眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法

专利名称：眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法
技术领域：
本方法发明新型涉及医药技术领域，具体涉及一种眼内用纳米粒冻干粉及其制备
方法。
背景技术：
糖皮质激素(glucosteroid， GS)类药物是眼科临床常用药，对视网膜脉络膜新生 血管等眼内增生性病变以及葡萄膜炎、视网膜血管炎等眼内炎性疾病具有确切疗效。鉴于 其全身性毒副作用，以及眼球特有的屏障结构，一般认为玻璃体内给药途径优于口服或静 脉注射给药。但玻璃体内单次给药后药物代谢消除较快，药效短暂；多次给药则会增加眼内 出血、白内障、视网膜脱离等并发症的发生率。眼科临床迫切需要一种高效、低毒的局部给 药系统，使糖皮质激素在眼内局部达到长期、稳定的药物浓度，从而满足临床对多种眼后节 病变的防治要求。

发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种眼内用纳米粒冻干粉 及其制备方法，具有载药量大、大小分布均匀、可缓慢释放糖皮质激素、减少反复玻璃体腔 给药次数和眼部并发症发生的特点。 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种眼内用纳米粒冻干粉，包括如 下成分 聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为50% 90% ; 糖皮质激素质量百分比为10% 50%，所说的糖皮质激素为醋酸地塞米松
(dexamethasone acetate， DA)。
—种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，包括如下步骤 首先，将糖皮质激素50mg 200mg溶于lml 3ml丙酮中作为内水相；将100mg200mg聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA溶于4. 5ml 9ml 二氯甲烷中，聚乳酸PLA 或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA浓度1. 8 2. 2%，作为油相；在冰浴条件下将二者混合，同 时高速搅拌30000转 40000转/分钟进行乳化60秒 90秒，形成油包水型初乳，内水 相油相=1 : 3 1 : 10 ;所说的糖皮质激素为醋酸地塞米松dexamethasone acetate, DA ; 其次，在冰浴条件下，将上述油包水型初乳滴加入2. 5% (w/v)的聚乙烯醇PVA 40ml 50ml，40KW 45KW功率超声作用8分钟 10分钟，形成均匀的水包油包水型复乳；
最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4 5小时，挥 发有机相，再于抽真空(由1.01Xl()Spa抽至1.33X 102pa)下减压(由250mbar减压至 40mbar)挥发25 30分钟；离心机的转速为20000转/分钟 30000转/分钟，离心时间 为20 25分钟，温度为3°C 4t:，离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的糖皮质激 素及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度3°C 4°C。
本方法发明新型的有益效果是，采用改良乳化/溶剂蒸发法将糖皮质激素包被于 可生物降解聚合物中形成纳米粒，实用有效、简便易行；由于纳米粒体积小，利于糖皮质激 素渗透入深层组织，到达靶细胞并被细胞吸收；通过选择聚合物分子量、亲水性的比率等理 化特性，可延长包载的糖皮质激素在细胞内的释放速率，从而延长作用时间；同时可生物降 解聚合物在体内降解代谢为H20和(A，对活体组织无毒性，具有生物降解性、生物相容性。


图1为本发明的载DA-PLGA纳米粒(NP2。)的透射电镜图。 图2为本发明的载DA-PLGA纳米粒(NP5。)的透射电镜图。 图3为本发明的载DA-PLGA纳米粒(NP5。)的粒径分布图。 图4为本发明的载DA-PLGA纳米粒(NP5。)的扫描电镜图。 图5为本发明的载DA-PLGA纳米粒(NP2。)体外释药的释药 图6为本发明的载DA-PLGA纳米粒(NP2。)体外释药的释药
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1—种眼内用纳米粒冻干粉，其包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为80. 8% ; 醋酸地塞米松DA的质量百分比为19. 2% 。 —种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，包括如下步骤 首先，将糖皮质激素醋酸地塞米松DA 50mg溶于1ml丙酮中作为内水相；将200mg 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA溶于9ml 二氯甲烷中，聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA浓度为 2. 0%，作为油相；在冰浴条件下将二者混合，同时高速搅拌，搅拌速度为30000转/分钟进 行乳化60秒，形成油包水型初乳，内水相油相=1 : 9; 其次，冰浴条件下，将上述油包水型初乳滴加入2. 5% (w/v)的聚乙烯醇PVA 40ml，40KW功率超声作用10分钟，形成均匀的水包油包水型复乳； 最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4.5小时，挥 发有机相，再于抽真空(由1.01Xl()Spa抽至1.33X 102pa)下减压(由250mbar减压至 40mbar)挥发30分钟；离心机的转速为20000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4°C， 离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的醋酸地塞米松DA及聚乙烯醇PVA制备成冻干
粉，保存温度4t:。 离心和洗涤过程中同时收集所有上清液，用于检测游离醋酸地塞米松DA的含量。
激光粒度分析取少许冻干的载DA-PLGA纳米粒(NP2。)，悬浮在适量用0. 2 y m的
滤膜过滤过的蒸馏水中，转入洗净的测定瓶中，于25t:进行激光光散射测定。 透射电镜观察纳米粒表面形态和粒径范围取少许冻干载DA-PLGA纳米粒(NP2。) 铺在铝箔的粘性表面，金粉包涂颗粒表面，扫描电镜下观察；少许载DA-PLGA纳米粒(NP2。) 混悬于化学液中，透射电镜下观察； 纳米粒载药率测定精确称取3mg载DA-PLGA纳米粒(NP2。)，溶于1ml三氯甲烷，
量-时间曲线图。 量-时间曲线图。加入3ml甲醇沉淀聚合物，4000rpm离心。取上清200ml，用甲醇稀释至4ml，测定A240。溶 剂用作空白。从地塞米松浓度 A240标准曲线上读取对应浓度，按下式计算载药率载药 率(Loading c即acity)=测得DA量/纳米粒取样量X100%。 载DA-PLGA纳米粒(NP2。)的体外释药特征测定精确称取5mg载DA-PLGA纳米粒 (NP2。)装入双腔池的释放池一侧，双腔各加入4mlPBS (pH7. 4) ， 130rpm， 37。C摇床中摇振，隔 点取样测定A240，从地塞米松浓度 A240标准曲线上读取对应浓度。 结果显示载DA-PLGA纳米粒(NP2。)大小均匀，粒径约为80 lOOnm，实测载药量 19. 2%，体外缓慢释放达28天。 参见图1，载DA-PLGA纳米粒(NP2。)的透射电镜图透射电镜下观察下可见NP2。呈 大小较为均匀的球状颗粒，粗测粒径约80 lOOnm，部分纳米粒相互黏附形成树枝状结构 (bar = 200nm)。 参见图5，载DA-PLGA纳米粒(NP2。)体外释药的释药量-时间曲线图横坐标为释放 时间(d)，纵坐标为释放醋酸地塞米松DA的含量，线图显示了 NP2。在30天内释放醋酸地塞 米松DA的含量。可见初始突释(dl)，较高速度的恒速释药(d2-16)和低速释药(dl8-28) 三相特征。 参见图6，载DA-PLGA纳米粒(NP2。)体外释药的释药量-时间曲线图横坐标为释放 时间(d)，纵坐标为释放醋酸地塞米松DA的含量，线图显示了 NP2。在30天内释放醋酸地塞 米松DA的含量。可见初始突释(dl)，较高速度的恒速释药(d2-15)，第三相突释(dl6-28) 和渐弱释药(d30-38)四相特征。
实施例2 —种眼内用纳米粒冻干粉，其包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为54. 7% ; 醋酸地塞米松DA的质量百分比为45. 3% 。 —种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，包括如下步骤 首先，将糖皮质激素醋酸地塞米松DA 200mg溶于3ml丙酮中作为内水相；将 200mg聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA溶于9ml 二氯甲烷中，聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA浓 度为2. 2%，作为油相；在冰浴条件下将二者混合，同时高速搅拌，搅拌速度为30000转/分 钟，形成油包水型初乳，内水相油相=1 : 3 ; 其次，冰浴条件下，将上述油包水型初乳滴加入2. 5% (v/w)的聚乙烯醇PVA 45ml，40KW功率超声作用10分钟，形成均匀的水包油包水型复乳； 最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4.5小时，挥 发有机相，再于抽真空(由1.01Xl()Spa抽至1.33X 102pa)下减压(由250mbar减压至 40mbar)挥发30分钟；离心机的转速为20000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4°C， 离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的醋酸地塞米松DA及聚乙烯醇PVA制备成冻干
粉，保存温度4t:。 离心和洗涤过程中同时收集所有上清液，用于检测游离醋酸地塞米松DA的含量。
激光粒度分析取少许冻干的载DA-PLGA纳米粒(NP5。)，悬浮在适量用0. 2 y m的
滤膜过滤过的蒸馏水中，转入洗净的测定瓶中，于25t:进行激光光散射测定。 透射电镜观察纳米粒表面形态和粒径范围取少许冻干载DA-PLGA纳米粒(NP5。)铺在铝箔的粘性表面，金粉包涂颗粒表面，扫描电镜下观察；少许载DA-PLGA纳米粒(NP5。) 混悬于化学液中，透射电镜下观察； 纳米粒载药率测定精确称取3mg载DA-PLGA纳米粒(NP5。)，溶于1ml三氯甲烷，加 入3ml甲醇沉淀聚合物，4000rpm离心。取上清200 yl，用甲醇稀释至4ml，测定A240。溶 剂用作空白。从地塞米松浓度 A240标准曲线上读取对应浓度，按下式计算载药率载药 率(Loading c即acity)=测得DA量/纳米粒取样量X100%。 载DA-PLGA纳米粒(NP5。)的体外释药特征测定精确称取5mg载DA-PLGA纳米粒 (NP5。)装入双腔池的释放池一侧，双腔各加入4mlPBS (pH7. 4) ， 130rpm， 37。C摇床中摇振，隔 点取样测定A240，从地塞米松浓度 A240标准曲线上读取对应浓度。 结果显示载DA-PLGA纳米粒(NP5。)大小均匀，平均粒径为140nm，实测载药量 45. 3%，体外缓慢释放达38天，各时间点的释药量较高。 参见图2，载DA-PLGA纳米粒(NP5。)的透射电镜图透射电镜下观察下可见NP5。呈 大小较均匀、形态规则的球状颗粒，粗测粒径约100 140nm(bar = 200nm)。
参见图3，载DA-PLGA纳米粒(NP5。)的粒径分布图横坐标为纳米粒粒径(nm)，纵坐 标为纳米粒相对含量，红色曲线描述了各粒径范围包含的纳米粒相对含量。载药率为50% 的载DA-PLGA纳米粒(NP5。)有效直径为232. 5nm，平均直径253. 6nm，多分散系数为0. 19。
参见图4，载DA-PLGA纳米粒(NP5。)的扫描电镜图扫描电镜下见NP5。呈大小较均 匀的球状颗粒，表面不甚规则，粗测粒径约140nm(bar = 100nm)。
实施例3 —种眼内用纳米粒冻干粉，其包括如下成分 聚乳酸PLA的质量百分比为70% ; 醋酸地塞米松DA的质量百分比为30 % 。 —种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，包括如下步骤 首先，将糖皮质激素醋酸地塞米松DA 50mg溶于1ml丙酮中作为内水相；将lOOmg 聚乳酸PLA溶于4. 5ml 二氯甲烷中，聚乳酸PLA重量比浓度2. 0%，作为油相；在冰浴条件 下将二者混合，同时以30000转/分钟的转速高速搅拌进行乳化60秒形成油包水型初乳，
内水相油相=l:5; 其次，冰浴条件下，将上述油包水型初乳滴加入2. 5% (v/w)的聚乙烯醇PVA 40ml，40KW功率超声作用10分钟，形成均匀的水包油包水型复乳； 最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4.5小时，挥 发有机相，再于抽真空(由1.01Xl()Spa抽至1.33X 102pa)下减压(由250mbar减压至 40mbar)挥发30分钟；离心机的转速为20000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4°C， 离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的醋酸地塞米松DA及聚乙烯醇PVA制备成冻干
粉，保存温度4t:。 毒性药理试验 本发明新型实施例1及实施例2中载DA-PLGA纳米粒冻干粉混悬液可经玻璃体 内注射给药在眼内发挥抗增生、抗炎和免疫抑制作用。为证实本发明在眼内的治疗效率水 平以及毒性，通过免疫组化、脉络膜铺片、荧光素眼底血管造影和组织病理学等方法观察载 DA-PLGA纳米粒在眼内新生血管模型(如激光诱导大鼠脉络膜新生血管、高氧诱导早产儿视网膜病变模型)中的组织分布及作用情况，评价其对新生血管的抑制效率。结果显示载 DA-PLGA纳米粒显著延长了 DA在兔眼玻璃体内的释药时间，改善了释药模式和组织生物利 用度，能够实现更持久的释药时间和更高的组织药物浓度，并能够显著抑制实验性大鼠眼 内新生血管的生长。利用视觉电生理和透射电镜评价纳米粒对视网膜功能和结构的毒性作 用，证实其对视网膜功能和超微结构无明显毒性作用，表现出眼内应用所要求的安全性和 组织生物相容性，具有临床应用的发展潜能。
权利要求
一种眼内用纳米粒冻干粉，其特征在于，包括如下成分聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为50％～90％；糖皮质激素质量百分比为10％～50％，所说的糖皮质激素为醋酸地塞米松dexamethasone acetate，DA。
2. 根据权利要求1所述的一种眼内用纳米粒冻干粉，其特征在于，包括如下成分聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为80. 8% ; 醋酸地塞米松DA的质量百分比为19. 2% 。
3. 根据权利要求1所述的一种眼内用纳米粒冻干粉，其特征在于，包括如下成分 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA的质量百分比为54. 7% ;醋酸地塞米松DA的质量百分比为45. 3% 。
4. 根据权利要求1所述的一种眼内用纳米粒冻干粉，其特征在于，包括如下成分 聚乳酸PLA的质量百分比为70% ;醋酸地塞米松DA的质量百分比为30%。
5. —种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤 首先，将糖皮质激素50mg 200mg溶于1ml 3ml丙酮中作为内水相；将lOOmg 200mg聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA溶于4. 5ml 9ml 二氯甲烷中，聚乳酸PLA 或聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA浓度为1. 8 2. 2%，作为油相；在冰浴条件下将二者混合， 同时高速搅拌30000转 40000转/分钟进行乳化60秒 90秒，形成油包水型初乳，内水 相油相=1 : 3 1 : 10 ;所说的糖皮质激素为醋酸地塞米松dexamethasone acetate, DA ;其次，在冰浴条件下，将上述油包水型初乳滴加入2. 5% (w/v)的聚乙烯醇PVA 40ml50ml， 40KW 45KW功率超声作用8分钟 10分钟，形成均匀的水包油包水型复乳；最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4 5小时，挥发有机 相，再于抽真空下减压挥发25 30分钟，由1. 01Xl()Spa抽至1. 33X 102pa，由250mbar减 压至40mbar ;离心机的转速为20000转/分钟 30000转/分钟，离心时间为20 25分钟，温度为3°C 4t:，离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的糖皮质激素及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度3°C 4°C。
6. 根据权利要求5所述的一种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，采取改良乳化/溶剂 蒸发法，其特征在于，包括如下步骤 首先，将糖皮质激素醋酸地塞米松DA 50mg溶于lml丙酮中作为内水相；将200mg聚乳 酸聚乙醇酸共聚物PLGA溶于9ml 二氯甲烷中，聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA浓度为2. 0%， 作为油相；在冰浴条件下将二者混合，同时高速搅拌，搅拌速度为30000转/分钟进行乳化 60秒，形成油包水型初乳，内水相油相=1:9;其次，冰浴条件下，将上述油包水型初乳滴加入2. 5% (w/v)的聚乙烯醇PVA 40ml， 40KW功率超声作用IO分钟，形成均匀的水包油包水型复乳；最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4. 5小时，挥发有机 相，再于抽真空下减压挥发30分钟，由1.01X10W由至1. 33X 102pa，由250mbar减压至 40mbar ;离心机的转速为20000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4"C，离心后收集、洗 涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的DA及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度4°C 。
7. 根据权利要求5所述的一种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，采取改良乳化/溶剂蒸发法，其特征在于，包括如下步骤首先，将糖皮质激素醋酸地塞米松DA 200mg溶于3ml丙酮中作为内水相；将200mg 聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA溶于9ml 二氯甲烷中，聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA浓度为 1.8%，作为油相；在冰浴条件下将二者混合，同时高速搅拌，搅拌速度为30000转/分钟，形 成油包水型初乳，内水相油相=1 : 3 ;其次，冰浴条件下，将上述油包水型初乳滴加入2. 5% (v/w)的聚乙烯醇PVA 45ml， 40KW功率超声作用10分钟，形成均匀的水包油包水型复乳；最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4. 5小时，挥发有机 相，再于抽真空下减压挥发30分钟，由I.OIXIOW由至1. 33X 102pa，由250mbar减压至 40mbar ;离心机的转速为20000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4。C，离心后收集、 洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的醋酸地塞米松DA及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度 4°C。
8. 根据权利要求5所述的一种眼内用纳米粒冻干粉的制备方法，采取改良乳化/溶剂 蒸发法，其特征在于，包括如下步骤一种眼内用纳米粒冻干粉及其制备方法，采取改良乳化/溶剂蒸发法制备，包括如下 步骤首先，将糖皮质激素醋酸地塞米松DA 50mg溶于lml丙酮中作为内水相；将100mg聚乳 酸PLA溶于4. 5ml 二氯甲烷中，聚乳酸PLA浓度为2.0%，作为油相；在冰浴条件下将二者 混合，同时以30000转/分钟的转速高速搅拌进行乳化60秒形成油包水型初乳，内水相 油相=1:5;其次，冰浴条件下，将上述油包水型初乳滴加入2. 5% (v/w)的聚乙烯醇PVA40ml， 40KW 功率超声作用10分钟，形成均匀的水包油包水型复乳；最后，将上步中制得的水包油包水型复乳在通风橱内常压下搅拌4. 5小时，挥发有机 相，再于抽真空下减压挥发30分钟，由1.01X10W由至1. 33X 102pa，由250mbar减压至 40mbar ;离心机的转速为20000转/分钟，离心时间为20分钟，温度为4。C，离心后收集、 洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的醋酸地塞米松DA及聚乙烯醇PVA制备成冻干粉，保存温度 4°C。
全文摘要
一种眼内用纳米粒冻干粉，包括聚乳酸PLA或聚乳酸聚乙醇酸PLGA和糖皮质激素；首先，将糖皮质激素溶于丙酮中作为内水相；将可生物降解聚合物PLA或PLGA溶于二氯甲烷中作为油相；在冰浴条件下将二者混合，高速搅拌形成油包水型初乳；其次，在冰浴条件下滴加入聚乙烯醇PVA外水相，经超声作用形成水包油包水型复乳；最后，在通风橱内搅拌，抽真空下减压挥发有机相，离心后收集、洗涤沉淀，蒸馏水洗除掉游离的糖皮质激素及PVA，制备成冻干粉，保存；具有载药量大、大小分布均匀、可缓慢释放糖皮质激素、减少反复玻璃体腔给药次数和眼部并发症发生的特点。
文档编号A61K47/34GK101711745SQ20091025445
公开日2010年5月26日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者侯慧媛, 宋存先, 张涛, 张自峰, 张鹏, 徐建锋, 惠延年, 朱洁, 李越, 杨秀梅, 杨菁, 王满燕, 王雨生, 石圆圆 申请人:中国人民解放军第四军医大学