专利名称：高纯度10－羟基喜树碱的化学半合成工艺的制作方法
技术领域：
本发明属化工和医药技术领域，具体涉及一种以20(s)-喜树碱为原料半合成10-羟基喜树碱的生产工艺。
背景技术：
喜树碱(Camptothecin，CPT)，淡黄色针状结晶，分子式C20H16N2O4，分子量348.3，结构式见下图 喜树碱喜树碱是1966年由美国学者Wall等人从我国特有树种喜树(Camptotheca acuminata)中提取得到的生物碱，具有独特的抗癌疗效，但毒副作用较大，限制了喜树碱的临床应用。因此，既保持喜树碱的抗癌活性又具有较低毒性的喜树碱衍生物一直以来就是人们关注的热点。
10-羟基喜树碱(10-Hydroxycamptothecin，HCPT)，黄色棱柱状结晶，分子式C20H16N2O5，分子量364.3，结构式见下图 10-羟基喜树碱10-羟基喜树碱的化学结构与喜树碱相似，仅是10位上的氢被羟基取代，是喜树碱的天然衍生物。经临床试验证明，在治疗肿瘤方面比喜树碱具有更好的疗效和较小的毒副作用。如今，10-羟基喜树碱在许多国家已获得广泛临床使用，此外，它还是已获FDA(美国食品及药物管理局)批准临床应用的喜树碱类抗肿瘤药物CPT-11(Rinotecan，用于治疗直肠和结肠癌)和TPT(Topotecan，用于治疗卵巢癌)的半合成前体化合物。
目前，10-羟基喜树碱的制备方法主要有三种由喜树中提取，以喜树碱为原料经过生物转化法或者化学半合成制备10-羟基喜树碱。
祖元刚的发明专利“10-羟基喜树碱高效生产方法”(申请号CN 03111557.8)，涉及到从喜树种芽提取10-羟基喜树碱的方法。技术方案是喜树种子经负压空化混旋破壁、消毒，去除杂质，水培发芽，种芽与提取溶剂混合，匀浆固液萃取、过滤，负压空化混旋固液萃取，过滤，浓缩，负压空化混旋液液萃取，重结晶或硅胶柱层析，得10-羟基喜树碱。此发明虽在专利“生产10-羟基喜树碱和喜树碱原料得加工方法”(申请号CN02132410.7)和“促进喜树种子芽内10-羟基喜树碱生产得方法”(申请号CN02132922.2)的基础上有较大改进，应用了负压空化混旋破壁，匀浆萃取，负压空化混旋固液和液液萃取技术，但受限于天然10-羟基喜树碱在植物体内的极低含量，仅为十万分之一，采用提取法工业生产10-羟基喜树碱会对喜树资源造成很大的破坏。此外，该工艺还存在着提取、分离工艺比较复杂，产品得率较低等缺点。
由于喜树碱在喜树中的含量比10-羟基喜树碱高许多，加之喜树碱的提取工艺已取得较大改进，天然喜树碱的价格易于为人们接受，因此以喜树碱为原料制备10-羟基喜树碱在工业上是可行的。
朱关平的发明专利“用生物转化法生产10-羟基喜树碱的方法”(申请号CN85100520A)，涉及用生物转化的方法，将喜树碱转化为10-羟基喜树碱。技术方案是以喜树碱为原料，通过黄曲霉菌株T-419生物转化，发酵液经填充大孔树脂提取，再将浓缩物于乙酸乙酯和甲醇中迥流。该方案采用黄曲霉T-419菌株，提高了生物转化率，具有一定的经济效益和发展潜力，但该工艺还不够成熟，存在着转化率较低，菌株培养技术要求高，分离步骤多等缺点。
相对于生物转化法，化学半合成方法简单，易于操作，在工业上应用的比较广泛。专利(US 4473692)介绍了一种以喜树碱为原料，经过N-氧化和光化学重排反应合成10-羟基喜树碱，具体路线如下
但是，该工艺仍然存在着一些不足，限制了其工业应用，如未考虑溶剂的回收问题，造成溶剂的大量浪费和环境污染；第二步反应影响因素多，产物得率不稳定，而且会生成一个难以与10-羟基喜树碱分离的副产物(见图3化合物c)，大大增加了分离的难度和成本。因此，研究一种更为清洁、高效的10-羟基喜树碱化学半合成工艺具有很大的经济和环境效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种溶剂可回收利用，反应副产物少，产品易分离、得率高、纯度高，生产成本低的10-羟基喜树碱的化学半合成工艺。
本发明提出的10-羟基喜树碱化学半合成工艺，是以N-氧化和光化学重排两步法半合成工艺为基础，对其存在问题进行优化改进而成。具体而言，以20(S)-喜树碱为原料，在浓度为50-80％的冰乙酸水溶液中通过双氧水氧化得到中间产物1-氧喜树碱；再在二噁烷、乙腈酸性体系下紫外灯照射20-50分钟，使1-氧喜树碱发生光化学重排转化为10-羟基喜树碱。反应得到的10-羟基喜树碱粗品，经过硅胶柱层析，得纯度在98.5％以上的10-羟基喜树碱纯品。其中每一步反应和分离所用到的试剂均可通过一定的处理后回收利用。与原有工艺相比，使用冰乙酸水溶液(乙酸浓度50～80％)代替原来的36％乙酸，用二噁烷、乙腈体系代替原来的二噁烷、乙腈和水体系，这样，不仅解决了溶液的回收问题，同时又降低了产物的分离难度，简化了分离程序，提高了生产效率，使10-羟基喜树碱的生产工艺更加成熟稳定。
具体步骤为(1)N-氧化将喜树碱溶解于冰乙酸水溶液中，在35-45℃时滴加30％的双氧水，在65-75℃温度下搅拌反应150-200分钟。减压浓缩蒸去乙酸，将残余液倒入冰水沉淀，在冰箱里静置，再过滤，烘干。其中，乙酸水溶液的体积浓度为50-80％，喜树碱与冰乙酸水溶液的重量比为1∶100-5∶100，双氧水与冰乙酸水溶液的体积比为1∶3-1∶7。
(2)光化学重排将上述得到的产品加入到二噁烷、乙腈混合溶液中，滴加浓硫酸后在高压汞灯光照20-35分钟。减压浓缩，将残余液倒入冰水中沉淀，过滤，烘干。其中，二噁烷与乙腈的体积比为4∶6-6∶4，浓硫酸的加入量为二噁烷、乙腈混合液体积的0.1-0.5％。
(3)硅胶层析柱分离常压玻璃硅胶层析柱，以硅胶填充。色谱柱高度为30～700mm，色谱柱直径30～180cm，硅胶粒径为100～300目，样品和硅胶的质量比为1∶50～1∶100。洗脱剂采用甲醇、乙酸乙酯、乙腈之一种与氯仿的混合溶液。干法上样后，用甲醇或乙酸乙酯或乙腈和氯仿的混合溶液淋洗，收集馏分。检测后合并相似的馏分，将10-羟基喜树碱含量超过98.5％的合并液经减压浓缩蒸干，真空干燥后即得到产品；将低于该含量的合并液，经减压浓缩在浓缩液中结晶，即有固体析出，把浓缩液放到冰箱静置10小时以上，再过滤、真空干燥后也可得到含量98.5％以上的产品。将所有的滤液蒸干，得到的固体可以和第二步反应粗品一起上样重新分离。
上述工艺中，所用的洗脱剂，甲醇和氯仿的体积比为5∶95～10∶90，乙酸乙酯和氯仿的体积比为30∶70-40∶60，乙腈和氯仿的体积比为3∶97～5∶95。
上述工艺中，蒸馏收集的乙酸溶液通过酸碱滴定确定浓度，再调整至所需浓度后直接用于下一次反应。蒸馏收集的二噁烷和乙腈通过比重法调整至所需体积比后直接用于下一次反应。收集的洗脱剂通过比重法调整至所需的体积比后直接用于下一次分离。
利用本发明生产10-羟基喜树碱，相比原有的化学半合成工艺，具有以下优点1、反应溶剂和洗脱液均可回收多次使用，不会降低产物的得率和纯度，既有利于减少对环境的污染，又节省了大量试剂，降低成本。
2、第一步反应采用高浓度的冰乙酸水溶液，相对于36％乙酸来说，相同条件下可使喜树碱的用量大大增加，提高了生产效率。
3、第二步反应在二噁烷、乙腈两组分溶剂体系中进行，仅有少量副产物，通过硅胶柱层析分离即可得到高纯度10-羟基喜树碱，同时两组分溶剂使回收利用变得可行。
4、98.5％以上的10-羟基喜树碱总得率超过35％，而市场上高纯度10-羟基喜树碱价格是喜树碱的10多倍，可以大规模工业化生产，经济效益非常可观。
所用的主要设备1)分析型高效液相色谱。美国惠普公司的Agilent 1100系列液相色谱，包括溶剂箱、四元梯度泵、真空脱气机、标准微量自动进样器、恒温柱温箱、可变波长检测器(VWD)。赛洋1.2G台式计算机(Agilent ChemStation 4.09.01色谱工作站)。日本SHISEIDO公司CAPCELL PAK C18分析色谱柱(4.6mm I.D.×250mm，5μm)。柱温35℃；使用HPLC级甲醇-水(体积比50∶50)的流动相；流速为1.0ml/min；喜树碱的检测波长是254nm，10-羟基喜树碱的检测波长是266nm；进样量10μl，柱压101～103bar。
2)LC/MS(液质联用)。Thermo Finnigan公司的LCQ ADVANTAGE MSSYSTERM，包括TSP高效液相色谱系统和LCQ ADVANTAGE质谱检测仪，Xcalibur1.0.01，MetaChem公司的Taxsi1-3柱(4.6mm I.D.×250mm，5μm)。质谱分析条件为电喷雾化学解离(ESI)和大气压化学电离(APCI)，ESI壳气为70单位，辅助气为15单位，源电压为6KV，加热毛细管温度为250℃，蒸发器温度为465℃。APCI壳气为65单位，辅助气为20单位，源电压为4.5KV，加热毛细管温度为350℃。
3)FTIR(傅立叶红外光谱检测)。NICOLET Avatar 360型FT-IR仪，ESP软件，Digital PII电子计算机控制。
4)核磁共振设备。Bruker DM 500Hz，DMSO内标。
其他仪器有上海申生科技有限公司R501型旋转蒸发仪；河南省巩义市英峪豫华仪器厂SHZ-C型循环水式多用真空泵；德国Sartorius BP211D型精密电子天平；上海市实验仪器总厂ZK-82A型真空干燥箱；法国Millipore公司的Milli-Q水纯化系统；上海司乐仪器厂85-1型磁力搅拌器；GGZ直管形紫外线高压汞灯。
图1为喜树碱、1-氧喜树碱、10-羟基喜树碱的质谱图。其中，(I)喜树碱的质谱图；(II)1-氧喜树碱的质谱图；(III)10-羟基喜树碱的质谱图；图2为实施例1中序号为I～V的反应产物的HPLC图谱。其中，(a)1-氧喜树碱。
图3为实施例2中序号为I～IV的反应产物的HPLC图谱。其中，(a)1-氧喜树碱；(b)10-羟基喜树碱；(c)反应副产物(仅I中存在，保留时间与b十分接近)；(d)喜树碱；未标物质为不影响分离的其他副产物。
图4为实施例3中编号为I～VI馏分的HPLC图谱。其中，(a)1-氧喜树碱；(b)10-羟基喜树碱；(c)喜树碱；(d)光照反应副产物；未标明物质为其他副产物，含量很少。
图5为10-羟基喜树碱的红外光谱图。
图6为10-羟基喜树碱的13C NMR图谱。
图7为10-羟基喜树碱的1H NMR图谱。
具体实施例方式
实施例1将喜树碱(10、15或20g)分别在30℃下溶解于1000ml溶液中(36％醋酸；或冰乙酸∶水＝70∶30，V∶V；或是回收后已经调整的溶液)。在40℃时缓慢滴加30％双氧水200ml，迅速升温至70℃，搅拌状态下反应3h。减压浓缩蒸去乙酸(约残余50ml)，将残余液倒入500ml冰水沉淀，在冰箱里静置12h。过滤，放入真空干燥器烘干，称重。各个反应的产物得率、HPLC纯度见表1。
减压浓缩收集到的乙酸水溶液通过酸碱滴定(0.5M NaOH作标准溶液，酚酞指示剂)测出乙酸浓度，然后添加适量的乙酸或水，调整乙酸浓度后用于下一次反应。
喜树碱和1-氧喜树碱的质谱鉴定见图1，反应产物的HPLC分析结果见图2。
表1实例1各反应产物中1-氧喜树碱的得率和HPLC纯度
实施例2将实施例1中得到的黄色产品2.50g加入到装有2500ml二噁烷、乙腈或者水混合溶液的石英杯中，搅拌溶解，滴加浓H2SO45ml，高压汞灯(灯管与杯壁距离2～5cm)光照30min，得到棕黄色溶液。减压浓缩至有固体出现，将残余液倒入4500ml冰水中沉淀12h。过滤，真空烘干，称重。10-羟基喜树碱的质谱鉴定见图1，各个反应产物的得率、HPLC纯度见表2，对应产物的HPLC分析图谱见图3。
体积比50∶50的二噁烷和乙腈溶液的比重为0.875，减压浓缩收集到的溶剂可添加适量的二噁烷或乙腈直至比重调整到0.875，即可用于下一次反应。
表2实例2各反应产物中10-羟基喜树碱的得率和HPLC纯度
实施例3取2500g干燥硅胶(200～300目)，装入φ150×700mm的玻璃层析柱中，填料高度为20cm。称取实施例2中得到的10-羟基喜树碱粗品48.49g，采用干法上样，以5％的甲醇-氯仿溶液淋洗，用500ml的试剂瓶收集淋洗液，依次编号为1～298。对这些馏分先进行TLC检测，大致确定各物质的出峰顺序和分布范围。检测后发现未反应的1-氧喜树碱和喜树碱以及反应副产物先被淋洗下来，然后是10-羟基喜树碱，而编号大于30的馏分以10-羟基喜树碱为主。为了说明各物质在馏分中的含量变化趋势，将编号9～15、16～18、19～23、24～25、26～31、32～35的馏分分别合并，标以I、II、III、IV、V、VI。将合并液减压浓缩后，把浓缩液放入冰箱静置12h，抽滤，烘干。分别取适量固体进行HPLC检测，结果见图4。
编号为36～298的馏分，每十瓶合并，各取10ml合并液进行HPLC检测，将10-羟基喜树碱含量超过98.5％的合并液减压浓缩蒸干，真空干燥后即得到产品；将低于该含量的合并液减压浓缩至刚好有固体析出，把浓缩液放到冰箱静置12h，过滤，真空干燥后也可得到含量98.5％以上的产品。而滤液蒸干后得到的固体可以和第二步反应粗品一起上样重新分离。
5％甲醇-氯仿溶液的比重为1.430，减压浓缩收集到的溶剂可添加适量的甲醇或氯仿将比重调整到.430，即可循环使用。
权利要求
1.一种高纯度10-羟基喜树碱的化学半合成工艺，其特征在于以20(S)-喜树碱为原料，在浓度为50-80％的冰乙酸水溶液中通过双氧水氧化得到中间产物1-氧喜树碱；再在二噁烷、乙腈酸性体系下用紫外灯照射20-35分钟，使1-氧喜树碱发生光化学重排转化为10-羟基喜树碱；反应得到的10-羟基喜树碱粗品，经过硅胶柱层析，得纯度在98.5％以上的10-羟基喜树碱纯品。
2.根据权利要求1所述的化学半合成工艺，其特征在于喜树碱原料与冰乙酸水溶液的重量比为1∶100-5∶100，双氧水与冰乙酸水溶液的体积比为1∶3-1∶7。
3.根据权利要求1所述的化学半合成工艺，其特征在于光化学反应混合溶剂二噁烷和乙腈的体积比4∶6-6∶4。
4.根据权利要求1所述的化学半合成工艺，其特征在于硅胶柱层析中，10-羟基喜树碱粗品与胶硅的质量比为1∶50-1∶100。
5.根据权利要求1或4所述的化学半合成工艺，其特征在于硅胶色谱柱分离10-羟基喜树碱所用洗脱剂为甲醇、乙酸乙酯、乙腈之一种和氯仿的混合溶液。
6.根据权利要求5所述的化学半合成工艺，其特征在于甲醇和氯仿的体积比为5∶95～10∶90，乙酸乙酯和氯仿的体积比为30∶70-40∶60，乙腈和氯仿的体积比为3∶97～5∶95。
7.根据权利要求1所述的化学半合成工艺，其特征在于硅胶柱层析中，10-羟基喜树碱含量超过98.5％的馏分合并，经减压蒸馏、干燥后得到98.5％以上的纯品；低于该含量的馏分合并，经减压浓缩、在浓缩液中结晶后，也得到98.5％以上的纯品。
8.根据权利要求1所述的化学半合成工艺，其特征在于蒸馏收集的乙酸溶液通过酸碱滴定确定浓度，再调整至所需浓度后直接用于下一次反应。
9.根据权利要求1所述的化学半合成工艺，其特征在于蒸馏收集的二噁烷和乙腈通过比重法调整至所需体积比后直接用于下一次反应。
10.根据权利要求1所述的化学半合成工艺，其特征在于收集的洗脱剂通过比重法调整至所需的体积比后直接用于下一次分离。
全文摘要
本发明为一种高纯度10－羟基喜树碱的化学半合成工艺，它以20(s)－喜树碱为原料，经过优化的N－氧化和光化学重排反应，产物经硅胶柱层析，即得到高纯度的10－羟基喜树碱。本工艺操作条件简便，反应试剂可回收利用，生产成本低，10－羟基喜树碱产品收率高，产物易分离，纯度达98.5％，符合国家药检标准。
文档编号C07D491/00GK1583751SQ200410024909
公开日2005年2月23日 申请日期2004年6月3日 优先权日2004年6月3日
发明者陈建民, 陆华, 吴蓓莉, 陈明兴 申请人:上海中城生物工程有限公司