专利名称：一种含有完全皮肤附属器的组织工程皮肤的构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学皮肤模型的组织工程技术领域，涉及一种新一代更接近人类皮肤结构的含有完全皮肤附属器的组织工程皮肤及其构建方法。
背景技术：
皮肤作为覆盖和保护体表的重要组织器官，容易受到外伤、烧伤、炎症、溃疡、肿瘤术后及先天疾病等因素的损害。组织工程皮肤的出现为创面修复领域研究提供了一种新的治疗途径，目前，已经有多种皮肤产品问世，并用于临床治疗，取得了一定疗效。然而，组织工程皮肤距离真正理想的永久性皮肤替代物尚存有一定差距。尤其是目前的技术方法并不能在组织工程皮肤中构建出皮肤的附属器结构，如毛囊、汗腺、皮脂腺等。而这些结构在皮肤创伤修复和重建过程中又起着至关重要的作用。因此，如何建立含有皮肤附属器的更接近天然皮肤的三维模型是亟待解决的问题之一。 2001年2月6日伍津津等人申请的专利(申请号01107099.4)以及2002年9月2日金岩等人申请的专利(申请号02139398. 2)都涉及组织工程皮肤的制备，以上发明包括各种溶液配制、胶原凝胶制备以及细胞三维培养。所构建的组织工程皮肤在结构上与人体皮肤类似，既具有表皮层和真皮层，但由于缺乏皮肤附属器而不能达到真正的皮肤重建，因此尚未拥有正常皮肤的全部生物学功能。而且以上发明均未说明制备组织工程皮肤时的各种细胞比例，不能明确在组织工程皮肤模型中细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用等。细胞外基质成分作为功能活性区域，与细胞的分化紧密关联并调控细胞的分化方向；同时，细胞的生长增殖等亦依赖于微环境的改建。然而以往的发明并未涉及细胞外基质的作用和微环境对细胞的影响。我们在2009年申请的专利(申请号200910253998.5)涉及了含有汗腺的组织工程皮肤的构建方法，未涉及到其他皮肤附属器的组织工程皮肤构建，然而各种皮肤附属器的共生关系和相互间的协同作用是组织工程皮肤发挥功能作用的关键。因此，构建一种含有完全皮肤附属器的组织工程皮肤替代物，可推动仿生化功能性组织工程皮肤的发展。
发明内容
本发明的目的之一是针对现有组织工程皮肤的不足，提供一种更接近天然皮肤的含有完全皮肤附属器的新一代组织工程皮肤。本发明的目的之二是提供上述皮肤模型的制备方法。包括以下步骤a)作为细胞微载体和生长因子释放载体的微球制备，采用具有良好的生物相容性并含多种细胞外基质成分的明胶作为构建载体的主要天然基质,制备完成后复合生长因子以维持皮肤附属器细胞生长增殖状态，或者体外诱导成体干细胞生成皮肤附属器细胞(O. 25-0. 5 μ g生长因子/g微球)；b)分离并培养毛囊细胞、汗腺细胞、皮脂腺细胞或者经过体外诱导能够生成皮肤附属器细胞的成体干细胞，将所述微球载体和培养的各种细胞进行复合共培养5-7天，进行接种微球的细胞的密度为5 X IO3-I X IOVcm2 ；c)将经共培养得到的毛囊细胞、汗腺细胞、皮脂腺细胞微载体复合体或经过体外诱导已生成各种皮肤附属器细胞的成体干细胞与已接种皮肤表皮细胞及成纤维细胞的胶原凝胶混合(皮肤附属器细胞表皮细胞成纤维细胞的比例为I : I : 2)，并按照三维构建的方式进行培养15-20天；d)对所构建的组织工程皮肤作形态学观察，进行HE染色，观察所构建的皮肤结构以及毛囊细胞、汗腺细胞、皮脂腺等皮肤附属器生成情况；用免疫组织化学法检测所构建的组织工程皮肤中皮肤附属器标志物的表达。
图I为三维培养的复合完全皮肤附属器的组织工程皮肤模型HE染色照片(a)，其中抗-CK5 (b)、CK14 (c)免疫荧光染色呈阳性表达。
具体实施例方式以下本发明以具体实施例的方式具体阐述发明。本领域技术人员可以理解的是，以下的实施例是为了阐述发明，而非限定本发明的发明范围。实施例实施例I微球载体与各种皮肤附属器细胞进行复合共培养取灭菌封存的微球载体用DMEM浸泡24h后，平铺于12孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，将原代培养的毛囊细胞、汗腺细胞、皮脂腺细胞分别以5X IO3-IX IO4/cm2密度接种于微粒载体置37°C、5% CO2孵箱中复合培养5_7天。实施例2含完全皮肤附属器的三维皮肤构建取生长状态良好的细胞，将表皮细胞与真皮成纤维细胞以IXioVml的密度与提取自小牛皮的I型胶原3ml混合(胶原浓度8mg/ml，混合前加入含10%胎牛血清的DMEM，充分混匀，调节PH到7. 4)，同时将和毛囊细胞、汗腺细胞、皮脂腺细胞载体复合物(比例为1:1:1)以注射方式导入胶原凝胶(皮肤附属器细胞总和表皮细胞成纤维细胞的比例为I : I : 2)，37°C孵育凝固后加入培养液培养3天；将复合细胞的胶原凝胶移至气液面进行器官培养I 2周即获得含完全皮肤附属器的组织工程皮肤。
权利要求
1.一种构建含有全部皮肤附属器的全层三维皮肤模型的方法，其特征在于所述的方法是以干细胞和再生医学与组织工程化技术方法为手段，在体外将皮肤全层包括皮肤附属器(毛囊、汗腺、皮脂腺)的所有类型细胞以及生物支架材料复合构建出具有与正常皮肤结构形态相似皮肤的方法，包括以下步骤 a)作为细胞微载体和生长因子释放载体的微球制备； b)分离并培养皮肤表皮、真皮以及皮肤附属器细胞，或者经过体外诱导能够生成皮肤附属器细胞的所有成体干细胞(包括来自于自体、同种异体等)； c)将所述微球载体和培养的不同细胞分别进行复合共培养； d)将经共培养得到的各种细胞微载体复合体按你不同比例与接种表皮细胞和真皮细胞的含基质成分的凝胶混合，并按照三维模式继续培养； e)对所构建的组织工程皮肤作形态学观察，进行HE染色，观察所构建的皮肤结构以及各种皮肤附属器细胞的形成情况；用免疫荧光染色法检测所构建的组织工程皮肤中皮肤附属器细胞标志物的表达。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的微球载体的制备方法是由机体可接受的生物可降解材料制备而成。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的生物可降解材料包括明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、藻酸盐、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的任一种或几种的彡口口
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的微球载体粒径为100-500μ m。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的微球所复合的生长因子包括表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(酸性aFGF ;碱性bFGF)、血小板源内皮细胞生长因子(ro-ECGF/TOGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β (TFG-β)以及细胞因子和细胞外间质来源的信号等的任一种或几种的组合。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的细胞为自体/同种异体来源的成体细胞，包括所有皮肤来源细胞和成体干细胞等，其特征在于所述的细胞在微球载体上的接种密度为 5X103-1 X 104/cm2。
7.根据权利要求I所述的方法，含基质成分的凝胶包括明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、藻酸盐等天然高分子材料所制备的凝胶。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于所述的皮肤附属器细胞表皮细胞成纤维细胞的比例为I : I : 2。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的各种皮肤附属器细胞(或经过体外诱导能够生成皮肤附属器细胞的成体干细胞)与微球载体的复合培养时间为5-7天。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的皮肤附属器细胞微载体复合体与表皮细胞及成纤维细胞按照三维培养方式进行复合培养的时间为15-20天。
全文摘要
本发明涉及分子生物学组织工程皮肤研究领域。具体说来，本发明涉及一种运用组织工程化方法在体外建立含有全部皮肤附属器的全层三维皮肤的方法。
文档编号C12N5/071GK102949752SQ20111024942
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者黄沙, 付小兵 申请人:中国人民解放军总医院第一附属医院