专利名称：一种载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种载i o-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂及其制备方法。
背景技术：
io-羟基喜树碱是所有的天然喜树碱同类物或合成喜树碱同类物中活性最
大的一个天然衍生物，HCPT主要对增殖细胞敏感，是细胞周期特异性药物。 作用于S期，并对G2及M期边界具有延缓作用，对G0期无效。HCPT的抗癌 机理主要通过抑制拓朴异构酶I (T0P0 1)，干扰肿瘤细胞的DNA复制，抑制 肿瘤细胞生长，它与其它常用抗癌药物无交叉耐药。由于它具有高效、广谱、 低毒的特点，使大剂量化疗成为可能。此药的毒副反应较大，呈剂量依赖型毒 性，主要表现为骨髓抑制，引起白细胞减少、胃肠道反应、泌尿道刺激等， 由于半衰期较短，临床常需延长给药时间，或延长疗程，骨髓抑制和消化道毒 性也随之增加，这些毒副反应一定程度上限制了羟喜树碱的临床应用。此外， 羟喜树碱E环上的a -羟基内酯环是活性的必需基团，但羟喜树碱为水不溶、 脂难溶药物， 一般用其钠盐水溶液作为临床制剂，但形成钠盐后会使其E环上 的a -羟基内酯环打开，打开后形成的药物羧酸盐形式表现出极低的抗拓扑异 构酶I活性。有研究表明，内酯环结构破坏后，其药理活性下降90%。因此， 解决羟喜树碱溶解度差、半衰期短、内酯基团不稳定等问题是当前的研究热点。
超声微泡是一种内含气体的微球，用于增强组织超声显像，以提高疾病诊 断率。近年来，超声微泡还被尝试用于运载药物进行耙向治疗。以超声微泡携 载药物，静脉注射入体内后，在体外可采用诊断超声对微泡到达器官、组织进 行监控，同时可运用一定能量的治疗超声进行体外定点辐照可使微泡破裂，将 药物在局部释放出来一即超声破坏载药微泡定位释放治疗技术。在此过程中， 可对药物进行实时、靶向、定位控释。除此之外，超声破坏微泡瞬间产生的空 化效应，在局部产生微声流、射流、休克波等，可提高组织毛细血管膜和细胞 膜的通透性，有利于增强肿瘤细胞对药物的吸收，提高药物对肿瘤细胞的杀伤 效果。 '
发明内容发明所述的一种载io-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂，其特征是，由 类脂双分子层薄膜包裹生物惰性气体构成，io-羟基喜树碱包封于双分子层中，
类脂双分子层薄膜以下重量份配比的原料制得10-羟基喜树碱2 3份，磷脂 混合物7 9份，非离子表面活性剂O. 1 0. 5份。
所述载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡优选粒径范围为0. 5 6 ii m，更优选 粒径范围为1.3 2.8ym。为保证微泡应用的安全性和获得良好的超声靶向控 释效果，更优选的微泡平均粒径为l. 6 u m左右。
为了提高微泡稳定性，所述的磷脂混合物包括以下重量份配比的A和B: 5 7份A和1. 5 2份B，其中A为1， 2 — 二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷 脂酰胆碱和双肉豆蔻磷脂酰胆碱中的一种，B为1， 2 —二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 聚乙二醇5000 — 1， 2 — 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000—1， 2_二硬 脂酰磷脂酰乙醇胺、1， 2 — 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺中的一种。磷脂一聚乙二醇 5000 — 1， 2 — 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(MPEG5000-DPPE)和聚乙二醇2000 — 1， 2 — 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)具有长循环功能。
为了进一步提高微泡稳定性，所述的磷脂混合物还包括0. 5 1份C，其 中C为负电荷磷脂1， 2 — 二棕榈酰磷脂酸和1， 2 — 二棕榈酰磷脂酸中的一种。
为延长微泡在血液循环中的滞留时间及获得较好的超声生物学作用，所采 用的生物惰性气体为全氟丙垸。
为了提高微泡的产量并可调节微泡的粒径，所述的非离子表面活性剂选用 婆洛沙姆或者吐温80。
本发明所提供的载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂的制备方法，包括 以下步骤
(1) 将质量份配比10-羟基喜树碱2 3份、磷脂混合物7 9份、非离子表 面活性剂O. 1 0. 5份与400 600份溶液D混合，加热15 30分钟，使其分散形 成药物、磷脂混悬液；
(2) 将上述脂质混悬液经灭菌处理后分配至容量为l. 5ml的管形瓶中；以 全氟丙垸气体置换管形瓶上方空气后进行密封，每支管形瓶上方气体体积为 0.5 lml; 、(3)将管形瓶转移至机械振荡仪振荡，制得载10-羟基喜树碱脂质超声微
泡悬浮液，所得的悬浮液即为所述的载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂；
步骤(1)中所说的溶液D为磷酸盐缓冲液与非水溶剂的混合液、生理盐水
与非水溶剂的混合液、糖类与非水溶剂的混合液或醇类与非水溶剂的混合液。
磷酸盐缓冲液、生理盐水、糖类或醇类溶液与非水溶剂的体积比为9 10: 1，
糖类和醇类溶液为等渗或高渗。
将上述超声微泡悬浮液导出至西林瓶后，检测微泡的浓度、平均粒径、粒
径分布范围和药物的包封率、载药量。
所述的非水溶剂为丙二醇、丙三醇或两者的混合物。更优选为丙三醇，因
其较好的助溶作用，可使药物、磷脂在溶液中充分分散。为获得更好的分散效
果，还可将此混悬液进行冷冻干燥，然后重新水合形成药物、磷脂混悬液。
步骤(1)中加热温度优选为40 7(TC。
步骤(3)中机械振荡仪转速优选为3000 4500转/分钟，振荡时间优选 为30 j60秒。
本发明将io-羟基喜树碱携载于脂质超声微泡中进行靶向治疗，可克服io-
羟基喜树碱溶解性差的缺点，还可以使其a-羟基内酯环结构嵌人双分子层磷脂 膜中，避免内酯环在水环境和血液中开环，从而保持其生物活性，采用超声破 坏载药微泡定位释放治疗技术则可提高治疗效率，降低药物剂量，减少其毒副 作用发生。 、
本发明所采用的成膜材料主要为磷脂，安全性和生物相容性好，可在体内 生物降解且无毒性和免疫原性。
本发明所提供的载10-羟基喜树碱脂质超声微泡试剂的制备方法，工艺简 便、易操作，微泡产量高，性能稳定，显像效果好；磷脂用量少，药物包封率 和载药量高。
图i是本发明的载io-羟基喜树碱脂质超声微泡镜下观察结构示意图(x
400)。
图2是本发明的载10-羟基喜树碱脂质超声微泡增强兔肝脏显像对比图，其 中A为注射前的兔肝脏显像图，B为注射后的兔肝脏显像图。
具体实施例方式
以下结合实施例和附图，对本发明作进一步说明。 实施例l
取10-羟基喜树碱25mg， 1， 2 — 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)50mg， 1， 2 — 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)20mg，加入4. 5ml磷酸盐缓冲液与0. 5ml丙三醇组 成的混合液中，在45。C条件下水浴30分钟，待形成较均匀的混悬液后分配至 1.5ml管型瓶中，每支分配0.5ml，然后以全氟丙烷气体置换瓶内上方空气，密 封管型瓶。最后将管型瓶转移支机械振荡仪振荡45秒，即制得载10-羟基喜树 碱脂质超声微泡混悬液。图l是本发明的载10-羟基喜树碱脂质超声微泡镜下观 察结构示意图(X400)。
实施例2
取10-羟基喜树碱20mg， 二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)50mg， 1， 2 — 二棕榈 酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)20mg，加入4. 5ml 5%甘露糖溶液与0. 5ml丙二醇组成 的混合液中，余下操作按实例l中进行，最后制得载io-羟基喜树碱脂质超声 微泡混悬液。
实施例3
取10-羟基喜树碱20mg，双肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC) 70mg，聚乙二醇 5000 — 1， 2 —二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(MPEG5000-DPPE) 18mg， 1， 2 — 二棕榈 酰磷脂酸(DPPA) 16mg，婆洛沙姆5mg，加入4. 5ml 5%甘露糖溶液与0. 5ml 丙三醇组成的混合液中，余下操作按实例l中进行，最后制得载io-羟基喜树 碱脂质超声微泡混悬液。
实施例4
将实施例1、2、3中制得的载10-羟基喜树碱脂质超声微泡混悬液导入5ml 西林瓶中封盖一2(TC保存，并取少量稀释后以库尔特计数仪计数微泡浓度，检 测微泡粒径。另取部分微泡混悬液低速离心弃液体及少量沉淀，以甲醇加超声 破坏微泡，再加入适量甲醇完全溶解所释放出的药物，然后离心去除沉淀，将 上清夜稀释，取少量以高效液相检测10-羟基喜树碱浓度。最后计算包封率、 载药量。
实施例5建立小鼠肝癌H22模型，分3组，每组10只。按体重(2.5mg/kg)分别静脉 注射生理盐水、io-羟基喜树碱注射液、载10-羟基喜树碱脂质超声微泡混悬液， 然后在肿瘤部位进行同样超声辐照3分钟(2W/cm2)，共治疗7次。治疗结束后 第3天取瘤块称重计算抑瘤率。结果发现，相同剂量条件下，载10-羟基喜树碱 脂质超声微泡混悬液抑瘤率(74. 2% )明显高于10-羟基喜树碱注射液组(46. 3
%)，表明超声辐照载io-羟基喜树碱微泡组治疗效果优于超声辐照io-羟基喜
树碱注射液组。 实施例6
将上述载IO-羟基喜树碱脂质超声微泡混悬液按O. 05ml/kg剂量经耳缘静 脉注射入新西兰大白兔体内，在谐波状态下观察注入微泡前后兔肝脏显像情 况。图2是本发明的载10-羟基喜树碱脂质超声微泡增强兔肝脏显像对比图，其 中A为注射前的兔肝脏显像图，B为注射后的兔肝脏显像图。由图2可以看出， 本发明的试剂可明显增强超声显像，因此可被超声监控和触发。
权利要求
1、一种载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂，其特征是，由类脂双分子层薄膜包裹生物惰性气体构成，10-羟基喜树碱包封于双分子层中，类脂双分子层薄膜以下重量份配比的原料制得10-羟基喜树碱2～3份，磷脂混合物7～9份，非离子表面活性剂0.1～0.5份。
2、 根据权利要求l所述的一种载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂，其特征是，所述载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡粒径范围为0. 5 6 u m。
3、 根据权利要求2所述的一种载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂，其特征是，所述载IO-羟基喜树碱的脂质超声微泡粒径范围为I. 3 2. 8 u m。
4、 根据权利要求1所述的一种载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂，其特征是，所述的磷脂混合物包括以下重量份配比的A和B: 5 7份A和1. 5 2份B，其中A为1， 2 —二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和双肉豆蔻磷脂酰胆碱中的一种，B为l， 2 — 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇5000_1， 2 — 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000 — 1， 2 — 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、1， 2 — 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺中的一种。
5、 根据权利要求4所述的一种载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂，其特征是，所述的磷脂混合物还包括0.5 1份C，其中C为1， 2 — 二棕榈酰磷脂酸和l， 2 — 二棕榈酰磷脂酸中的一种。
6、 根据权利要求l所述的一种载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂，其特征是，所述的生物惰性气体为全氟丙烷；所述的非离子表面活性剂为婆洛沙姆或者吐温80。
7、 权利要求l所述的载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂的制备方法，包括以下步骤(1) 将质量份配比10-羟基喜树碱2 3份、磷脂混合物7 9份、非离子表面活性剂O. 1 0. 5份与400 600份溶液D混合，加热15 30分钟，使其分散形成药物、磷脂混悬液；(2) 将上述脂质混悬液经灭菌处理后分配至容量为l. 5ml的管形瓶中；以全氟丙垸气体置换管形瓶上方空气后进行密封，每支管形瓶上方气体体积为`0. 5 lml;(3) 将管形瓶转移至机械振荡仪振荡，即制得载10-羟基喜树碱脂质超声微泡悬浮液，所得的悬浮液即为所述的载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂;步骤(1)中所说的溶液D为磷酸盐缓冲液与非水溶剂的混合液、生理盐水与非水溶剂的混合液、糖类与非水溶剂的混合液或醇类与非水溶剂的混合液。磷酸盐缓冲液、生理盐水、糖类或醇类溶液与非水溶剂的体积比为9 10: 1。
8、 根据权利要求7所述的载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂的制备方法，其特征是，所述的非水溶剂为丙二醇、丙三醇或两者的混合物。
9、 根据权利要求7所述的载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂的制备方法，其特征是，步骤(1)中加热是温度为40 7(TC下加热。
10、 根据权利要求7所述的载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂的制备方法，其特征是，步骤(3)中机械振荡仪转速为3000 4500转/分钟，振荡时间为30 60秒。
全文摘要
本发明提供一种载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡试剂，其特征是，由类脂双分子层薄膜包裹生物惰性气体构成，10-羟基喜树碱包封于双分子层中，类脂双分子层薄膜以下重量份配比的原料制得10-羟基喜树碱2～3份，磷脂混合物7～9份，非离子表面活性剂0.1～0.5份。该超声微泡可增强超声显像，主要用作载10-羟基喜树碱的药物载体，可保护对其抗肿瘤活性具有重要作用的a-羟基内酯环结构，并可在超声监控下于特定部位被治疗超声靶向破坏，释放出所载10-羟基喜树碱，从而达到提高疗效降低毒副作用的目的。本发明还具体涉及制备该载药超声微泡的方法，其特征在于采用机械振荡法，应用该方法制备出的微泡产量高，性能稳定，显像效果好；磷脂用量少，药物包封率和载药量高。
文档编号A61P35/00GK101675995SQ200810212058
公开日2010年3月24日 申请日期2008年9月16日 优先权日2008年9月16日
发明者任建丽, 冉海涛, 张群霞, 涓 成, 攀 李, 王志刚, 郑元义 申请人:重庆医科大学附属第二医院