专利名称：一种含有汗腺的组织工程皮肤模型的构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学皮肤模型的组织工程技术领域，涉及一种更接近人类皮肤 结构的含有汗腺的组织工程皮肤及其构建方法。
背景技术：
皮肤作为覆盖和保护体表的重要组织器官，容易受到外伤、烧伤、炎症、溃疡、肿瘤 术后及先天疾病等因素的损害。组织工程皮肤的出现为创面修复领域研究提供了一种新 的治疗途径，目前，已经有多种皮肤产品问世，并用于临床治疗，取得了一定疗效。然而，组 织工程皮肤距离真正理想的永久性皮肤替代物尚存有一定差距。尤其是目前的技术方法并 不能在组织工程皮肤中构建出皮肤的附属器结构，如毛囊、汗腺、皮脂腺等。而这些结构在 皮肤创伤修复和重建过程中又起着至关重要的作用。因此，如何建立含有皮肤附属器的更 接近天然皮肤的三维模型是亟待解决的问题之一。尤其是汗腺组织，具有分泌汗液、排泄废 物、调节体温和皮肤动态平衡的作用，汗腺的缺失会导致大量汗液不能排出体外，滞留在肌 肉内刺激疤痕结缔组织增生，严重影响皮肤损伤的愈合质量。2001年2月6日伍津津等人申请的专利(申请号01107099. 4)以及2002年9月 2日金岩等人申请的专利(申请号02139398. 2)都涉及组织工程皮肤的制备，以上发明包 括各种溶液配制、胶原凝胶制备以及细胞三维培养。所构建的组织工程皮肤在结构上与人 体皮肤类似，既具有表皮层和真皮层，但由于缺乏皮肤附件而不能达到真正的皮肤重建，因 此尚未拥有正常皮肤的全部生物学功能。而且以上发明均未说明制备组织工程皮肤时的各 种细胞比例，不能明确在组织工程皮肤模型中细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用等。 细胞外基质成分作为功能活性区域，与细胞的分化紧密关联并调控细胞的分化方向；同时， 细胞的生长增殖等亦依赖于微环境的改建。然而以往的发明并未涉及细胞外基质的作用和 微环境对细胞的影响。我们早在2000年开始进行汗腺再生的实验研究，建立了汗腺细胞的 分离培养和鉴定体系，证明了汗腺再生在皮肤创伤愈合过程中起到重要的作用。因此，构建 一种含有汗腺的组织工程皮肤替代物，可推动具有皮肤附属器的全功能组织工程皮肤的发 展。
发明内容
本发明的目的之一是针对现有组织工程皮肤的不足，提供一种更接近天然皮肤的 含有汗腺的组织工程皮肤。本发明的目的之二是提供上述皮肤模型的制备方法。包括以下 步骤a)作为细胞微载体和生长因子释放载体的微球制备，采用具有良好的生物相 容性并含多种细胞外基质成分的明胶作为构建载体的主要天然基质，制备完成后复合 EGF (0. 25-0. 5 μ g EGF/g 微球)；b)分离并培养汗腺细胞，用免疫组织化学方法鉴定，抗_CEA、CK8、CK18、CK19抗体 染色阳性；
c)将所述微球载体和培养的汗腺细胞进行复合共培养。优选地，进行接种微球的汗腺细胞的密度为5X103-lX104/cm2。所述的共培养为 5-7 天。d)将经共培养得到的汗腺细胞微载体复合体与胶原凝胶混合，并与通过分离培养 得到的皮肤表皮细胞及成纤维细胞按照三维构建的方式进行培养；优选地，汗腺细胞微载体复合体与表皮细胞及成纤维细胞按照三维构建的方式进 行培养的时间为15-20天。e)对所构建的组织工程皮肤作形态学观察，进行HE染色，观察所构建的皮肤结构 以及汗腺形成情况；用免疫组织化学法检测所构建的组织工程皮肤中汗腺标志物的表达。
图1为三维培养的复合汗腺组织工程皮肤模型的HE染色照片。图2为所构建皮 肤模型的免疫组化染色照片，其中抗-CEA (a)、CK8 (b)、CK18 (c)、CK19 (d)抗体染色阳性。
具体实施例方式以下本发明以具体实施例的方式具体阐述发明。本领域技术人员可以理解的是， 以下的实施例是为了阐述发明，而非限定本发明的发明的范围。实施例实施例1作为细胞微载体和生长因子释放载体的微球制备微型载体构建采用含多种细胞外基质成分的明胶作为构建载体的主要天然基 质，明胶微载体具有很好的细胞亲和性，能与多种细胞自然配位结合，促进细胞贴壁生长同 时承载细胞外基质成分。制备方法如下取0. aiil span-80，用30ml液体石蜡充分搅拌均 勻后倒入三口烧瓶中，于50°C高速搅拌。将质量分数为20%的明胶水溶液真空抽气泡， 取4. 5mL缓慢滴加入到三口瓶中，调节搅拌速度至450r/min，搅拌lOmin，溶液变得浑浊， 形成乳状液后在保持搅拌速度不变条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于5°C，继续搅拌 15min，缓慢滴加25%的戊二醛0. 1ml，在450r/min下继续搅拌浊。加入12ml丙酮，搅拌 :3min后静置，待溶液分层后，可以看到制备出的淡黄色微球沉淀在最下层，倒掉溶液后将微 球泡在IOml丙酮溶液中，于5°C固化Mh。取出微球后用lmol/L的氨基乙酸浸泡30min，除 掉未反应的戊二醛。用丙酮、异丙醇、二次水反复洗涤，有机溶剂挥发后得到淡黄色粉末状 明胶微粒载体。将的EGF溶液(0. 25 μ g/ μ 1)滴加在冻干明胶微球上(0. 25-0. 5 μ g EGF/ g微球)，在室温下保持30min以使EGF完全融入微球。灭菌封存。实施例2汗腺细胞的分离培养及鉴定取约0. 3cmX2.0cm的全层正常皮肤，置于含有青霉素(100U/ml)和链霉素 (100yg/ml)的人平衡盐溶液中反复漂洗，去除皮下脂肪，在60mm培养皿中将皮肤剪成 Imm3左右的小块，加入含有II型胶原酶Omg/ml)、胎牛血清(5% )、青霉素(100U/ml)和链 霉素(lOOyg/ml)的DMEM液:3ml，置37°C、5% C02、饱和湿度孵箱中过夜。次日在清洁的、 紫外线消毒的50X倒置相差显微镜下挑取汗腺组织，置37°C、5% CO2、饱和湿度条件下培 养。汗腺培养液以DMEM作为基础培养液，补加胎牛血清(5% )、重组人表皮生长因子(IOng/ ml)、三碘甲状腺原氨酸Qng/ ml)、半琥珀酰氢化可的松(0. 4 μ g/ml)、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(lml/100ml)(以上试剂均购于Gibco)及青霉素(100U/ml)、链霉素(100 μ g/ ml)。待人汗腺细胞贴壁后，补加约2ml汗腺培养液继续培养，以后每2 3d换液一次。待 细胞达80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，给予爬片检测。按前述的细胞固定及免疫细 胞化学法行CK19和癌胚抗原(CEA)检测。实施例3微球载体与汗腺细胞进行复合共培养取灭菌封存的微球载体用DMEM浸泡24h后，平铺于12孔板中，加入含10%胎牛 血清的DMEM培养液，将原代培养的汗腺细胞以5X IO3-IX IOVcm2密度接种于微粒载体置 37°C,5% CO2孵箱中复合培养5-7天。实施例4含有汗腺的三维皮肤模型构建取生长状态良好的细胞，将真皮成纤维细胞以IX 107/ml的密度与提取自小牛皮 的I型胶原3ml混合(胶原浓度8mg/ml，混合前加入含10%胎牛血清的DMEM，充分混勻，调 节PH到7. 4)，同时将表皮细胞和汗腺细胞载体复合物(与真皮成纤维细胞按1 2比例密 度)以注射方式导入胶原凝胶，37°C孵育凝固后加入培养液培养3天；在其表面以2 X IO6/ ml密度接种表皮细胞继续培养3天，将复合细胞的胶原凝胶移至气液面进行器官培养1 2周即获得复合汗腺的组织工程皮肤。
权利要求
1.一种构建组织工程皮肤模型的方法，其特征在于所述的方法是以组织工程化方法和 微载体技术为手段，在体外将皮肤表皮细胞、成纤维细胞、汗腺细胞以及生物支架材料复合 构建出具有汗腺结构的组织工程皮肤模型的方法，包括以下步骤a)作为细胞微载体和生长因子释放载体的微球制备；b)分离并培养汗腺细胞，用免疫组织化学方法鉴定出抗_CEA、CK8、CK18、CK 19抗体 染色阳性的细胞；c)将所述微球载体和培养的汗腺细胞进行复合共培养；d)将经共培养得到的汗腺细胞微载体复合体与胶原凝胶混合，并与通过分离培养得到 的皮肤表皮细胞及成纤维细胞按照三维构建的方式进行培养；e)对所构建的组织工程皮肤作形态学观察，进行HE染色，观察所构建的皮肤结构以及 汗腺的形成情况；用免疫组织化学法检测所构建的组织工程皮肤中汗腺标志物的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的微球载体的制备方法是由机体可接 受的生物可降解材料制备而成。
3.根据权利要求2所述地方法，其特征在于所述的生物可降解材料包括明胶、胶原、透 明质酸、壳聚糖、藻酸盐、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的任一种或几种的结合。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的微球载体粒径为100-500μ m。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的微球所复合的生长因子包括表皮细 胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(酸性aFGF ；碱性bFGF)、血小板源内皮细胞生 长因子(PD-ECGF/PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β (TFG-β)以及细胞因 子和细胞外间质来源的信号等的任一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的细胞为自体/同种异体来源的成体 细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的汗腺细胞在微球载体上的接种密度 为 5 X IO3-I X 104/cm2。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于所述的皮肤汗腺细胞表皮细 胞成纤维细胞的比例为1 1 2。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的汗腺细胞与微球载体的复合培养时 间为5-7天。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的汗腺细胞微载体复合体与表皮细 胞及成纤维细胞按照三维构建的方式进行培养的时间为15-20天。
全文摘要
本发明涉及分子生物学组织工程皮肤研究领域。具体说来，本发明涉及一种运用组织工程化方法在体外建立含有表皮层、真皮层以及汗腺结构的三维皮肤模型的方法。
文档编号A61L27/40GK102091352SQ200910253998
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者付小兵, 盛志勇, 黄沙 申请人:中国人民解放军总医院第一附属医院