met Pro lie Asn Val Gly Asp Gly Gly
145 150 Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gin Glu Leu
160 165 Arg Ser lie His Asp Leu Arg Phe lie Ser
175 180 lie Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr lie Ala
190 195Leu Cys Ser Leu Thr Ala Lys Asn lie Thr Asp Gin Asn Leu Gin Leu Glu Asp His Gin Ala Tyr Gin lie Arg Asn Glu Leu Phe Glu Asp His Trp Ser His Gin Asn Asn Lys
10
lie Trp Leu Ala Arg 25
Glu Ser Tyr Val Lys 40
Asp Ser Ala Asp Gly 55
Glu Leu Thr Glu Ala 70
Arg Thr Phe His Val 85
Val His Phe Thr Pro 100
Thr Leu Leu Leu Gin 115
Leu Met lie Leu Leu 130
Gly Met Pro lie Asn 145
Leu Trp Gly Leu Lys 160
Arg Ser lie His Asp 175
lie Pro Ala Arg Gly 190
Lys
His
lie Gin
Met Pro
Glu Arg
Leu Leu
1 5
Arg Ser
20 Leu Thr
35 Asn Leu
50 Trp Ser
65 Ala Tyr
80 Gin Gin
95 lie His 110 Glu Glu 125 Ala Asp 140 Lys Lys 155 Thr Val 170 Thr Gly 185 Lys Met 200
(28)SEQ ID NO :28的信息
(i) 序列特征
(A) 长度:200个氨基酸
(B) 类型氨基酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构未知
(ii) 分子类型蛋白质 (ix)特征:
(A) 名称:(Thrl69Ile/Hisl74Ala)hCNTF
(B) 其它信息(Thrl69Ile/Hisl74Ala)hCNTF序列从1 位到200位
(xi)序列描述SEQ ID NO :28 :
Thr Val Glu Val Val
Glu Ala Tyr Gly Leu
Leu Arg
Ser His
15
Arg Ser Gin 30
Gly Leu Asn 45
Val Ala Ser 60
Leu Gin Glu 75
Ala Arg Leu 90
Gly Asp Phe 105
Ala Phe Ala 120
Lys lie Pro 135
Asp Gly Gly 150
Gin Glu Leu 165
Phe lie Ser 180
Tyr lie Ala 195
Met1
LeuLeuLysThrAsnLeuHisTyrArgLeuSerSerAsn
AlaCysThrAsnAspLeuGluGinGinAsnPheGinHisAsn
PheSerAlalieGinGinAspAlalieGluGluTrpGinLys
ThrArgLeuAsnTrpAlaGinlieGluAlaLyslieThrLys
Glu5
Ser
20
Thr
35
Leu
50
Ser
65
Tyr
80
Gin
95
His
110
Glu
125
Asp
140
Lys
155
Val
170
Gly
185
Met
200
HislieGluAspGluArgValThrLeuGlyLeuArglie
Ser ProTrp LeuSer TyrSer AlaLeu ThrThr PheHis PheLeu LeuMet lieMet ProTrp GlySer liePro Ala
LeuAlaValAspGluHisThrLeuLeulieLeuAlaArg
Thr
10
Arg
25
Lys
40
Gly
55
Ala
70
Val
85
Pro
100
Gin
115
Leu
130
Asn
145
Lys
160
Asp
175
Gly
190
ProLysHisMetGluLeuThrValGluValValLeuSer
HislieGinProArgLeuGluAlaTyrGlyLeuArgHis
ArgArgGlyValLeuAlaGlyAlaLysAspGinPheTyr
ArgSerLeuAlaGinArgAspPhelieGlyGlulielie
Asp
15
Asp
30
Asn
45
Ser
60
Glu
75
Leu
90
Phe
105
Ala
120
Pro
135
Gly
150
Leu
165
Ser
180
Ala
19权利要求
激活CNTF(睫状神经营养因子)受体的物质在制备用于减轻体重之药物组合物上的用途。
2. 按照权利要求1的激活CNTF受体的物质的用途，其中所说的药物组合物适于肥胖症 的治疗。
3. 按照权利要求2的激活CNTF受体的物质的用途，其中所说的组合物适于治疗与肥胖 症相关的疾病。
4. 按照权利要求3的激活CNTF受体的物质的用途，其中所说的与肥胖症相关的疾病是 血糖过多或血胰岛素增多。
5. 按照权利要求3的激活CNTF受体的物质的用途，其中所说的与肥胖症相关的疾病是 糖尿病。
6. 按照权利要求1到5之任一的激活CNTF受体的物质的用途，其中所说的物质是 hCNTF的突变体。
7. 编码激活CNTF受体的物质的DNA分子在制备用于基因治疗肥胖症的药物组合物上 的用途，其中所述激活CNTF受体的物质如权利要求1-6中任一项所定义。
8. 按照权利要求7的DNA分子的用途，其中所说的药物组合物适于治疗与肥胖症相关 的疾病。
9. 按照权利要求8的DNA分子的用途，其中所说的与肥胖症相关的疾病是血糖过多或 血胰岛素增多。
10. 按照权利要求8的DNA分子的用途，其中所说的与肥胖症相关的疾病是糖尿病。
11. 按照权利要求1到IO之任一的激活CNTF受体的物质的用途，其中所说的药物组合 物以胶囊的形式制备。
12. —种用于基因治疗肥胖症的药物组合物，该组合物包含至少一种作为有效成分的 DNA和药学上可接受的载体，其中所述DNA如权利要求7中所定义。
13. —种用于减轻体重的药物组合物，该组合物包含至少一种作为有效成分的激活 CNTF受体的物质和药学上可接受的载体，其中所述激活CNTF受体的物质如权利要求1_6中 任一项所定义。
14. 按照权利要求13的药物组合物，其中所说的有效成分是hCNTF的突变体。
15. 按照权利要求13-14之任一的药物组合物，其中所说的药物组合物还包含有效成 分l印tin或类l印tin分子。
16. 按照权利要求15的药物组合物，其中hCNTF和/或至少一种其突变体与l印tin的 比率是1 : 500-1 : 5。
17. 按照权利要求15的药物组合物，其中hCNTF和/或至少一种其突变体与l印tin的比率是i : ioo-i : 25。
18. 按照权利要求12到17之任一的药物组合物，其中所说的药物组合物还含有药学上 可接受的赋形剂。
19. 按照权利要求18的药物组合物，其中所说的赋形剂有利于有效成分的吸收。
全文摘要
本发明涉及CNTF(睫状神经营养因子)受体激活物在治疗肥胖症上的用途，具体而言涉及hCNTF(人睫状神经营养因子)，其突变体或激活CNTF受体的其它分子在制备用于治疗肥胖症和与其相关的疾病(例如血糖过多)之药物上的用途。图1显示hCNTF和leptin在遗传性肥胖小鼠和患饮食诱导的肥胖症(DIO)的小鼠中对体重(左边组)和食物摄取(右边组)的抗肥胖效果。
文档编号A61K48/00GK101703761SQ20091022106
公开日2010年5月12日 申请日期1997年11月18日 优先权日1996年11月19日
发明者A·德马提斯, A·迪马科, D·拉扎罗, G·帕恩萨, G·西里伯特, I·格洛格恩, P·科斯塔, R·劳弗, R·科特斯 申请人:布·安格莱荻公司分子生物学研究所