专利名称：粉末状蛋白质组合物及其制备方法
粉末状蛋白质组合物及其制备方法相关申请本申请要求于2008年1月15日提交的美国临时专利申请号61/021，298的优先 权利益，所述美国临时专利申请号各自的内容在此整体引入本文作为参考。
背景技术：
药物蛋白质制剂的基本原理是必须克服一定的不稳定性。蛋白质的降解途径可以 分成2个不同类别，涉及化学不稳定性和物理不稳定性。化学不稳定性导致通过键形成或 切割的蛋白质修饰。化学不稳定性问题的例子包括脱酰胺、外消旋化、水解、氧化、β消除和 二硫键交换。另一方面，物理不稳定性不导致蛋白质中的共价改变。相反，它们涉及蛋白质 的高级结构(二级及以上)中的改变。这些包括变性、与表面吸附、聚集和沉淀。Manning 等人，Pharm. Res. 6,903 (1989)。在通过Watson和Crick (1953)的DNA结构发现以及随后的人类基因组测序计划 完成后，对蛋白质化学作用的兴趣增长得非常快速。在疾病、组织或发育中基因及其蛋白质 Zfe 白勺另白勺。Nextgeneration pharmaceutical, Issue 6 (GDS publishing Ltd.，2006)。在介于其间的数十年期间，基于蛋白质的药物数目增加得非常快速。今天，特 定蛋白质或肽可以得到分离或合成、修饰且递送用于减轻或治愈特定病症和疾病。关于基 于蛋白质的药物的主要应用途径仍是液体制剂的静脉内注射，但其他途径也已进行测试且 使用。已付出诸多努力以将蛋白质溶液转变成固体形式。粉末状组合物提供许多优点， 例如通过涉及少得多的空间和重量可以贮藏或转运更大量的蛋白质，并且能量消耗低于在 贮藏和运送过程中使液体制剂冷却所需的能量消耗。粉末状组合物还促进新的递送途径， 例如吸入(Tzannis等人，国际公开号WO 2005067898)、或无针注射(Burkoth，The Drug Delivery Companies Report 76-78(2001))。几种方法已用于由蛋白质水溶液产生粉 末，其中有喷雾干燥、喷雾-冷冻干燥、冷冻干燥、或由超临界流体或(部分)有机溶液沉 淀。winters 等人，Journal of Pharm. Sci. 85(6) :586_594 (1996)。与非常昂贵且费时的 冷冻干燥形成对比，喷雾干燥是产生蛋白质装载固体的有效的、高效的方法，这提供了开发 关于生物药物(biopharmaceuticals)的新递送形式例如吸入的机会。Maa等人，Pharm. Res. 16(2) 249-254(1999)。使纯蛋白质溶液喷雾干燥有引起部分失活的风险，这自动导致较低品质的药剂。 失活可以例如通过过程相关的物理应力引起，所述物理应力是由于高温、剪切应力和大相 界面(液体/气体)例如变性或聚集，或通过化学反应例如水解或氧化引起。发明概述本发明涉及用于使包括蛋白质和赋形剂的蛋白质制剂喷雾干燥的方法。具体而 言，本发明的方法和组合物基于其中使包含目的蛋白质和赋形剂的溶液喷雾干燥的喷雾干 燥过程。本发明的制剂具有超过标准溶液和冷冻干燥制剂的许多优点。特别地，本发明的 喷雾干燥方法使过程相关的降解降到最低，并且增加在环境温度下的蛋白质稳定性(例
5如，与冷冻干燥组合物相比较)。此外，喷雾干燥制剂也更易于运输，并且用于制造高浓度制 剂、改善蛋白质的生物利用率、和开发局部释放(例如，肺递送)和持续释放(例如，脂质体 和(D，L-丙交酯-乙交酯共聚物)PLGA包被的小球体)制剂。本发明的方法和组合物可以用于提供包括任何目的蛋白质和赋形剂的稳定的粉 末状组合物或制剂。在一个方面，本发明的方法和组合物用于抗体及其片段，包括用于体内 和体外目的的那些。在进一步的实施方案中，抗体片段是免疫球蛋白G(IgG)片段。此外，制备蛋白质和肽制剂所必需的多步纯化和浓缩过程通常引入组合物中的变 异性，从而使得制剂的精确组成可能在批次到批次之间变动。联邦法令要求不管制造场所 或批号，药物组合物在其制剂中高度一致。本发明的方法可以用于生成赋形剂以精确量加 入其中的蛋白质的粉末状制剂，从而允许生成具有赋形剂的精确浓度的蛋白质制剂。在一个方面，本发明提供了用于制备蛋白质或肽粉末的方法，其包括使包含超过 约50mg/mL蛋白质或肽和至少一种赋形剂的溶液喷雾干燥，从而制备蛋白质或肽粉末。在 一些实施方案中，溶液包括超过约lOOmg/mL蛋白质或肽。蛋白质还可以是双重可变结合结 构域(DVD)结合蛋白质。在一些实施方案中，该方法包括制备抗体粉末，其包括使包含超过约50mg/mL抗 体或其抗原结合部分和至少一种赋形剂的溶液喷雾干燥，从而制备抗体粉末。在一些实 施方案中，溶液包括超过约lOOmg/mL抗体或其抗原结合部分。抗体或其抗原结合部分可 以是免疫球蛋白G(IgG)，例如MAK 195F、阿达木单抗(Adalimumab)、ABT-325、ABT-308或 ABT-147。在一些实施方案中，粉末在环境温度和湿度下稳定至少3个月和/或在40°C下稳 定至少3个月。赋形剂可以包括例如海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一种氨基酸、组氨 酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或其混合物。在一些实施方案中，溶液包括约0.27 1.0至约 2.8 1.0、约 0.27 1.0 至约 1.4 1.0、约 0.27 1. 0 至约 0. 7 1. 0 的赋形剂蛋 白质比、或约0.7 1.0的比。在一些实施方案中，溶液包括约20至约30mM赋形剂、或约 25mM赋形剂。在一些实施方案中，该方法包括用约100°C至约180°C的入口空气温度(Tin)和约 6o°c至约iio°c的出口空气温度(T。ut)的喷雾干燥。在特定实施方案中，该方法包括用约 130°C的Tin和约80°C的T。ut的喷雾干燥。该方法可以包括例如使溶液雾化以形成溶液小 滴，用气体使小滴干燥以形成粉末，并且从气体中回收粉末。该方法可以包括用压力喷嘴雾 化器使溶液雾化和/或用旋风分离器(cyclone)从气体中分离且回收抗体粉末。该方法还可以包括使抗体粉末包埋在药学上可接受的载体中。药学上可接受的载 体可以是对于肠胃外、经口、经肠和/或局部施用可接受的。药学上可接受的载体可以包括 液体例如水。在另一个方面，本发明涉及根据本文描述的任何一种方法制备的药物制剂，其包 括有效量的抗体或其抗原结合部分。在另外一个方面，本发明涉及根据本文描述的任何一 种方法制备的药物制剂，其包括有效量的蛋白质或肽。在另外一个方面，本发明提供了包括蛋白质或肽和赋形剂的稳定的粉末状组合 物，其中所述组合物包括小于约6%的残留水分，在一些实施方案中，小于约4%或3%的残 留水分。蛋白质或肽可以包括抗体或其抗原结合部分，例如IgG抗体或其抗原结合部分，例如MAK 195F、阿达木单抗、ABT-325、ABT-308或ABT-147。蛋白质还可以是双重可变结合结 构域(DVD)结合蛋白质。在一些实施方案中，粉末状组合物在环境温度和湿度下稳定至少3个月和/或在 40°C下稳定至少3个月。在一些实施方案中，蛋白质或肽、或抗体或其抗原结合部分，保留 其生物活性。赋形剂可以包括海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、至少一种氨基酸、组氨酸、 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或其混合物。组合物可以具有约0.27 1.0至约2. 8 1.0、约 0.27 1.0至约1.4 1.0、约0.27 1.0至约0.7 1.0、或约0.7 1的赋形剂(例如， 海藻糖和/或蔗糖)与抗体或其抗原结合部分的质量比。组合物可以具有约0.27 1.0至 约 2. 8 1.0、约 0.27 1.0 至约 1.4 1.0、约 0.27 1. 0 至约 0. 7 1.0、约 0.7 1 或约0.35 1的赋形剂(例如，山梨糖醇)与抗体或其抗原结合部分的质量比。在另外一个方面，本发明提供了制造药物组合物的方法，其包括使有效量的本发 明的稳定的粉末状组合物与药学上可接受的载体例如液体例如水混合。在一些实施方案 中，药物组合物适合于肠胃外、经口、经肠或局部施用。该方法可以进一步包括在显著高于 环境温度的温度下加工稳定的粉末状组合物(例如，熔体挤出)，而不显著影响粉末状组合 物的稳定性。在特定实施方案中，该方法包括例如用聚合物例如PLGA包被粉末状组合物，以形 成持续释放或延迟释放的药物组合物。另外或可替代地，该方法可以包括用肠溶衣包被。在 一些实施方案中，蛋白质、肽、抗体或其抗原结合部分的活性通过赋形剂针对经由有机溶剂 的沉淀、变性或氧化进行保护，所述有机溶剂例如PEG 400、乙醇、DMSO、NMP或冰乙酸。目前，几乎所有公司都使用冷冻的大量药物(bulk drug)组合物，并且面临问题例 如冻融条件的再现性、赋形剂在大量药物物质内出乎意料的结晶、缓冲液在冷冻过程中的 PH改变、和由于解冻例如在约37°C温度下的2升容器的长滞后时间。使用喷雾干燥的大量 药物组合物可以避免这些问题。此外，喷雾干燥的大量药物组合物在最终药物产品组合物 的配料过程中非常便于处理，并且允许制造广泛的浓度范围。此外，其中仅添加水的喷雾干 燥的药物组合物可以代替传统配料，并且因此降低药物产品制造过程中的风险同时增加输 出能力。此外，与单克隆抗体(mAb)片段相比较，全长/完全抗体可能更不易于物理降解。 另外，随着蛋白质浓度增加直至100mg/mL，一般存在很少的物理或化学降解中的增加或无 增加。因为更高浓度的溶液将增加过程的效率，所以lOOmg/mL蛋白质浓度的使用将是有利 的。附图简述通过参考与附图结合的下述详述，可以更充分地理解本文公开的方法和组合物的 这些及其他特征和优点，其中
图1描述了如在实施例中使用的BUchi喷雾干燥器B-191 ；图2描述了不同山梨糖醇-MAK混合物的得率和Tg ；图3描述了不同山梨糖醇-MAK混合物的聚集、结晶度和含水量；图4提供了山梨糖醇-MAK混合物3000x的扫描电镜术(SEM)图像 (a)25mM(b) IOOmM ；图5描述了不同海藻糖-MAK混合物的得率和Tg ；
图6描述了不同海藻糖-MAK混合物的聚集、结晶度和含水量；图7提供了海藻糖混合物(3000x)的SEM图像(a) IOmM海藻糖；(b) IOOmM海藻糖 和(c)纯海藻糖喷雾干燥的；图8描述了不同蔗糖-MAK混合物的得率和Tg ；图9描述了不同蔗糖-MAK混合物的聚集、结晶度和含水量；图10描述了关于喷雾干燥的MAK 195F制剂的尺寸排阻层析(SEC)物理稳定性数 据(A)山梨糖醇、海藻糖和蔗糖对蛋白质聚集量的作用和(B)稳定剂浓度对蛋白质聚集量 的作用；和图11描述了加工和3个月贮藏(A)对溶于200mM海藻糖溶液的喷雾干燥的高浓 度MAK 195F、阿达木单抗和ABT-325物理稳定性的作用和(B)对其化学稳定性的作用。发明详述I.定义为了使本发明可以更容易理解，首先定义了特定术语。如本文所使用的，术语“酸性组分”指具有酸性pH即小于7. 0的试剂，包括溶液。 酸性组分的例子包括磷酸、盐酸、乙酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、苹果酸、乙醇酸 和延胡索酸。如本文所使用的，术语“抗氧化剂”意指这样的试剂，其抑制氧化或充当抗氧化剂 增效剂，并且因此用于预防通过氧化过程的制剂变质。此种化合物包括例如但不限于，α生 育酚(维生素Ε)、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、柠檬酸、丁化羟基苯甲醚、丁化羟基甲苯、 依地酸(EDTA，依地酸盐)及其盐、氢亚磷酸(hydrophosphorous acid)、苹果酸、一硫代甘 油、丙酸、桔酸丙酯、甲硫氨酸、抗坏血酸钠、柠檬酸钠、硫化钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚 硫酸氢钠和本领域普通技术人员已知的其他化合物。除非本文另有说明，否则术语“组合物”和“制剂”可互换使用。术语“赋形剂”指可以加入制剂中的试剂，以提供所需一致性例如改变堆积性能 (bulk property)，改善稳定性和/或调整重量摩尔渗透压浓度。常用赋形剂的例子包括但 不限于，稳定剂、糖、多元醇、氨基酸、表面活性剂、螯合剂和聚合物。如本文所使用的，术语“药物”就组合物例如水制剂而言时，是对于治疗疾病或病 症有用的那种。术语“蛋白质”意欲包括关于其链长足以产生更高水平的二级和/或三级和/或四 级结构的氨基酸序列。这与不具有此种结构的“肽”或其他小分子量分子区分。在本文使 用的定义内包括的蛋白质的例子包括治疗蛋白质。“治疗活性蛋白质”或“治疗蛋白质”指 可以用于治疗目的的蛋白质，即用于治疗受试者中的病症。应当指出尽管治疗蛋白质可以 用于治疗目的，但本发明并不限于此种用途，因为蛋白质还可以用于体外研究。在优选实施 方案中，治疗蛋白质是融合蛋白或抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，本发明的方 法和组合物包括至少2种不同的蛋白质，其定义为具有不同氨基酸序列的2种蛋白质。另 外的不同蛋白质不包括蛋白质的降解产物。术语“蛋白质粉末”指包括根据本发明的喷雾干燥法制备的蛋白质的组合物。“抗 体粉末”指包括本发明的喷雾干燥法制备的抗体或其抗原结合部分的组合物。术语“药物制剂”指这样的制剂，其处于此种形式，以便允许活性成分的生物活性
8是有效的，并且因此可以施用于受试者用于治疗用途。术语“溶液”指至少一种赋形剂或蛋白质或肽在液体内的混合物。溶液可以包括 在液体内溶解的蛋白质分子、胶态溶解的蛋白质分子、分散的蛋白质聚集物或晶体或沉淀 物或悬浮液，或其组合。“稳定的”组合物是其中蛋白质在加工过程中和/或在贮藏后例如基本上保留其物 理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的组合物。用于测量蛋白质稳定性的各种分析 技术是本领域可用的，并且在例如P印tide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编辑,MarcelDekker, Inc. ,New York,N. Y. ,Pubs. (1991)禾口 Jones,A. Adv. DrugDelivery Rev. 10:29-90(1993)中综述。在一个实施方案中，蛋白质的稳定性根据溶液中的单体蛋白 质百分比进行测定，具有低百分比的降解的(例如，断裂的)和/或聚集的蛋白质。例如， 包括稳定蛋白质的水组合物可以包括至少95%单体蛋白质。可替代地，本发明的水组合物 可以包括不超过5%聚集物和/或降解的蛋白质。术语“稳定剂”指改善或以其他方式增强稳定性的赋形剂。稳定剂包括但不限 于α-硫辛酸，α-生育酚，棕榈酸抗坏血酸酯，苯甲醇，亚硫酸氢盐，硼，丁化羟基苯甲醚 (ΒΗΑ)，丁化羟基甲苯(BHT)，抗坏血酸及其酯，类胡萝卜素，柠檬酸钙，乙酰-L-肉碱，螯合 剂，软骨素，硫酸软骨素，柠檬酸，辅酶Q-10，EDTA(乙二胺四乙酸；依地酸二钠)，异抗坏血 酸，延胡索酸，桔酸烷基酯，葡糖胺(壳聚糖、透明质酸钠)，苹果酸，偏亚硫酸氢盐，桔酸丙 酯，亚硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，亚硫酸钾，酒石酸，硫代硫酸盐，硫甘油，生育酚 及其酯，例如生育酚乙酸酯、生育酚琥珀酸酯、生育三烯酚(tocotrienal)、d-α-生育酚乙 酸酯，维生素C及其酯，维生素E及其酯，例如维生素E乙酸酯，及其组合。如本文所使用的，术语“张力调节剂”意指可以用于调整液体制剂的张力的一种或 多种化合物。合适的张力调节剂包括甘油、乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、氯化钠、硫酸镁、氯化 镁、硫酸钠、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖和本领域普通技术人员已知的其他。在 一个实施方案中，液体制剂的张力接近血液或血浆的张力。如本文所提及的，术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结 合部分”)或单链。“抗体”指一般包括通过二硫键互联的至少2条重(H)链和2条轻(L) 链的糖蛋白，或其抗原结合部分。术语“抗体”还包括其分离的天然存在的变体。每条重链 由重链可变区(本文缩写为Vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和Ch3 组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VJ和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结 构域Q组成。V1^nt区可以进一步再分成高变区，称为互补性决定区(CDR)，点缀着更保守 的称为构架区(FR)的区域。每个Vh和\由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基 末端以下述顺次排列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重和轻链的可变区包含与抗 原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一 种组分(Clq)。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)指保留与 抗原(例如，TNFa、IL-12、IL-13)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。抗体的抗原 结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。在术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合 片段的例子包括(i)Fab片段，由^11、(^和011结构域组成的单价片段；出汗妯')2片段，包括在铰链区由二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和Cm结构域组成 的Fd片段；(iv)由抗体单臂的\和Vh结构域组成的Fv片段，(ν)由Vh或\结构域组成的 dAb 片段(ward 等人，(1989)Nature 341 :544_546)；禾口 (vi)分离的互补性决定区(CDR)。 此外，尽管Fv片段的2个结构域\和Vh由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过 合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中\和Vh区配对 以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988) Science242 :423_426 ； 和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :5879_5883)。此种单链抗体也意欲包 括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术 获得，并且片段与完整抗体相同的方式就效用进行筛选。在本发明的一个实施方案中，抗体 片段选自Fab、FcUFd'、单链FV(scFV)、scFVa和结构域抗体(dAb)。再进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其 他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大的免疫粘附分子的部分。这些其他蛋白质或 肽可以具有这样的功能性，其允许纯化抗体或其抗原结合部分，或允许其与彼此或其他分 子结合。因此，此种免疫粘附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区的使用，以制备四聚
(scFv) ^ψ (Kipriyanov^A (1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6 93-101)，和半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标记的使用，以制备二价和生物素化 的 scFv 分子(Ki priyanov 等人(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。抗体部分例如 Fab 和F(ab' )2片段可以使用常规技术由完整抗体进行制备，例如分别地完整抗体的木瓜蛋 白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获 得。当2个抗体结构域属于形成关联对或组的结构家族或者衍生自此种家族且保留 这个特征时，它们是“互补的”。例如，抗体的Vh结构域和\结构域是互补的；结构 域不是互补的，并且2个\结构域不是互补的。互补结构域可以在免疫球蛋白超家族的其 他成员中发现，例如T细胞受体的V α和νβ (或γ和δ)结构域。术语“结构域”指不依赖于蛋白质的其余部分保留其三级结构的折叠蛋白质的结 构。一般地，结构域负责离散的蛋白质功能性质，并且在许多情况下可以添加、去除或转移 给其他蛋白质，而不丧失蛋白质和/或结构域的剩余部分的功能。单抗体可变结构域意指 包括抗体可变结构域的序列特征的折叠的多肽结构域。它因此包括完整抗体可变结构域和 修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已用并非抗体可变结构域特有的序列替换，或 已截短或包括N或C末端延长的抗体可变结构域，以及保留全长结构域的至少部分结合活 性和特异性的可变结构域的折叠片段。本发明的可变结构域可以组合以形成结构域组；例如互补结构域可以组合，例如 八结构域与Vh结构域组合。非互补结构域也可以组合。结构域可以以许多方式组合，涉及 通过共价或非共价方式的结构域连接。“dAb”或“结构域抗体”指特异性结合抗原的单抗体可变结构域(Vh或多肽。如本文所使用的，术语“抗原结合区”或“抗原结合部位”指抗体分子或其抗原结 合部分的一个或多个部分，其包含与抗原相互作用的氨基酸残基，并且赋予抗体其对于抗 原的特异性和/或亲和力。术语“表位”意指在一个或多个抗体的抗原结合区处能够由抗体识别且由抗体结
10合的任何分子的部分。在本发明的背景中，第一个和第二个“表位”应理解为并不相同且不 由单个单特异性抗体或其抗原结合部分结合的表位。短语“重组抗体”指通过重组方法制备、表达、生成或分离的抗体，例如使用转染到 宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体，从重组、组合抗体文库中分离的抗体，从对于人免 疫球蛋白基因是转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor等人(1992) Nucl. AcidsRes. 20 :6287_6295)，或通过任何其他方式制备、表达、生成或分离的抗体，所述 任何其他方式涉及特定免疫球蛋白基因序列(例如，人免疫球蛋白基因序列)剪接至其他 DNA序列。重组抗体的例子包括嵌合、⑶R嫁接和人源化抗体。术语“人抗体”指具有相应于或衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的 抗体，如由例如Kabat等人描述的(参见Kabat，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH
发明者G·李, H-J·克劳泽, M·西德勒, M·阿德勒, P·拉斯纳 申请人:雅培股份有限两合公司