专利名称：用于给药的脂质体和其制备方法
用于给药的脂质体和其制备方法
背景技术：
脂质体是二十世纪八十年代作为给药载体/体系开发的微球体。第一个基于脂质 体的药物于二十世纪九十年代被批准用于商业用途。脂质体有三个不同的隔室，其可用于携带各种各样的化合物，诸如，例如药物内 部水性隔室；疏水的双分子层；和内层与外层之间的极性中间相。根据要包封的化合物的 化学性质，该化合物科被局限在所述隔室中的任何一个中。现在，在市场上可获得数种不经 肠道的脂质体药物制剂。水溶性药物倾向于局限在脂质体的水性隔室中，而包封在脂质体 中的药物的例子例如是多柔比星(Doxil)，多柔比星(Myocet)与柔红霉素(DaunoXone)。穿 插于脂质体膜中的药物的例子是例如两性霉素B(AmBisome)、两性霉素(Albel-cet B)、苯 并卟啉(Visudyne)和胞壁酰三肽-磷脂酰乙醇胺(Junovan)。因此，脂质体技术已经提供了灵活的方案以解决药理学中的挑战，例如增加药物 可溶性、减少药物毒性、改善目标药物释放，等等。作为给药载体的脂质体的性质决定性地依赖于其表面电荷、渗透性、可溶性、稳定 性等等，其显著地受到包含在脂质体组合物中的脂质的影响。另外，在制备稳定的脂质体剂 型时，对要被包封在脂质体中的药物可能需要考虑更多的条件。出于对安全和药物效力的考虑，要求脂质体制剂保持其性质，即从预备直到给药 保持稳定。另外，最好这样的剂型在被治疗对象体内运输期间完好，直至其到达靶点，在那 里特定地释放药物。如此，仍然需要改善的脂质体制剂。发明概述在第一个方面，本发明提供脂质体，其用于递送生物学活性物质，例如治疗剂。其 中，本发明的脂质体能够在磷脂酶A2分泌活性增加的位点(SPLA2)递送其有效载荷，因为磷 脂酶A2 (PLA2)将水解脂质体的脂质。因此，本发明的脂质体可例如用于与癌症相关的治疗。 本发明的第二个方面是含有本发明脂质体的脂质体制剂。另一个方面是制备本发明脂质体 制剂的方法。发明详述
下面参照附图详细说明本发明，其中图1显示了在室温储存期间，储存在含有10%蔗糖和ImM葡萄糖酸钙的溶液中的 奥沙利钼(oxaliplatin)的UV光谱。图2表示在室温储存期间，储存在含有10%蔗糖和ImM葡萄糖酸钙的溶液中的奥 沙利钼(图1)在254nm的相对吸收(天/天0)。图3表示在细胞介质(McCoy)在37摄氏度储存M小时后，不同的葡萄糖酸钙浓度 对含有顺钼(cisplatin) (A)或奥沙利钼(B)的脂质体的渗漏的影响(70/^5/5mol % DSPC/ DSPG/DSPE-PEG2000)(主轴)。最初的包封度(DOE)标于副轴。图4表示含有ImM葡萄糖酸钙的脂质体(70/25/5mol % DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000)包封的顺钼的细胞毒性。用顺钼或者脂质体包封的顺钼在存在或不存在SPLA2下处 理HT-29结肠癌细胞6小时(37摄氏度)。图5表示含有不同浓度葡萄糖酸钙(a)5mM葡萄糖酸钙、(B)ImM葡萄糖酸 钙、(C)O. ImM葡萄糖酸钙、⑶O.OlmM葡萄糖酸钙和(E) OmM葡萄糖酸钙的脂质体 (70/25/5mol % DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000)包封的奥沙利钼的细胞毒性。用奥沙利钼或者 脂质体包封的奥沙利钼在存在或不存在SPLA2下处理HT-四结肠癌细胞6小时(37摄氏 度)。图6表示含有不同浓度葡萄糖酸钙的脂质体(70/25/5mol % DSPC/DSPG/ DSPE-PEG2000)包封的顺钼的细胞毒性。用顺钼在存在或不存在SPLA2下处理HT-四结肠 癌细胞M小时(37摄氏度)。图7表示在室温下M小时后，对于不含钙的奥沙利钼包封脂质体(70/25/5mOl% DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000)，颗粒尺寸随着钙浓度的变化。脂质浓度维持在0. 84mM。图8表示在室温下M小时后，从不含钙的脂质体包封的奥沙利钼制剂 (70/25/5mol % DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000)的渗漏随着钙浓度的变化。脂质浓度维持在 0.84mM。图 9，在 25 摄氏度，含有 0. 5mol % NBD-PE 的 DSPC/DSPG/DSPE-PEG LUV 的荧光强 度的时间相关性。箭头指示连二亚硫酸盐、钙和Triton-XlOO的加入。图10，从超声处理步骤到第一透析步骤(10%蔗糖)后，颗粒尺寸随着包含5mol% DSPE-PEG2000和DSPC的脂质体奥沙利钼制剂中DSPG的变化。图11，从第一透析步骤(10%蔗糖)到第二透析步骤(10%蔗糖+葡萄糖酸钙)后， 颗粒尺寸随着包含5m0l% DSPE-PEG2000和DSPC的脂质体奥沙利钼制剂中DSPG的变化。图12，从超声处理步骤到第二透析步骤(10%蔗糖+/_葡萄糖酸钙)后，颗粒尺寸 随着包含DSPC和5mol% DSPE-PEG2000的脂质体奥沙利钼制剂中DSPG的变化。图13，在第一透析步骤(10%蔗糖溶液)后，含5mol% DSPE-PEG2000和不同量 DSPC与DSPG的脂质体奥沙利钼制剂的离子计数率(Pt195/P31)。图14，在第二透析步骤(10%蔗糖溶液士 ImM葡萄糖酸钙)后，含5mol % DSPE-PEG2000和不同量DSPC与DSPG的脂质体奥沙利钼制剂的离子计数率(Pt195/p31)。图15，在不含钙的溶液中透析的制剂和在含有钙的溶液中透析的制剂相比，离子 计数率(Pt19VP31)的％ -差异(参见图14)。图16，在包含5mol % DSPE-PEG2000和不同量的DSPC和DSPG的脂质体奥沙利钼 制剂第二透析(10%蔗糖溶液士 ImM葡萄糖酸钙)之后透析液中Pt的浓度。图17，在制剂中最终脂质体的尺寸和奥沙利钼浓度之间的相互关系。在透析期间， 使用或不使用ImM葡萄糖酸钙，制备脂质体奥沙利钼制剂(5mol% DSPE-PEG 2000，不同量 的DSPC与DSPG)(参见图14)。图18，脂质体奥沙利钼制剂(5mol % DSPE-PEG2000，不同浓度的DSPC与DSPG)在 McCoy细胞介质中(在37摄氏度培养M小时)的稳定性。图19，无葡萄糖酸钙存在的脂质体包封的奥沙利钼(60/35/5mol % DSPC/DSPG/ DSPE-PEG2000)制剂的 1. -6. DSC 扫描。扫描速度20摄氏度/小时。
图20，无葡萄糖酸钙存在的、含5mol% DSPE-PEG2000和不同浓度DSPC和DSPG的 脂质体包封的奥沙利钼制剂的DSC扫描(第一次扫描)。扫描速度20摄氏度/小时。图21，在外部有ImM葡萄糖酸钙存在的脂质体包封的奥沙利钼(60/35/5mol % DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000)制剂的1. -6. DSC扫描。扫描速度20摄氏度/小时。图22，在外部有ImM葡萄糖酸钙存在的、含5mol% DSPE-PEG2000和不同浓度DSPC 和DSPG的脂质体包封的奥沙利钼制剂的DSC扫描(第一次扫描)。扫描速度20摄氏度/ 小时。图23，奥沙利钼的包封脂质体在a)第一透析步骤和b)第二透析步骤(10%蔗糖 溶液，含有ImM葡萄糖酸钙)之后透析液中的Pt浓度。图24，在内外部均有ImM葡萄糖酸钙存在的脂质体包封的奥沙利钼 (60/35/5mol% DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000)制剂的 1. -6. DSC 扫描。扫描速度20 摄氏度 / 小时。图25，在内外部均有ImM葡萄糖酸钙存在的、含5mol% DSPE-PEG2000和不同浓度 DSPC和DSPG的脂质体包封的奥沙利钼制剂的DSC扫描(第一次扫描)。扫描速度20摄 氏度/小时。本发明的脂质体在例如癌症中，一种达到触发药物释放的方法是利用在癌组织附近升高的促分泌 磷脂酶A2(SPLA2)的水平。因此，通过小心地设计脂质体的脂质成分，一旦聚集在肿瘤中，脂 质体可被SPLA2降解，从而触发释放。本发明的一个目的是提供稳定性改善的脂质体和脂质体制剂，其可以在靶点释放 其荷载(例如，药物)，同时降低由于脂质体膜泄漏导致的不受控制的释放和/或过早的释 放。另一个目的是提供在储存期间稳定性增加的脂质体和脂质体制剂。脂质体的阴离子脂质在第一个方面，本发明提供一种脂质体，含有25% -45% (mol/mol)的阴离子脂 质。本发明人已经考虑了阴离子脂质含量对脂质体重要的特征的影响，诸如SPLA2介导的 脂质体脂质水解的速率以及对于脂质体的免疫应答。当阴离子脂质含量增加，由SPLA2导致的脂质水解的速率增加(药物释放增加)。 已经证明，适当的水解速率可以通过25% -45%之间的阴离子脂质含量获得。因此，在 一个实施方案中，阴离子脂质含量至少为25%。在另一个实施方案中，阴离子脂质含量 不大于45%。在又一个实施方案中，脂质体的阴离子脂质含量选自下列范围组成的组 25% -45%,25% -42%,28% -42%,30% -40%,32% -38%和 34% -36%。当关系到％含 量时，涉及mol/mol %，除非另外有明确的说明。如上所述，对于脂质体的免疫应答也受到阴离子脂质含量的影响。因此，体内脂质 体的清除速率可通过将脂质体中阴离子脂质含量保持在低于某一水平来降低，本发明人已 经认识到，脂质体中阴离子脂质的含量可用于达成SPLA2的水解速率和网状内皮系统清除 速率之间的平衡。优选阴离子脂质是磷脂，优选，磷脂选自PI (磷脂酰肌醇)、PS (磷脂酰丝氨酸)、 DPG( 二磷脂酰甘油)、PA(磷脂酸)、ΡΕ0Η(磷脂酰基醇)和PG(磷脂酰甘油)。更优选阴离 子磷脂是PG。
亲水聚合物在一个优选方案中，脂质进一步含有亲水聚合物，选自PEG [聚乙二醇)],PAcM[聚 (N-丙烯酰吗啉)]、PVP [聚(乙烯基吡咯烷酮)],PLA [聚(丙交酯)]、PG [聚(乙交酯)]、 POZO[聚O-甲基-2-噁唑啉)]、PVA[聚乙烯醇]]、HPMC(羟基丙基甲基纤维素)、ΡΕ0[聚 (环氧乙烷)]、壳聚糖[聚(D-葡糖胺)]、PAA[聚(氨基酸)]、聚HEMA[聚(2-羟基乙基 甲基丙烯酸酯)]和其共聚物。最优选聚合是PEG，分子量为IOODa至lOkDa。尤其优选的是2_5kDa的 PEG (PEG2000 到 PEG5000)，并且最优选 PEG2000。在脂质体上掺杂聚合物是本领域技术人员公知的，可用于增加脂质体在血流中的 半衰期，其原因可能是减少网状内皮系统的清除。优选，聚合物与，磷脂酰基乙醇胺端基连接。另一个选择是神经酰胺(即使该脂质 不是由PLA2可水解的)。连接聚合体的脂质优选以至少2%的量存在。更优选，该量为至少5%且不大于 15%。甚至更优选，连接聚合物的脂质为至少3%且不大于6%。含有阴离子磷脂且<2. 5% 的DSPE-PEG2000的脂质体在钙存在下聚集的倾向增加。这通常可通过形成高粘性凝胶观 察到。含阴离子磷脂且> 7. 5%的脂质体导致脂质体沉淀或者分相。因此，另一个优选的区 间是2. 5%至7. 5%。在脂质体中电中性的脂质成分优选，本发明的脂质体还含有不带电的磷脂，其选自两性离子磷脂，包括PC (磷脂 酰胆碱)和PE (磷脂酰乙醇胺)。最优选的两性离子磷脂是PC。与阴离子磷脂相反，在脂质体中，两性离子磷脂充当电中性的SPLA2-可水解脂质 成分。通过在同一脂质体中结合两性离子磷脂和阴离子磷脂，可调整到希望的表面电荷密 度，其满足了足够高的SPLA2水解和在血液中的低清除率。在脂质体中，两性离子磷脂的量优选为40% -75%，更优选为50% -70 %。醚-磷脂磷脂的一些或者全部可以是醚-磷脂。因此，在磷脂的甘油主链的sn-Ι位，其可以具有醚键而不是酯键。当SPLA2水解这 种特别的磷脂时，生成单醚解的磷脂，其对例如癌细胞是有毒的。即，醚磷脂可以视为是单 醚解磷脂的前体药物，本发明的脂质体可用于将这样的前体药物递送至癌细胞的SPLA2提 高的环境，在那里前体药物由SPLA2水解激活。在EP 1254143和WO 2006/048017中已经 描述了醚-磷脂，在此通过援引加入其内容。其他的前体药物通过SPLA2从脂质释放生成溶血脂的部分也可以是药物。因此，脂质体可含有单 醚溶血脂的前体药物、由SPLA2从脂质释放的前体药物及其他治疗剂，其在下文详述。稳定剂脂质体还可通过加入作为脂质体中膜成分的胆固醇而稳定。然而，在脂质体中高 含量的胆固醇有被PLA2水解的副作用，因此，优选脂质体含有不大于20%或者不大于10% 的胆固醇。更优选脂质体含有小于的胆固醇、小于0. 的胆固醇或者根本不含任何胆 固醇。
可调整脂质体所含脂质的烷链长度以求最佳的PLA2水解速率并将被包埋化合物 从脂质体的渗漏降到最低。优选烷基链是C18或者C16饱和链。本发明的脂质体优选用第三方面的方法制备，其中脂质体通过暴露于二价阳离子 被稳定。如上所述，脂质体可包含单醚溶血脂的前体药物和/或由SPLA2从脂质释放形成 溶血脂的部分的前体药物。在优选的实施方案中，脂质体包含生物学活性化合物，例如治疗剂(药物)，其不 是单醚溶血磷脂的前体药物或者单醚溶血磷脂。脂质体还可以含有单醚溶血磷脂的前体药 物和治疗剂。优选的生物学活性化合物是小分子、肽、蛋白质和核酸，例如质粒和低聚核苷 酸。优选的一类蛋白质是抗体，更优选单克隆抗体。优选的低聚核苷酸是核酸适配子、反义 寡核苷酸、微小RNA(HiicroRNA)和小干扰RNA(siRNA)。一类特别有利的化合物是小分子抗 肿瘤剂，例如氨茴环霉素(anthracyclin)衍生物、顺钼、奥沙利钼、卡钼、多柔比星、紫杉醇 (paclitaxel)、5_氟尿嘧啶、依昔舒林(exisulind)、顺式视黄酸、舒林酸硫化物(suldinac sulphide)、甲氨喋呤、博来霉素和长春新碱。另一类特别有利的是抗生素和抗真菌剂，再一 类是消炎剂，例如留体类和非留体类。脂质体可以包含1、2、3或更多种不同的生物学活性 化合物。在一个优选的实施方案中，脂质体仅含有一种生物学活性成分。在另一个实施方案中，脂质体含有诊断剂。“诊断剂"是指帮助定位靶组织和/ 或诊断疾病和/或病症的试剂。非限制性的例子可以是造影剂、微粒、放射剂、靶特异剂，诸 如特定结合到与疾病和/或病症相关的标示物上的试剂，等等。本领域技术人员清楚本发 明的一些实施方案涉及脂质体制剂，其中脂质体含有至少一种药物和一种诊断剂。本发明脂质体的物质化学特性脂质体可以是单层的(unilamellar)或者多层的(multilamellar)。最优选脂质 体是单层的。脂质体的直径应为50-400nm，优选为80-160nm，最优选为90-120nm。优选，本发明第二个方面的脂质体制剂的多分散性指数(Poly DispersityIndex, PDI)不超过0.2，更优选是0.15或者更低，甚至更优选0. 10或更低。在该范围的PDI值表 示在制剂中较窄的颗粒尺寸分布。由上文可知，优选脂质体所含脂质的至少一种，当存在于脂质体中时，是SPLA2的 底物。 在一个实施方案中，脂质体含有的脂质在sn-3位置而不是在sn-2位置被SPLA2水 解。在WO 2006/048017中已经公开了这样的非天然脂质和含有非天然脂质的脂质体，所述 内容通过援引加入本文。优选，本发明的脂质体存在于第二个方面的脂质体制剂中。因此，如第二方面所 述，已经通过暴露在二价阳离子下将其稳定化。在一个实施方案中，脂质体在形成后仅暴露 于二价阳离子。即，脂质体的内部不含有二价阳离子。在另一个实施方案中，仅有脂质体的 内部包含二价阳离子。与本发明脂质体相关的二价阳离子的存在不能直接地检验。然而，本发明描述了 指示是否脂质体已经被二价阳离子稳定化的参数。不存在二阶阳离子的脂质体奥沙利钼(70/25/5mol% DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000) 的DSC-扫描具有单一的转变温度，也即观测到一个峰。如果重复扫描，转变温度向较高的温度移动，这可能是由于在通过转变温度时，奥沙利钼释放到脂质体的外部(图19)。已经 暴露于二阶阳离子的脂质体的重复DSC扫描具有更恒定的转变温度。因此，在一个实施方 案中，本发明的脂质体的特征在于脂质体的重复DSC扫描得到的转变温度，第一次和第二 次扫描之间相差不大于2摄氏度。在另一个实施方案中，本发明的脂质体的特征在于脂质 体的重复DSC扫描得到的转变温度，第一次和第二次扫描之间的差异小于相同成分的对照 脂质体的转变温度差异。通过暴露于二阶阳离子稳定化的脂质体奥沙利钼(70/25/5mol % DSPC/DSPG/ DSPE-PEG2000)的DSC扫描得到分相的转变温度(在扫描中两个峰；见例如图22)。因此， 在一个本发明脂质体的实施方案中，脂质体的特征在于脂质体的DSC扫描得到分相的转变温度。另外，因为脂质体的转变温度由于暴露于二价阳离子而向较高温度移动，所以确 定脂质体是否已经暴露于例如钙的二阶阳离子的一个方法是确定与测试脂质体成分相同 的对照脂质体的转变温度，其中所述对照脂质体没有暴露于二阶阳离子。因此，在一个实施 方案中，本发明的脂质体的特征在于其具有比对照脂质体更高的转变温度，所述对照脂质 体具有相同的成分而没有暴露于二价阳离子。在另一个实施方案中，本发明的脂质体的特征在于当其暴露于ImM钙时，平均的 脂质体尺寸减少不大于10%，更优选不大于5%。如果其预先没有暴露于钙，则当暴露时其 会缩小。测试是否试验脂质体已经暴露于钙的一个试验方法是通过与对照脂质体进行比 较，对照脂质体具有相同的成分并已知其没有暴露于钙。因此，在一个实施方案中，本发明 的脂质体的特征在于当暴露于ImM钙时，其显示的收缩程度小于具有相同成分预先未暴露 于二价阳离子的对照脂质体的收缩程度。脂质体制剂本发明的第二个方面是含有本发明脂质体的脂质体制剂。优选，制剂还含有浓度 至少0. ImM的二阶阳离子。本发明人已经发现，二阶阳离子的存在(预先暴露于二阶阳离 子)稳定了制剂的脂质体，导致生物学活性化合物从脂质体中的渗漏降低。然而，经验表 明，二阶阳离子的浓度不应超过10mM，更优选不超过5mM，因为这样的浓度会导致脂质体的 聚集和不希望的高粘度。更优选，二价阳离子的浓度不大于ImM，最优选二价阳离子的浓度 为0. lmM-lmM(图3)。优选的二价阳离子是钙。在一个优选的实施方案中，二价阳离子选自镁(Mg2+)、铁(Fe2+)、钙(Ca2+)、铍 (Be2+)、镁(Mg2+)、锶(Sr2+)、钡(Ba2+)和镭(Ra2+)。已经测试了多种二价阳离子(数据未显示)，最佳的效果是Ca2+，因此Ca2+被优选 用于制剂。另外，根据经验，Ca2+的平衡离子在一些情况下是重要的。因此，在一个实施方案 中，平衡离子选自大阴离子，例如有机盐，优选选自葡糖酸根、丙酸根或者乳酸根。更优选平 衡离子是葡糖酸根。二价阳离子可分布在脂质体内部、脂质体外部或者既在脂质体内部又在脂质体外 部。因此，二价阳离子可存在于水合溶液中和/或存在于净化、悬浮和/或储存脂质体制剂 的溶液中。在一个优选的实施方案中，二价阳离子分布在脂质体的外部，而不是在脂质体的 内部。在这个实施方案中，二价阳离子可在脂质体形成以后加入。
所用的钙盐浓度取决于特定的脂质体制剂和药物。经常需要一定浓度的诸如 CaCl2或者NaCl的盐来稳定脂质体。然而，在一些盐诸如例如NaCl存在下奥沙利钼是不稳 定的，而顺钼在磷酸盐存在下或在纯水中是不稳定的。因此，选择的盐的种类和其浓度将对 囊泡形成特性产生重要影响，因此，根据要被包封的药物，必须选择不同的盐和不同的盐浓 度用于制备脂质体制剂。优选，脂质体制剂的多分散性指数(PDI)不超过0.2，更优选为0. 10或更低。在该 范围的PDI值表示在制剂中较窄的颗粒尺寸分布。脂质体制剂的保存在一优选的实施方案中，脂质体制剂还含有冷冻和/或溶解保护剂。在脂质体的存储期间，磷脂可能水解。防止脂质体制剂中磷脂分解的一个简单方 法是冷冻或者冻干。然而，冷冻可能导致脂质体制剂的渗漏，导致被包封药物的释放。为了避免或降低 冷冻后从脂质体制剂的渗漏，可能必须加入冷冻保护剂。因此，在一些实施方案中，本发明 涉及还含有冷冻保护剂的脂质体制剂。可用作冷冻保护剂的试剂的例子非限制性地可以是 二糖，例如蔗糖、麦芽糖和/或海藻糖。这类试剂可以不同的浓度使用，取决于制备和所选 择的试剂以便得到等渗溶液。脂质体还可以冻干、储存和重构，从而保持其内部成分的本质部分。脂质体脱水通 常要求在脂质体双分子层的内外接触面均使用溶解保护剂，例如二糖(蔗糖、麦芽糖或者 海藻糖)。该亲水化合物通常被认为预防了脂质在脂质体制剂中的重排，从而在干燥过程和 后来的重建过程中保持尺寸和含量。对于这样的干燥保护剂，适合的特性是其具有保持了 脂质体双层成分的分子间空隙的立体化学特性。脂质体制剂的制备方法本发明的第三个方面是制备脂质体制剂的方法，包括步骤a)在有机溶剂中溶解所选择的脂质制备脂质混合物，b)将步骤a)的产物用含水的水合溶剂水合从而形成脂质体，c)在加入含水的水合溶剂之前，或在加入含水的水合溶剂之后，除去步骤a)的有 机溶剂。优选，在加入水合溶剂之前除去有机溶剂。所述方法还包括高剪切混合以减小脂质体的尺寸。所述方法还可包括将步骤C)制备的脂质体挤出过滤器的步骤，以制备特定平均 尺寸的脂质体。所述方法还可包括超声处理脂质体制剂的步骤，以制备具有特定尺寸的脂质体。优选，脂质体是如本发明第一个方面所述的脂质体。脂质体可通过将药物溶解在用于制备脂质体的有机溶剂中或水合溶剂中来加载 至少一种治疗剂。另选地，可离子化的治疗剂可加载到脂质体中首先形成脂质体，例如通过PH梯 度确立跨越最外脂质体层的电化学电位，然后向在脂质体外的含水介质加入可离子化的治 疗剂。在一个优选的实施方案中，水合溶剂含有二价阳离子，其浓度至少0. ImM，更优选其浓度为0. lmM-5mM，最优选为0. ImM-ImM0优选二价阳离子是Ca2+。在另一个实施方案中， 水合溶剂不含二价阳离子。在该实施方案中，优选如下所述地将外部水相转换为含有二价 阳离子的另一个外部水相。在另一个实施方案中，所述方法还包括改变制剂外部水相的步骤。最初，水相含水 合溶剂。外部水相可通过离心、超滤、透析或类似方法改变以制备含有在外部水相特定成分 溶液中的脂质体的脂质体制剂。优选，生物学活性化合物(治疗剂)仅存在于脂质体内部 或附着于脂质体，而不是溶液中的游离化合物。优选药物在脂质体中的包封> 70 %，更优选 > 95%，最优选> 99%。药物包封率是被包封的药物和制剂中药物总量之比。在一个优选的实施方案中，外部水相被转换为另一种含有二价阳离子的外部水 相，二价阳离子的浓度至少0. ImM，更优选其浓度为0. lmM-5mM，最优选为0. ImM-ImM。优选 二价阳离子是Ca2+。本发明人已经发现，当暴露于钙时，脂质体开始泄漏包封的化合物。此外，脂质体 凝缩为较小粒径。然而，在最初渗漏之后，脂质体暴露于Ca2+显示了降低的渗漏，如在细胞 介质中的培养所示(例如McCoy介质；图幻。因为最初的渗漏，通常进行透析和/或离心， 将脂质体与泄漏的物质分离。也可以进行过滤。在第二个方面的一个优选实施方案中，脂质体制剂用第三个方面所述的方法制备。药剂本发明的第五个方面是第一个方面的脂质体或第二个方面的脂质体制剂作为药 物的应用。本发明的第六个方面是第一个方面的脂质体或第二个方面的脂质体制剂用于治 疗PLA2活性增加的病症的应用。这样的病症例如是癌症和炎性疾病。
实施例实施例1 脂质体包封的顺钼和脂质体包封的奥沙利钼的制备脂质体包封的顺钼和脂质体包封的奥沙利钼是脂质体-药物制剂，其中药物 顺钼或者奥沙利钼被包封在脂质体的水性隔室中。脂质体药物制剂由在脂质混合物 中包封的药物构成，所述脂质混合物由5mol % mPEG2000- 二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺 (DSPE-PEGZOOOhZSmol1^ 二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)和70mol % 二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC)制成。用于制备每种制剂的特定方法如下所述。脂质体包封的顺钼磷脂溶于9 1 (ν/ν)氯仿/甲醇。然后在65摄氏度热水浴中，在氮气气流下，蒸 发溶解的脂质混合物的溶剂直至目测干燥。样品进一步在真空下干燥过夜。将含有顺钼的水合液体(氯化钠和葡萄糖酸钙的溶液，都具不同浓度)在65-70 摄氏度加入到干燥的脂质混合物中以制备多层囊泡(MLV)。脂质悬浮液在65-70摄氏度保 持至少30分钟以便确保完全水合。在此期间，每5分钟涡流脂质悬浮液。在65摄氏度的 MLV超声处理5分钟，然后在65-70摄氏度从IOOnm孔径尺寸的聚碳酸酯过滤器挤出，制备 大单层脂质体(LUV)。然后将LUV转移到透析盒(MWC0:10kDa)以便除去未包封的顺钼。脂质体包封的奥沙利钼
磷脂溶于9 1 (ν/ν)氯仿/甲醇。然后在65摄氏度热水浴中，在氮气气流下，蒸 发溶解的脂质混合物直至目测干燥。样品进一步在真空下干燥过夜。含奥沙利钼的水合缓冲液(具有不同浓度钙盐的10%蔗糖溶液)加入到干燥的脂 质混合物用于制备多层囊泡(MLV)。脂质悬浮液在65-70摄氏度保持至少30分钟以便确保 完全水合。在此期间，每5分钟涡流脂质悬浮液。在65-70摄氏度的MLV超声处理5分钟， 然后在65-70摄氏度从IOOnm孔径尺寸的聚碳酸酯过滤器挤出，制备大单层脂质体(LUV)。 然后将LUV转移到透析盒(MWC0:10kDa)以便除去未包封的奥沙利钼。平衡样品，然后采用离心过滤的分离步骤，估算相对于脂质体包封的顺钼或者脂 质体包封的奥沙利钼，脂质体外部Pt含量。使用ICP-MS测定Pt含量。表1 改变葡萄糖酸钙含量，在脂质体顺钼制剂中的顺钼含量。
权利要求
1.脂质体，含有 为25%-45% (mol/mol)的阴离子脂质， 不大于10%的胆固醇和 治疗剂，-其中，脂质体已经暴露于浓度0. ImM-ImM的二价阳离子。
2.权利要求1的脂质体，其中阴离子脂质选自PI(磷脂酰肌醇)、PS (磷脂酰丝氨酸)、 DPG ( 二磷脂酰甘油)、PA (磷脂酸)、PEOH (磷脂酰基醇)和PG (磷脂酰甘油)。
3.前述权利要求任一项的脂质体，其中阴离子脂质是磷脂酰甘油。
4.前述权利要求任一项的脂质体，含有亲水聚合物，所述亲水聚合物选自PEG[聚(乙 二醇)]、PAcM[聚(N-丙烯酰吗啉)]、PVP[聚(乙烯基吡咯烷酮)]、PLA[聚(丙交酯)]、 PG [聚(乙交酯)],Ρ0Ζ0[聚(2-甲基-2-噁唑啉)]、PVA[聚(乙烯醇)]、HPMC (羟基丙基 甲基纤维素)、PEO[聚(环氧乙烷)]、壳聚糖[聚(D-葡糖胺)]、PAA[聚(氨基酸)]、聚 HEMA[聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)]和其共聚物。
5.权利要求4的脂质体，其中聚合物是PEG，分子量为IOODa至lOkDa。
6.权利要求4和5任一项所述的脂质体，其中聚合物连接头基磷脂酰乙醇胺。
7.权利要求4-6任一项所述的脂质体，其中聚合物连接的脂质的量为2.5% -7. 5% (mol/mol)。
8.前述权利要求任一项所述的脂质体，含有不带电荷的磷脂，其选自PC(磷脂酰胆碱) 和PE(磷脂酰乙醇胺)。
9.前述权利要求任一项所述的脂质体，不含胆固醇。
10.前述权利要求任一项的脂质体，其中脂质的烷基链是C18饱和链。
11.前述权利要求任一项所述的脂质体，其中治疗剂选自氨茴环霉素衍生物、顺钼、奥 沙利钼、卡钼、多柔比星、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、依昔舒林、顺式-视黄酸、舒林酸硫化物、甲 氨喋呤、博来霉素和长春新碱。
12.前述权利要求任一项的脂质体，其中治疗剂是奥沙利钼或者顺钼。
13.前述权利要求任一项的脂质体，其中脂质体是单层大囊泡(LUV)。
14.前述权利要求任一项的脂质体，其中脂质体直径为80-120纳米。
15.前述权利要求任一项的脂质体，其中脂质体中脂质的至少一种是SPLA2的底物。
16.前述权利要求任一项的脂质体，其中二价阳离子是Ca2+。
17.脂质体制剂，含有根据权利要求1-16任一项的脂质体和0.ImM-ImM的二价阳离子。
18.权利要求17的脂质体制剂，其中二价阳离子是Ca2+。
19.权利要求17-18任一项的脂质体制剂，其中多分散性指数是0.20或者更低。
20.一种用于制备根据权利要求17-19任一项的脂质体制剂的方法，包括如下步骤a.在有机溶剂中溶解所选择的脂质制备脂质混合物，b.将步骤a)的产物用含水的水合溶剂水合从而形成脂质体，c.在加入含水的水合溶剂之前，或在加入含水的水合溶剂之后，除去步骤a)的有机溶剂。
21.权利要求20的方法，其中在加入水合溶剂之前除去有机溶剂。
22.权利要求20-21任一项的方法，进一步包括超声处理脂质体制剂的步骤，以制备具有特定尺寸的脂质体。
23.权利要求20-22任一项的方法，其中水合溶剂含有浓度为0.ImM-ImM的二价阳离子。
24.权利要求20-23任一项的方法，进一步包括将外部水相改变为另一含有浓度 0. ImM-ImM 二价阳离子的外部水相的步骤。
25.权利要求20-M任一项的方法，其中二价阳离子是Ca2+。
全文摘要
本发明提供脂质体，其用于将诸如治疗剂的生物学活性物质的递送。其中，本发明的脂质体能够在磷脂酶A2分泌活性增加的位点(sPLA2)递送其有效载荷，因为磷脂酶A2(PLA2)将水解脂质体的脂质。因此，本发明的脂质体可例如用于与癌症相关的治疗。本发明的另一方面是含有本发明脂质体的脂质体制剂。再一个方面是制备本发明的脂质体制剂的方法。
文档编号A61K33/24GK102065840SQ200980118892
公开日2011年5月18日 申请日期2009年5月25日 优先权日2008年5月23日
发明者A·F·维克布耶尔, F·梅兰德, J·R·亨里克森, K·约恩森, S·A·彼得森 申请人:微脂体医药有限责任公司