一种甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺的制作方法
【专利摘要】一种甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于：将甘草酸与白蛋白在一定条件下反应，使甘草酸与白蛋白成功偶联，通过透析的办法将未与白蛋白偶联的甘草酸去除，然后偶联甘草酸的白蛋白溶液冻干，得到偶联甘草酸的白蛋白冻干粉；将偶联甘草酸的白蛋白以一定浓度溶于水中，羟基喜树碱溶于氯仿乙醇的混合溶液中，将羟基喜树碱溶液缓慢滴加到白蛋白溶液中，以一定的转速和时间匀浆；将匀浆之后的混悬液在一定的压力下均质一定的次数，得到水包油的乳液；将混悬液通过旋转蒸发的方法去除有机溶剂：乙醇和氯仿，然后以冻干的方式去除混悬液中的水，得到甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉。
【专利说明】一种甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉及其制备工艺，特别涉及对肝癌的治疗具有靶向性，载药量高，平均粒径小且分布均匀的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒的制备方法。
技术背景
[0002]甘草酸是甘草中最主要的活性成分。甘草酸具有保肝护肝的作用，因此常作为保肝成分添加在药剂中，甘草酸能够在肝脏大量聚积，国内研究表明，肝细胞表面存在甘草酸受体，而在肝肿瘤细胞表面甘草酸受体大量表达，表达量是正常肝细胞的1.5-5倍。因此，将甘草酸与载体偶联则具有肝靶向性的可能。国内已有研究表明经甘草酸修饰的脂质体具有良好的趋肝性，甘草酸偶联的白蛋白则能够大量的被肝细胞吸收。因此，本发明以甘草酸偶联的白蛋白作为载体，制 备了以羟基喜树碱为模型药物的肝癌靶向制剂。
[0003]轻基喜树碱(hydroxycamptothein, HCPT)是从我国特有的珙桐科植物喜树中提取出来的一种天然生物碱，是继紫杉醇之后又一具有发展前途的抗癌药物。羟基喜树碱是喜树碱的一种衍生物，作为拓扑异构酶I抑制剂，有效的干扰DNA的复制，从而达到抑制肿瘤的效果。羟基喜树碱是一种广谱的抗肿瘤药物且与其他抗肿瘤药物无交叉耐药性，对原发性肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、头颈部癌等恶性肿瘤有明显疗效。
[0004]羟基喜树碱水溶性极差、见光易分解。临床应用中，常将羟基喜树碱内酯环打开制备羟基喜树碱钠盐注射液。羟基喜树碱钠盐具有良好的水溶性，但其半衰期短，且有较大的毒副作用包括骨髓抑制、肾毒性等。将羟基喜树碱包被于白蛋白纳米粒中，增强了羟基喜树碱的水溶性、稳定性和长效性、抑瘤活性强、毒副作用大大降低，并且甘草酸偶联的白蛋白包被的羟基喜树碱具有优越的肝肿瘤细胞靶向性，为开发一种新型的肝癌靶向制剂提供了新的希望。
[0005]高压均质法作为一种纳米粒的制备方法具有能缩小制剂粒径和获得较窄且均匀粒径分布的特点
[0006]目前已公开发表的文献与专利与羟基喜树碱纳米粒制剂相关联的有:专利CN01138252.X公布了羟基喜树碱葡聚糖纳米粒的制备方法，其制备思路为将羟基喜树碱溶于碱性溶液中，在于葡聚糖经过反溶剂原理形成纳米粒后，调节体系PH值至酸性，使羟基喜树碱恢复内酯形态，但得到的纳米粒粒径分布宽。CN01133700.1公布了羟基喜树碱聚乳酸纳米粒的制备方法，制备思路为将羟基喜树碱在碱性条件下制备成羧酸盐以增加其水溶性，利用反溶剂的办法制备出纳米粒，该方法中羟基喜树碱内酯环被打开，活性大大降低且具有较大的毒副作用，此外粒径分布较宽。专利CN200710002545.6公布了羟基喜树碱纳米靶向制剂的制备方法，其原料包括明胶、叔丁醇、维生素、壳聚糖、羧甲基纤维素钠和羟基喜树碱，纳米粒由于有壳聚糖正电性，易与负电性的肿瘤细胞发挥药效，因此具有主动靶向性，但这种靶向性仍具有广谱特征。专利CN200710036426.2公布了羟基喜树碱长循环纳米粒，其结构为羟基喜树碱包封于丙交酯乙交酯共聚物PLGA中，表面在被覆表面活性剂和膜修饰材料。纳米粒具有缓释、毒性低、体内滞留时间长溶液相中稳定性高的特点，且粒径小，但不具备主动靶向性。专利CN201110135725.8公布了羟基喜树碱隐形纳米粒缓释制剂的制备方法，以生物可降解的材料作为药物载体，制备的纳米粒具有缓释长效的作用，但纳米粒不具有主动靶向性，且聚合物作为载体材料生物兼容性差。
[0007]本发明为了克服以上方法的不足，以具有肝靶向性的甘草酸与生物大分子白蛋白偶联，以此作为药物载体，利用高压均质乳化法制备了甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒。
【发明内容】
[0008]本发明涉及一种纳米肝癌靶向制剂的制备方法，特别涉及甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备方法。
[0009]本发明所采用的技术方案是:首先，将甘草酸与白蛋白在一定条件下反应，使甘草酸与白蛋白成功偶联，通过透析的办法将未与白蛋白偶联的甘草酸去除，然后偶联甘草酸的白蛋白溶液冻干，得到偶联甘草酸的白蛋白冻干粉；然后，将偶联甘草酸的白蛋白以一定浓度溶于水中，羟基喜树碱溶于氯仿乙醇的混合溶液中，将羟喜溶液缓慢滴加到白蛋白溶液中，以一定的转速和时间匀浆；将匀浆之后的混悬液在一定的压力下均质一定的次数，得到水包油的乳液；将混悬液通过旋转蒸发的方法去除有机溶剂:乙醇和氯仿，然后以冻干的方式去除混悬液中的水，得到甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉。
[0010]本方法的优点在于
[0011](I)所得甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉具有主动的肝癌靶向性，载药量高，平均粒径小且分布均匀。
[0012](2)生产成本低，易 于产业化。
具体实施方案
[0013]下面对本发明的实施例作进一步详细描述:首先，将甘草酸与白蛋白在一定条件下反应，使甘草酸与白蛋白成功偶联，通过透析的办法将未与白蛋白偶联的甘草酸去除，然后偶联甘草酸的白蛋白溶液冻干，得到偶联甘草酸的白蛋白冻干粉；然后，将偶联甘草酸的白蛋白以一定浓度溶于水中，羟基喜树碱溶于氯仿乙醇的混合溶液中，将羟喜溶液缓慢滴加到白蛋白溶液中，以一定的转速和时间勻衆；将勻衆之后的混悬液在一定的压力下均质一定的次数，得到水包油的乳液；将混悬液通过旋转蒸发的方法去除有机溶剂:乙醇和氯仿，然后以冻干的方式去除混悬液中的水，得到甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉。
[0014]所述的与甘草酸偶联的白蛋白可以使用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、重组白蛋白等，优选牛血清白蛋白。
[0015]所述的反应前甘草酸偶联的白蛋白浓度范围为0.5?4mg/mL，优选浓度为Img/
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[0016]所述的用于溶解羟基喜树碱的溶剂为氯仿与乙醇的混合溶剂，其中氯仿与乙醇的体积比范围为5:5?9:1，优选体积比为:7:3。[0017]所述的溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相的体积比范围为5:1?33:1，优选体积比为13:1。
[0018]所述的溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相发生乳化的过程中，匀浆速度的范围为5000?15000rpm，优选匀浆转速为5000rpm。
[0019]所述的溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相发生乳化的过程中，匀浆时间的范围为I?12min，优选匀浆时间为lmin。
[0020]所述的溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相进一步的乳化过程中，均质压力的范围为400?1200bar，优选均质压力为800bar。
[0021 ] 所述的溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相进一步的乳化过程中，均质次数的范围为3?15次,优选均质次数为7次。
[0022]实例1:
[0023]将60mg偶联甘草酸的白蛋白溶解于60mL水中，将7.4mg羟基喜树碱溶于2.4mL氯仿-无水乙醇溶液中，超声5分钟,将白蛋白水溶液置于勻衆器转头下,勻衆转速5000rpm,滴加溶有轻基喜树碱的有机相，滴加完之后匀衆I分钟，将匀衆后的体系转移到均质机中，在SOObar压力下均质7次，得到半透明有淡黄色乳光的体系。通过旋转蒸发的办法除去有机相，得到的水分散液再经冷冻干燥得到甘草酸偶联的白蛋白包载的羟基喜树碱纳米粒冻干粉。纳米粒平均粒径低于200nm，包封率和载药量为96.7%和10.6%。
[0024]实例2:
[0025]将SOmg偶联甘草酸的白蛋白溶解于SOmL水中，将9.6mg羟基喜树碱溶于3.2mL氯仿-无水乙醇溶液中，超声10分钟,将白蛋白水溶液置于勻衆器转头下，勻衆转速5000rpm,滴加溶有轻基喜树碱的有机相，滴加完之后匀衆I分钟，将匀衆后的体系转移到均质机中，在SOObar压力下均质7次，得到半透明有淡黄色乳光的体系。通过旋转蒸发的办法除去有机相，得到的水分散液再经冷冻干燥得到甘草酸偶联的白蛋白`包载的羟基喜树碱纳米粒冻干粉。纳米粒平均粒径低于200nm，包封率和载药量为93.1%和9.97%。
【权利要求】
1.一种甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺:首先，将甘草酸与白蛋白在一定条件下反应，使甘草酸与白蛋白成功偶联，通过透析的办法将未与白蛋白偶联的甘草酸去除，然后偶联甘草酸的白蛋白溶液冻干，得到偶联甘草酸的白蛋白冻干粉；然后，将偶联甘草酸的白蛋白以一定浓度溶于水中，羟基喜树碱溶于氯仿乙醇的混合溶液中，将羟喜溶液缓慢滴加到白蛋白溶液中，以一定的转速和时间匀浆；将匀浆之后的混悬液在一定的压力下均质一定的次数，得到水包油的乳液；将混悬液通过旋转蒸发的方法去除有机溶剂:乙醇和氯仿，然后以冻干的方式去除混悬液中的水，得到甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉。
2.按照权利要求1所述的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于，与甘草酸偶联的白蛋白可以使用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、重组白蛋白等，优选牛血清白蛋白。
3.按照权利要求1所述的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于，反应前甘草酸偶联的白蛋白浓度范围为0.5?4mg/mL，优选浓度为lmg/mL0
4.按照权利要求1所述的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于，用于溶解羟基喜树碱的溶剂为氯仿与乙醇的混合溶剂，其中氯仿与乙醇的体积比范围为5:5?9:1，优选体积比为:7:3。
5.按照权利要求1所述的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于，白蛋白与羟基喜树碱反应时，溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相的体积比范围为5:1?33:1，优选体积比为13:1。
6.按照权利要求1所述的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于，溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相发生乳化的过程中，匀浆速度的范围为5000?15000rpm，优选匀浆转速为5000rpm。`
7.按照权利要求1所述的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于，溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相发生乳化的过程中，匀浆时间的范围为I?12min，优选匀浆时间为lmin。
8.按照权利要求1所述的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于，溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相进一步的乳化过程中，均质压力的范围为400?1200bar,优选均质压力为800bar。
9.按照权利要求1所述的甘草酸介导的羟基喜树碱白蛋白肝癌靶向纳米粒冻干粉的制备工艺，其特征在于，溶解白蛋白的水相与溶解羟基喜树碱的有机相进一步的乳化过程中，均质次数的范围为3?15次，优选均质次数为7次。
【文档编号】A61P35/00GK103432083SQ201310136847
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年4月19日 优先权日:2013年4月19日
【发明者】祖元刚, 赵修华, 孟丽, 葛云龙, 张印, 邓怡平 申请人:东北林业大学, 祖元刚