酪氨酰-trna合成酶多肽的血小板生成活性的制作方法

专利名称：酪氨酰-trna合成酶多肽的血小板生成活性的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及血小板生成组合物，该组合物包含酪氨酰-tRNA合成酶多肽， 包括其截短体和/或变体，以及涉及利用这种组合物治疗疾病或疾病状态的方法，所述疾 病或疾病状态受益于增加的血小板生成，诸如与血小板减少症有关的疾病或疾病状态。
背景技术：
血小板减少症一般涉及其中个体的每单位体积外周血的血小板数目低于正常的 疾病状态。例如，正常血小板计数一般为约150，OOOmm3至约450，OOOmm3,而血小板减少症 的特征通常为血小板计数降低到约100，000/mm3或更少。血小板(Platelets)或凝血细胞(thrombocytes)是无色的血细胞，其在血液凝集 中通过聚集在一起和在血管洞形成栓塞而发挥重要作用。血小板生成指血小板从前体造血 细胞诸如巨核细胞形成的过程。血小板生成主要受促血小板生成素的调节，促血小板生成 素进一步受多种机制调节，诸如应答增加的血小板水平时受体介导的摄取和破坏等。血小板减少症与许多潜在的因素有关，诸如增加的血小板的破坏、减少的血小板 产生、血小板的消耗、血小板的诱捕，以及药剂诱发的血小板减少症。考虑到血小板在血凝 中的中心作用，血小板减少症的最初症状通常包括多种形式的出血和紫癜。因为个体处于 增加的出血风险中，早期诊断和治疗是重要的，特别是阻止进展为更为严重的症状，诸如脑 出血。降低的血小板计数的疾病状态的治疗通常受病因学和疾病严重度指导。目前可用 的用于血细胞减少症以及相关疾病状态的治疗包括，例如，皮质类固醇类、IVIG、脾切除术 和血小板输注，这些方法是减轻性非特异的，或者是强烈的但昂贵的。此外，以前利用血小 板生成的主要生物介质促血小板生成素的努力在临床上没有取得成功，因为在患者观察到 严重效应，所述患者产生了对该药物的免疫反应，以及随后产生对他们自己的内源性促血 小板生成素的免疫反应。促血小板生成素模拟物和促血小板生成素受体的小分子激活剂在 开发中，但尚未得到食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批准。
催化tRNA分子的氨酰化的氨酰-tRNA合成酶在翻译过程中对于解码遗传信息是 必不可少的。在高等真核生物中，氨酰-tRNA合成酶与其他多肽结合以形成超分子多酶复 合物。每种真核生物的tRNA合成酶由核心酶和另外的结构域组成，核心酶与对应的原核 tRNA合成酶密切相关，所述另外的结构域附加在核心酶的氨基末端或羧基端。例如，人酪氨酰-tRNA合成酶(YRS)具有羧基末端结构域，其不是原核生物和低等真核生物的YRS分子 的一部分。氨酰tRNA合成酶，诸如酪氨酰-tRNA合成酶，目前与哺乳动物细胞内的扩展功能 有关，包括信号转导通路中的活性等。发明概述本发明源自以下意想不到的发现包含酪氨酰-tRNA合成酶(YRS)多肽的组合物， 包括其截短的和/或变异的多肽，刺激体内血小板生成(即增加血小板形成)。因此，本发 明的实施方案一般可以用于治疗和/或降低发展为与血小板减少症或降低的血小板水平 有关的疾病或疾病状态。某些实施方案包括增加个体内血小板计数的方法，其包括给予个体包含血小板生 成有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽的组合物，由此增加个体内的血小板计数。某些实 施方案包括治疗个体血小板减少症或降低个体发展为血小板减少症的风险的方法，其包括 给予个体包含血小板生成有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽的组合物，由此治疗个体的 血小板减少症或降低个体发展为血小板减少症的风险。某些实施方案包括刺激个体的血小 板生成的方法，包括给予个体包含血小板生成有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽的组合 物，由此刺激个体的血小板生成。某些实施方案包括维持个体(例如，经历与降低的血小板 计数有关的治疗的个体)的血小板计数的方法，其包括给予个体包含血小板生成有效浓度 的酪氨酰-tRNA合成酶多肽的组合物，由此维持个体的血小板计数。某些实施方案包括刺激个体的巨核细胞迁移、增殖和/或分化的方法，其包括给 予个体血小板生成有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，由此刺激个体的巨核细胞增殖和 /或分化。某些实施方案包括刺激个体的嗜中性细胞迁移或增殖的方法，其包括给予个体血 小板生成有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，由此刺激个体的嗜中性细胞增殖。在某些方面，个体患与降低的或减少的血小板计数有关的疾病或疾病状态，或者 处于患与降低的或减少的血小板计数有关的疾病或疾病状态的风险中。在某些方面，个 体具有约100，000/mm3或更低的、约110，000/mm3或更低的、约120，000/mm3或更低的、约 130，000/mm3或更低的、约140，000/mm3或更低的、或者约150，000/mm3或更低的血小板计 数。在某些实施方案中，与降低的或减少的血小板计数有关的疾病或疾病状态包括，但不限 于出血、瘀伤、鼻衄(鼻出血)、脾功能亢进、低体温、Epstein-Barr病毒感染、传染性单核 细胞增多症、Wiskott-Aldrich综合征、母源性噻嗪类药物摄入、先天性缺巨核细胞性血小 板减少症、血小板减少-桡骨缺失综合征、范科尼贫血(Fanconi Anemia)、巨大血小板综合 征(Bernard-Soulier syndrome)、May_Hegglin 畸形(May-Hegglin anomaly)、灰白血小板 综合征(Grey platelet syndrome)、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、新生儿风疹、再 生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、白血病、淋巴瘤、骨髓的肿瘤、癌症、营养缺乏、放射接 触、肝功能衰竭、细菌性脓毒症、麻疹、登革热、HIV感染或AIDS、早熟、胎儿成红细胞增多症 (erythroblastosis fetalis)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、母源性ITP、溶血尿毒症综 合征、弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜、系统性红斑狼疮、 类风湿性关节炎、新生儿同种免疫血小板减少症、和阵发性睡眠性血红蛋白尿症、丙型肝炎 病毒感染(HCV)、药剂诱发的的血小板减少症、和化疗诱发的血小板增多症(CIT)，以及本 领域已知的其他疾病。在某些方面，个体是血小板供者。
在某些实施方案中，与降低的或减少的血小板计数有关的疾病状态是由药剂或 药品诱发的(例如，药剂诱发的血小板减少症、化疗诱发的血小板增多症)。降低血小板 计数的药剂或药品可以选自化疗剂、非留体抗炎剂、磺胺类药、万古霉素、氯吡格雷、糖蛋 白Ilb/IIIa抑制剂、干扰素、丙戊酸、阿昔单抗、利奈唑胺(linezolid)、法莫替丁、美贝 维林(mebeverine)、组胺阻断剂、烷化剂、肝素、乙醇和抗生素。在某些实施方案中，化疗 剂可以选自顺钼(CDDP)、卡钼(carboplatine)、甲基苄胼(procartazine)、氮介、环磷酰 胺、喜树碱、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝 基尿、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素、普卡霉素 (plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP 16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉 酚、吉西他滨、长春瑞宾、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反钼(transplatinUm)、5-氟尿嘧啶、 长春新碱、长春花碱和甲氨蝶呤、Temazolomide (DTIC水性形式)，或者前述的任一类似物 或衍生物变体。在要求保护的方法的某些实施方案中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含哺乳动物酪 氨酰-tRNA合成酶，包括在它的C末端截短的哺乳动物酪氨酰-tRNA合成酶。在本文提供的 某些方法中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序 列，其中约1-50个氨基酸残基从它的C末端截去。在本文提供的某些方法中，酪氨酰-tRNA 合成酶多肽包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中约50-100个氨基酸 残基从它的C末端截去。在某些实施方案中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID N0:1, 2,3,6,8,10，12或14的氨基酸序列，其中约100-150个氨基酸残基从它的C末端截去。在 其他实施方案中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO 1，2，3，6，8或10的氨基酸序列， 其中约150-200个残基从它的C末端截去。在其他实施方案中，本文提供的方法包括其中 酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO 1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中约200-250 个氨基酸残基从它的C末端截去。C-末端截短的酪氨酰-tRNA合成酶多肽的特定实例包括 如下的多肽其包含或由SEQ ID NOS :1，2或3所示的氨基酸序列的氨基酸1-343、氨基酸 1_；344、氨基酸1-350、氨基酸1-353或氨基酸1-364组成。C-末端截短的酪氨酰-tRNA合 成酶多肽的另外实例包括SEQ ID NOS 3和8的多肽。在本发明方法的某些实施方案中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含在其N-末端截 短的哺乳动物酪氨酰-tRNA合成酶。在本文提供的某些方法中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中约1-50个氨基酸残基从它的 N-末端截去。在本文提供的某些方法中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO =1,2,3, 6,8,10，12或14的氨基酸序列，其中约50-100个残基从它的N末端截去。在某些实施方 案中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其 中约100-150个氨基酸残基从它的N-末端截去。在其他实施方案中，酪氨酰-tRNA合成酶 多肽包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中约150-200个残基从它的N-末 端截去。在其他实施方案中，本文提供的方法包括其中酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中约200-250个氨基酸残基从它的N-末端截去。 N-末端截短的酪氨酰-tRNA合成酶多肽的特定实例包括SEQ ID NOS :6，10，12和14的多 肽。在本文提供的某些方法中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽选自(a)包含与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列至少80%—致的氨基酸序列的多肽，其中在341位的丙氨酸不被酪 氨酸取代；(b)包含与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列至少90% —致的氨基酸序列的多 肽，其中在341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(c)包含与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列 至少95%—致的氨基酸序列的多肽，其中在341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(d)包含与 SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列至少98%—致的氨基酸序列的多肽，其中在341位的丙 氨酸不被酪氨酸取代；以及(e)包含SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的多肽。在本文提供的某些方法的实施方案中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽选自(a)包含与 SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的氨基酸序列至少80% —致的氨基酸序列的多 肽；(b)包含与SEQ ID而1，2，3，6，8，10，12或14中所示的氨基酸序列至少90%—致的氨 基酸序列的多肽；(c)包含与SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的氨基酸序列至少 95%—致的氨基酸序列的多肽；(d)包含与SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的氨 基酸序列至少98%—致的氨基酸序列的多肽；以及(e)包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12 或14中所示的氨基酸序列的多肽。除了本文所描述的方法外，本发明的某些实施方案包括适合用于给药的组合物， 其包含本文所描述的生理学上可接受的赋形剂和/或载体，以及血小板生成有效浓度的酪 氨酰-tRNA合成酶多肽。其中，该组合物能够刺激血小板生成(例如，增加或维持个体的血 小板计数)、刺激巨核细胞增殖和/或分化、和/或刺激个体的嗜中性细胞增殖。在某些组 合物中，如上文和本文其他位置所描述的，酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含在它的C-末端截 短的哺乳动物酪氨酰-tRNA合成酶。在某些组合物中，如上文和本文其他位置所描述的，酪 氨酰-tRNA合成酶多肽包含在它的N-末端截短的哺乳动物酪氨酰-tRNA合成酶。在某些实施方案中，本文所描述的血小板生成组合物包含酪氨酰-tRNA合成酶多 肽，其选自(a)包含与SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列至少80%—致的氨基酸序列的 多肽，其中在341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(b)包含与SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序 列至少90%—致的氨基酸序列的多肽，其中在341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(c)包含与 SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列至少95%—致的氨基酸序列的多肽，其中在341位的丙 氨酸不被酪氨酸取代；(d)包含与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列至少98%—致的氨基 酸序列的多肽，其中在；341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；以及(e)包含SEQ ID NO :2中所示 的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，本文所描述的血小板生成组合物包含酪氨酰-tRNA合成酶多 肽，其选自:(a)包含与SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的氨基酸序列至少80% 一致的氨基酸序列的多肽；(b)包含与SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的氨基酸 序列至少90%—致的氨基酸序列的多肽；(c)包含与SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中 所示的氨基酸序列至少95%—致的氨基酸序列的多肽；(d)包含与SEQ ID N0:l，2，3，6，8， 10，12或14中所示的氨基酸序列至少98%—致的氨基酸序列的多肽；以及(e)包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14中所示的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，本发明的组合物还包含第二酪氨酰-tRNA合成酶多肽，包括 其中两个酪氨酰-tRNA合成酶多肽形成二聚体。在某些方面，该二聚体是同型二聚体。在其 他方面，该二聚体是异质二聚体，例如全长酪氨酰-tRNA合成酶多肽和截短的酪氨酰-tRNA 合成酶多肽之间的异质二聚体。在某些实施方案中，本发明的组合物还包含异源性多肽，其中酪氨酰-tRNA合成酶多肽和异源性多肽形成异质二聚体，例如双功能异质二聚体。在某些实施方案中，本文所提供的血小板生成组合物包含生理学上可接受的赋形 剂和/或载体，以及血小板生成有效浓度的嵌合的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，其中嵌合的多 肽包含酪氨酰-tRNA合成酶多肽的两个或更多个生物活性片段，其中所述两个或更多个片 段包含YRS多肽的至少10个连续的氨基酸，其中所述两个或多个片段相连接以形成嵌合的 多肽，以及其中嵌合的酪氨酰-tRNA合成酶多肽能够刺激个体的血小板生成和/或增加个 体的血小板计数。在某些实施方案中，本文所提供的血小板生成组合物包含生理学上可接受的赋形 剂和/或载体，以及血小板生成有效浓度的嵌合的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，其中嵌合的多 肽包含(a)酪氨酰-tRNA合成酶多肽的一个或多个生物活性片段，其中所述一个或多个片 段包含YRS多肽的至少10个连续的氨基酸；以及(b) —个或多个异源性多肽，其中(a)中 的一个或多个片段和(b)中的一个或多个异源性多肽相连接以形成嵌合的多肽，以及其中 嵌合的多肽能够刺激个体的血小板生成(即，增加或维持个体的血小板计数)、刺激巨核细 胞增殖和/或分化、和/或刺激个体的嗜中性细胞增殖。某些实施方案涉及刺激早期巨核细胞祖细胞增殖和/或分化的方法，其包括用酪 氨酰-tRNA合成酶多肽孵育造血干细胞的培养物足够的时间以允许早期巨核细胞祖细胞 的增殖，从而刺激早期巨核细胞祖细胞的增殖和/或分化。在某些实施方案中，离体或体外 实施该方法。在某些实施方案中，培养物从骨髓获得。在某些实施方案中，培养物从脐带血 获得。在某些实施方案中，这种方法还包括将所述细胞给予有需要的个体。某些实施方案涉及刺激表达CXCR-2的细胞迁移的方法，其包括，用酪氨酰-tRNA 合成酶多肽接触该细胞，从而刺激表达CXCR-2的细胞的迁移。在某些实施方案中，接触细 胞的步骤在体外或离体发生。在某些实施方案中，接触的步骤包括给予有需要的个体组合 物，该组合物包含有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽。某些实施方案涉及减轻个体的肺部炎症和/或其症状的方法，其包括给予个体有 效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，从而减轻个体的肺部炎症和/或其症状。在某些实施 方案中，个体有慢性阻塞性肺部疾病(COPD)。在某些实施方案中，酪氨酰-tRNA合成酶多肽 的给药对实现循环中的嗜中性细胞对变应原的脱敏是有效的。附图简述

图1显示了人酪氨酰-tRNA合成酶的全长氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。图2显示了全长人酪氨酰-tRNA合成酶的Y341A变体的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。图3显示了具有血小板生成活性的C-末端截短的(氨基酸1-364)人酪氨酰-tRNA 合成酶的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。图4显示了编码人酪氨酰-tRNA合成酶的全长氨基酸序列的多核苷酸序列(SEQ ID NO 4)。图5(a)和5(b)显示了截短的人酪氨酰_tRNA合成酶给药后对血小板数的体 内影响。对于图5(a)，给小鼠一天两次皮下注射1、3和10μ g/kg的C-末端截短的酪氨 酰-tRNA合成酶多肽(SEQ ID NO :3)，注射7天，所述多肽具有8氨基酸的C-末端标签 L-E-H-H-H-H-H-H(SEQ ID NO :5)，并在研究结束时确定血小板计数。对于图5(b)，给小鼠一天两次皮下注射3 μ g/kg的与图5 (a)相同的C-末端截短的多肽，注射7天，并在研究结 束时确定血小板计数。图6显示了具有8氨基酸C-末端标签L-E-H-H-H-H-H-H(SEQ ID NO 5)的C-末 端截短的人酪氨酰-tRNA合成酶多肽给药后对巨核细胞数目的体内影响。一天两次给动物 皮下注射3和300 μ g/kg的SEQ ID NO 3的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，注射6天并在研究 结束时检测骨髓和脾的组织学，所述多肽具有8氨基酸C-末端标签(SEQ ID NO :5)。图7显示了 SPl人酪氨酰-tRNA合成酶剪接变体的氨基酸序列(SEQ ID NO 6), 其表示了全长野生型YRS多肽序列的N-末端截短的变体。SPl剪接变体具有与野生型序列 没有序列相似性的8或9个N-末端氨基酸。“X"表示任意氨基酸。图8显示了编码SEQ ID NO 6的SPl人酪氨酰-tRNA合成酶多肽的核酸序列(SEQ ID NO 7)。图9显示了 SP2人酪氨酰-tRNA合成酶剪接变体的氨基酸序列(SEQ ID NO 8), 其表示全长野生型YRS多肽序列的C-末端截短的变体。SP2变体具有与野生型序列没有序 列相似性的35个C末端氨基酸。“X"表示任意氨基酸。图10显示了编码SEQ ID NO 8的SP2人酪氨酰-tRNA合成酶多肽的核酸序列(SEQ ID NO 9)。图11显示了 SP3人酪氨酰-tRNA合成酶剪接变体的氨基酸序列(SEQ ID NO 10)， 其表示全长野生型YRS多肽序列的N-末端截短的变体。图12显示了编码SEQ ID NO 10的SP3人酪氨酰-tRNA合成酶多肽的核酸序列 (SEQ ID NO :11)。图13显示了 SP4人酪氨酰-tRNA合成酶剪接变体的氨基酸序列(SEQ ID NO 12), 其表示全长野生型YRS多肽序列的N-末端截短的变体。图14显示了编码SEQ ID NO 12的SP4人酪氨酰-tRNA合成酶多肽的核酸序列 (SEQ ID NO 13)。图15显示了 SP5人酪氨酰-tRNA合成酶剪接变体的氨基酸序列(SEQ ID NO 14)， 其表示全长野生型YRS多肽序列的N-末端截短的变体。SP5变体具有与野生型序列没有相 似性的约8个N-末端氨基酸。“X"表示任意氨基酸。图16显示了编码SEQ ID NO 14的SP5人酪氨酰-tRNA合成酶多肽的核酸序列 (SEQ ID NO 15)。图17举例说明了野生型(WT)人酪氨酰-tRNA合成酶的可选择的基因剪接，如可 选择的剪接变体SPl至SP5的CDNA序列所表示的。图18提供了人酪氨酰-tRNA合成酶剪接变体SPl至SP5的cDNA序列的NCBI注释。图19描绘了与全长人YRS多肽相比，SPl至SP5 YRS多肽的预期和报告的开放读 码框架的蛋白序列比对。图20显示了 YRS多肽在大鼠中的血小板生成活性(参见实施例4)。图21显示了 M07e原巨核细胞应答YRS多肽刺激时的迁移(参见实施例5)。图22显示了酪氨酰-tRNA合成酶多肽促进THP-I细胞到HUVEC-2细胞的内皮单 层的细胞粘附(参见实施例6)。
图23显示了酪氨酰-tRNA合成酶多肽增加了粘附分子VCAM-I在HUVEC-2细胞的 内皮单层中的表达(参见实施例6)。图M显示了酪氨酰-tRNA合成酶多肽刺激转染了 CXCR-2受体的293和CHO细胞 系的迁移(参见实施例7)。图M的左图显示了 ^3/CXCR-2细胞的结果；以及图M的右 图显示了 CH0/CXCR-2细胞的结果。图25显示了 YRS多肽对多形核(PMN)细胞迁移的刺激作用(参见实施例8)。图沈显示了酪氨酰-tRNA合成酶多肽对骨髓细胞培养物中的巨核细胞祖细胞的 影响，如通过集落数目所测定的(参见实施例10)。图沈(A)显示了 YRS多肽对原始谱系限 制性祖细胞或早期祖细胞的集落形成的刺激作用，以及图26(B)和(C)分别显示了 YRS多 肽对相对成熟的中间祖细胞(B)和晚期祖细胞(C)的抑制作用。发明详述本发明涉及以下意想不到的发现包括其截短体和变体在内的酪氨酰-tRNA合成 酶(YRS)多肽能够模拟和刺激正常的血小板生成过程，并且因此具有治疗上有益的血小板 生成活性。因此，本发明的某些实施方案涉及使用YRS多肽刺激天然的血小板生成过程，并 且从而增加有需要的个体，诸如患有与血小板减少(例如，减少的血小板计数)有关的疾病 的个体的血小板产生。与其他治疗方法相比，使用YRS多肽的优势包括例如，不同于传统 治疗的作用机制，与促血小板生成素信号的协同作用，更高的效能，以及与使用去免疫性分 子有关的益处(例如，不受潜在的针对促血小板生成素不利的免疫应答的影响)。其他的优 势对本领域的技术人员是显而易见的。 除非特别相反地指明，本发明的实施可以利用本技术领域内的分子生物学和重组 DNA技术的常规方法，其中的许多方法出于示例的目的描述于下文。这些技术在文献中被充 分地解释。参见，例如 Sambrook, et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版，1989) ；Maniatis et al, Molecular Cloning :A Laboratory Manual(1982)； DNA Cloning :A Practical Approach, vol.I & II (D. Glover, ed. ) ；Oligonucleotide Synthesis(N. Gait, ed. ,1984) ；Nucleic Acid Hybridization(B. Hames & S.Higgins, eds. ,1985) ；Transcription and Translation (B.Hames & S.Higgins, eds. ,1984)； Animal Cell Culture(R. Freshney, ed.,1986) ；A Practical Guide to Molecular Cloning(B. Perbal, ed.，1984)。本文引用的所有的出版物、专利和专利申请都通过引用的方式以其整体并入。定义除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域所属技术人员所 通常理解的含义相同的含义。尽管在实施或检验本发明时可以使用与本文所述的相似或等 同的任何方法和材料，本文描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，如下定义以下术语。本文使用的冠词“a”和“an”指该冠词的一个或多个(即至少一个)语法对象。例 如，“an element”指一个元件或多个元件。所用“约”指与参考的量、水平、值、数、频率、百分比、尺度、尺寸、数额、重量或长度 多达30，25，20，25，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1 %不同的量、水平、值、数、频率、百分比、尺度、
尺寸、数额、重量或长度。
适用于参照多核苷酸或多肽序列的术语“生物活性片段”是指具有至少约0. 1， 0.5，1,2,5,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85， 90,95,96,97,98,99,100，110，120，150，200，300，400，500，600，700，800，900，1000 % 或更
多的参照序列活性的片段。下述的生物活性片段包含在本发明的范围内长度至少约18， 19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180， 200，220，240,260, 280，300，320，340，360，380，400或更多(包括两者之间的所有整数)个
连续的核苷酸或氨基酸残基的生物活性片段，其包含或编码参照多核苷酸或多肽的血小板 生成活性，例如参照多肽序列SEQ ID NOS =1,2,3,6,8,10，12和14，或参照核苷酸序列SEQ ID N0S:4，7，9，11，13和15。生物活性片段的特定实例包括但不限于C-末端截短的酪氨 酰-tRNA合成酶多肽，该酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含以下氨基酸或由以下氨基酸组成 SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列中的氨基酸1-343，氨基酸1_344，氨基酸1_350，氨基酸 1-353或氨基酸1-364，以及SEQ ID NOS 3和6的多肽。生物活性片段的其他实例包括但 不限于N-末端截短的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，该酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQ ID NOS 6,10，12和14中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NOS :6，10，12和14中所示的氨基酸 序列组成。代表性的生物活性片段通常参与相互作用，例如分子内的或分子间的相互作用。 分子间的相互作用可以是特异性结合相互作用或酶性相互作用。分子间的相互作用可以在 YRS多肽和靶分子之间，该靶分子诸如与调节血小板生成过程有关的靶分子。YRS多肽的生 物活性片段包括多肽片段，该多肽片段包含与SEQ ID N0S:1，2，3，6，8，10，12或14中的任 一个的氨基酸序列充分相似或一致的氨基酸序列，或衍生自SEQ ID NOS =1,2,3,6,8,10,12 或14中的任一个的氨基酸序列，包括其血小板生成有效的部分；或由SEQ ID NOS =4,7,9, 11，13和15的核苷酸序列编码。所用的“编码序列”是指有助于编码基因的多肽产物的任一核酸序列。与之相反， 术语“非编码序列”是指无助于编码基因的多肽产物的任一核酸序列。整个说明书中，除非上下文另外要求，词语“包含(comprise) ”、“包含 (comprises) ”、“包含(comprising) ”被理解为意指包括陈述的步骤或元素或者步骤或元素 的组，但不排除任何其他的步骤或元素或者步骤或元素的组。所用“由...组成(consisting of) ”指包括且限于跟随在词组“由...组成”后 的任何内容。因此，词组“由...组成”表明所列出的元素是必需的或强制的，以及可以不 存在其他元素。所用“基本上由...组成(consisting essentially of) ”指包括列在该词 组后的任何元素，并限于不妨碍或不促进在所列元素的公开内容中指明的活性或作用的其 他元素。因此，词组“基本上由...组成”表明所列元素是必需的或强制的，但其他元素是 任选的，可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。术语“互补的”和“互补性”是指碱基配对法则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。 例如，序列“A-G-T”和序列“T-C-A”是互补的。互补性可以是“部分的”，其中依照碱基配对 法则只有部分核酸的碱基是匹配的。或者，核酸之间可以有“完全的”或“全部的”互补性。 核酸链间的互补性程度对核酸链间的杂交的效率和强度具有重要的影响。所用的“对应(corresponds to) ” 或“对应(corresponding to) ” 是指(a)具有 与参照多核苷酸序列的全部或部分基本上一致或互补的核苷酸序列的多核苷酸，或者编码 与肽或蛋白中的氨基酸序列一致的氨基酸序列的多核苷酸；或者(b)具有与参照肽或蛋白中的氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列的肽或多肽。所用“衍生物”指通过修饰衍生自基本序列的多肽，例如通过与另外的化学部分的 结合或络合(例如，聚乙二醇化)或者通过本领域所理解的翻译后修饰技术。术语“衍生 物”在其范围内还包括对母体序列作出的改变，包括提供功能上等同分子的添加或删除。如本文所使用的，“功能”和“功能的”等术语是指生物学上的、酶的或临床上的功 能。所用的“基因”是指遗传单元，其位于染色体上的特定基因座，以及由转录的和/ 或翻译的调节序列、和/或编码区、和/或非翻译序列(即，内含子、5'和3'非翻译序列) 组成。“同源性”是指一致的或组成性保守取代的氨基酸的百分数。同源性可以利用诸如 GAP(Deveraux et al.，1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)的序列比对程序来确 定，其通过引用的方式并入本文。通过这种方式，可以通过在比对中插入空位来比较具有与 本文中所引用的序列相似或基本上不同的长度的序列，这种空位可以通过例如利用GAP的 比较算法来确定。术语“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养基，其可以是或已经是本发明的任一重 组体载体或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，且由于天然的、偶 然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的母代细胞完全一致(在形态学上 或在总DNA互补物中)。宿主细胞包括用本发明的重组体载体或多核苷酸在体内或体外转 染或感染的细胞。包含本发明的重组体载体的宿主细胞是重组体宿主细胞。所用“分离的”指基本上或实质上没有在其天然状态下通常伴随它的组分的物质。 例如，本文使用的“分离的多核苷酸”指其已经从天然存在状态中位于其侧面的序列中纯化 的多核苷酸，例如，从序列中离开的DNA片段，该序列通常邻近所述片段。可选地，本文所用 的“分离的肽”或“分离的多肽”等指肽或多肽分子从它天然的细胞环境中以及从与细胞的 其他组分的结合中体外分离和/或纯化，即，它不与体内物质结合。术语“从......获得”是指诸如例如，多核苷酸提取物或多肽提取物的样品从个
体的特定来源分离，或来自个体的特定来源。例如，提取物可以从直接分离自个体的组织或 生物流体获得。本文所用的术语“寡核苷酸”是指由经磷酸二酯键(或与其相关的结构变体或合 成的类似物)连接的多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或与其相关的结构 变体或合成的类似物)组成的多聚体。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常是指其中的核苷 酸残基及核苷酸残基间的键是天然形成的核苷酸多聚体，但也应该了解，各种类似物也包 含在该术语范围内，包括但不限于肽核酸(PNAs)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、 2-0-甲基核糖核酸等。分子的确切尺寸可以根据特定的应用改变。寡核苷酸在长度上通常 相当短，一般约为10 30个核苷酸残基。尽管术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大的 寡核苷酸，但术语“寡核苷酸”可以指任何长度的分子。本文中使用的术语“可操作地连接”指将结构基因置于启动子的调控下，然后该启 动子调控所述基因的转录和任选地翻译。在构建异源启动子/结构基因组合中，通常优选 地是将遗传序列或启动子置于距基因转录起始位点一定距离处，该距离近似等同于该遗传 序列或启动子与它在天然条件(即遗传序列或启动子起源的基因)中调控的基因之间的距离。如本领域已知的，可以允许该距离的一些变化，而没有功能的损失。类似地，调节序列元 件相对于置于其控制下的异源基因的优选定位由该元件在它天然条件(即它来源的基因) 中的定位限定。本文使用的叙述“多核苷酸”或“核酸”指代mRNA，RNA, cRNA, cDNA或DNA。该术 语通常指至少10个碱基长度的多聚形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型 的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。术语“多核苷酸变体”和“变体”等指下述多核苷酸展示了与参照多核甘酸序列或 在下文定义的严紧条件下与参照序列杂交的多核苷酸基本的序列一致性。这些术语还包括 通过至少一个核苷酸的添加、删除或取代区别于参照多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多 核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸被添加或删除，或者被另外的核苷酸取 代的多核苷酸。在这方面，本领域已知，可以对参照多核苷酸作出包括突变、添加、删除和取 代在内的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物功能或活性。多核苷酸 变体包括，例如，与SEQ ID NO :4所示的序列或其编码血小板生成性酪氨酰-tRNA合成酶多 肽的生物活性片段的部分具有至少50% (以及至少51%至至少99%和两者之间的所有整 数百分比)序列一致性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等 位变体。“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白”在本文交替使用，指氨基酸残基的聚合体以及 其变体和合成的类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天 然存在的氨基酸(诸如相应天然存在氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合体，以及适用于 天然存在的氨基酸聚合体。术语“酪氨酸RNA合成酶”和“酪氨酰-tRNA合成酶”在本文交替使用，指本发明 的“ YRS ”多肽。叙述的“YRS多肽”、“YRS多肽片段”、“截短的YRS多肽”或“其变体”包括，但不限 于具有与SEQ ID NOS :1，2，3，6，8，10，12或14的任一个所示的参照序列(包括其生物活 性片段，诸如具有参照序列至少 10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200 或更多个(包括两者之间的所有整数)的连续氨基酸)共享至少50% (和至少51%-至 少99%以及两者之间的所有整数百分比)序列一致性的氨基酸序列的多肽。这些叙述还包 括YRS多肽的天然等位变体，其可以存在和发生在一个种或属到另一个种或属。包括其截短体和/或变体在内的YRS多肽包括如下多肽其展示了参照YRS多肽 的至少约 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，110%，120%，130%， 140 %, 150%, 200%, 300 %, 400%, 500%, 600 %, 700%, 800%, 900 %，1000 % 或更大的特 异性生物活性(即，诸如具有个体内或体外的血小板生成活性)。出于本申请的目的，可以 通过测量YRS多肽增加个体的血小板计数或增加个体的巨核细胞数目(参见，例如实施例 1)的能力来定量YRS-相关的生物活性。此外，用于测量人血小板产生的合适的动物模型在 Suzuki et al,European Journal of Haemotology 78 :123_130，2007 中被描述，其通过弓| 用的方式并入本文。用于测量血小板生成活性的合适的体外模型被描述于实施例2中，并 且还包括测定巨核细胞集落形成，如Dessypris et al, Exp Hematol. 18 :754_7，1990中所 示例的。包括其截短体和/变体的YRS多肽是显示了低于野生型YRS的特异活性的约25%， 10%，5%或的那些，其与野生型参照YRS多肽相比，具有明显降低的生物活性。
叙述的多肽“变体”指通过至少一个氨基酸残基的添加、删除或取代区别于参照多 肽的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过可以是保守的或非保守的一个或多个取代与 参照多肽区分。在某些实施方案中，多肽变体包含保守性取代，在这方面，本领域熟知一些 氨基酸可以改变为具有广泛相似特性的另一些，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包 括其中一个或多个氨基酸被添加或删除、或者被另外氨基酸残基取代的多肽。本发明包括全长YRS多肽(例如，具有Y341A取代的全长多肽)的变体、全长YRS 多肽的截短的片段、截短的片段的变体以及它们相关的生物活性片段在本文所述方法中的 用途。典型地，YRS多肽的生物活性片段可以参与相互作用，例如，分子内或分子间的相互作 用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或者酶性相互作用(例如，相互作用可以 是暂时的，形成或打断共价键)。YRS多肽的生物活性片段包括包含氨基酸序列的多肽，所 述序列与(假定的)全长YRS多肽序列的氨基酸序列充分相似，或源自(假定的)全长YRS 多肽序列的氨基酸序列，诸如SEQ ID NO :1，或其部分，诸如SEQ ID NOS :3，6，8，10，12和14 的多肽。一般地，生物活性片段包含具有YRS多肽的至少一种活性的结构域或基序，并且可 以包括一个或多个(在一些情况下，是全部的)不同活性结构域，以及包括具有血小板生成 活性的片段。在一些情况下，YRS多肽的生物活性片段具有对于特定的截短的片段独特的 生物活性(例如，血小板生成活性)，这样使得全长YRS多肽可能没有该活性。在一些情况 下，生物活性可以通过将生物活性YRS多肽片段与其他的全长YRS多肽序列分离，或者通过 改变全长YRS野生型多肽序列的某些残基(例如，Y341A)以暴露血小板生成活性结构域而 被揭示。截短的YRS多肽的生物活性片段可以是多肽片段，其是，例如，SEQ ID NOS :1,2,3, 6,8,10,12 或 14 的任一个所示的氨基酸序列的 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170， 180，190，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380,400 或更多(包括两者之间的所有 整数)个连续的氨基酸。在某些实施方案中，生物活性片段包含血小板生成刺激序列、结构 域或基序。适宜地，该生物活性片段具有不低于其衍生的野生型多肽的活性的约1 %，10%， 25%，50%。本文所用的叙述“序列一致性”或者例如包含“与...50% —致的序列”指序列在 比较窗中基于一个一个核苷酸或基于一个一个氨基酸一致的程度。因此，“序列一致性百分 比”可以通过以下来计算比较两个在比较窗中最优比对的序列，确定相同的核酸碱基(例 如 A，T，C，G，I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala, Pro, Ser, Thr, Gly，VaI, Leu, He，Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg，His, Asp, GIu，Asn，Gin, Cys和Met)在两条序列中出现的位置的数目 以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗中总位置数(即，窗大小)，并将得到的 结果乘以100以得到序列一致性百分比。用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽间的序列关系的术语包括“参照序列”、 “比较窗”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”和“基本一致性”。“参照序列”是长度为至少 12个但通常是15至18个，经常是至少25个单体单位(包括核苷酸和氨基酸残基)。因为 两个多核苷酸各自可以包含(1)在两个多核苷酸间相似的序列(即，完整多核苷酸序列的 仅一部分)和( 在两个多核苷酸间不同的序列，两个(或更多个)多核苷酸间的序列比 较通常通过比较“比较窗”中的两个多核苷酸的序列来进行以鉴定和比较序列相似性的局 部区域。“比较窗”指至少6个连续位置、通常为约50至约100个、更通常约100至150个的连续位置的概念节段，其中在一序列与具有相同连续位置数的参照序列最优比对后，将 该序列与参照序列比较。比较窗可以包含与参照序列(其不包含添加或删除)相比约20% 或更少的添加或删除(即空位)用于两个序列的最优比对。用于比对比较窗的序列的最优 比对可以通过算法的计算机运行(Wisconsin遗传学软件包发行版7. 0 (Genetics Software Package Release 7. 0)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison，WI，USA)或通过目测以及选择的各种方法的任一种产生的最 佳比对(即，产生整个比较窗的最高同源性百分比)来实施。例如Altschul et al,1997, Nucl. Acids Res. 25 :3389公开的BLAST程序家族也可以作为参考。可以在Ausubel et al, “ Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley & Sons Inc,1994-1998, 第15章的19. 3单元中找到序列分析的详细讨论。本文所用的“个体”包括呈现能够用本发明的血小板生成性YRS多肽治疗的症状 或处于呈现该症状风险中的任何动物。合适的个体(患者)包括实验室动物(诸如小鼠、大 鼠、兔或豚鼠)、农场动物、和家养动物或宠物(诸如猫或狗)。非人灵长类，以及优选的人 患者包括在内。典型的个体包括呈现异常量的一种或多种生理活性、或者处于呈现异常量 的一种或多种生理活性的风险中的动物，所述异常量的生理活性能够通过血小板生成多肽 来调节，诸如降低的或减少的血小板计数(S卩，血小板减少症)。典型地，患有血小板减少症 或者如本文所用的“减少的”的血小板计数的个体指与正常的血小板计数相比，血小板计数 降低至约100，000/mm3或更低、约110，000/mm3或更低、约120，000/mm3或更低、约130，000/ mm3或更低、约140，000/mm3或更低、约150，000/mm3或更低的个体。如本文所用的，个体“正 常”的血小板计数通常为约150，000/mm3至450，000/mm3。作为一个实例，“个体”还可以将 经历、正在经历或已经经历移植过程，诸如干细胞或骨髓移植。个体还可以具有肺部病症或 疾病，诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)，和/或正患肺部炎症。如本文所用的“血小板生成”指血小板或凝血细胞的形成。如本文所描述的，酪氨酰-tRNA合成酶多肽的“血小板生成有效浓度”指能够“治 疗”个体的量，诸如“有效”刺激或增强血小板生成，如一般通过增加的血小板水平、维持的 血小板水平、增加的巨核细胞数和/或增加的嗜中性细胞产生所测量的。“巨核细胞”一般指负责对正常的凝血必需的血液凝血细胞(即血小板)产生的骨 髓细胞。巨核细胞通常占1/10000个骨髓细胞。巨核细胞衍生自骨髓中的多能造血干细胞 前体细胞。促血小板生成素(TPO)是巨核细胞产生的主要信号，即TPO足以但并非绝对必 需用于诱导骨髓中的祖细胞向终末巨核细胞表型分化。用于巨核细胞分化的其他分子信号 包括GM-CSF，IL-3，IL-6，IL-I 1，趋化因子(SDF-I ；FGF-4)和促红细胞生成素。巨核细胞被认为通过以下谱系发育=CFU-Me (多能造血干细胞或原始血细胞)_ > 原巨核细胞->前巨核细胞->巨核细胞。在原巨核细胞阶段，细胞失去了分裂的能力，但 仍能够复制其DNA和继续发育，成为多倍体。成熟时，巨核细胞开始产生血小板的过程。促 血小板生成素在诱导巨核细胞形成小的原血小板过程或者形成用于在释放前储存血小板 的胞质内膜中发挥作用。释放时，这些原血小板过程中的每个能够产生2000-5000个新血 小板。总之，约2/3的新释放的血小板会留在循环中，以及约1/3会被脾扣押。释放血小板 后，剩下的细胞核通常跨过骨髓屏障到达血液，在肺中被肺泡巨噬细胞消耗。“嗜中性细胞”或嗜中性粒细胞一般指人中数量大的一类白细胞，其与嗜碱性细胞和嗜酸性细胞一起形成了多形核细胞家族(PMNs)的部分。嗜中性细胞可以根据它们在苏 木精和伊红(H&E)组织学或细胞学制备中的独特染色特征容易地鉴定。嗜中性细胞正常存 在于血流中，但在炎症(主要是感染或癌症的结果)的开始(即，急性)阶段是迁移到炎症 部位的第一组炎症细胞之一。通常，嗜中性细胞首先通过血管、然后通过间质组织迁移，追 随在炎症部位起源的化学信号(例如，白介素-8 (IL-8)、干扰素-γ (IFN- y )和C5a)。“嗜 中性细胞减少症”指存在低嗜中性细胞计数，其能够由先天(遗传性)病症导致，它能够因 为其他疾病状态发生，如在再生障碍性贫血或某些类型的白血病的情况下。某些药剂，诸如 化疗剂也可以导致嗜中性细胞减少症。嗜中性细胞减少症有明显的感染倾向。嗜中性细胞 减少症还可以由细胞内嗜中性寄生物的定殖导致。所用“增强(enhance)” 或“增强(enhancing) ”，或者“增加(increase) ” 或“增加 (increasing) ”，或者“刺激(stimulate) ”或“刺激(stimulating) ” 一般指与无 YRS 多肽 导致的反应或对照分子/组合物导致的反应相比，一种或多种药剂或组合物在细胞内产生 或导致更大的生理反应的能力。可测量的生理反应可以包括更强的细胞生长、扩增或迁移 等，这从本领域的理解和本文的描述是显而易见的。在本领域已知的方法中，体外集落形成 测定代表本文提供的测量对药剂的细胞反应的一种方式。“增加的”或“增强的”量通常是 “统计学上显著的”量，并可以包括为没有YRS多肽(缺乏试剂)时或对照组合物产生的量 的 1. 1,1. 2，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30 或更大倍数(例如，500，1000 倍)(包括两者之 间并大于1的所有整数和小数点，例如1. 5，1. 6，1. 7. 1. 8等)的增加。一般地，术语“减少”涉及本发明的一种或多种YRS多肽“降低”相关生理或细胞 反应的能力，诸如疾病或疾病状态的症状(例如，肺部炎症等)，如根据诊断领域的常规技 术所测量的。相关反应的一个具体实例包括免疫细胞(例如，嗜中性细胞)向某些组织诸 如肺的迁移。其他相关的生理或细胞反应(体内或体外的)对本领域技术人员是显而易见 的。与无YRS多肽或对照组合物产生的反应相比，反应的“降低”可以是统计学上显著的。“迁移”指细胞迁移，这是可以根据常规体外测定测量的过程，如本文所述的以及 本领域已知的(参见，例如，实施例8)。迁移还指体内迁移，诸如细胞从一组织迁移到另一 组织(例如，从骨髓迁移到外周血，或者从外周血迁移到肺组织)，或者从一个组织的部位 迁移到同一组织的另一部位。体内迁移(例如趋化作用)通常发生在应答感染或损伤的/ 刺激的组织时。“分化”指较不特化的细胞(例如，多能、全能、专能等)变为更特化的细胞类型的 过程。“脱敏”一般指减少或消除了生物体对物质或刺激物如变应原或刺激剂(包括外来 抗原以及“自身抗原”)的不利(病理学的)免疫反应。例如，某些肺部疾病或疾病状态与对 外源刺激剂诸如烟的不利反应有关，这样使嗜中性细胞对这些刺激剂脱敏可以预防(即， 减少发生的风险)或减少这些疾病或疾病状态，和/或它们的症状。如本文所用的，“治疗(Treatment) ”或“治疗(treating) ”包括对与血小板减少 症(即，减少的血小板水平)或发展为血小板减少症的风险相关的疾病或疾病状态的症状 或病理产生的任何所需的效应，并且可以包括被治疗的疾病或疾病状态的一个或多个可测 量的标志物的即便最小的变化或改善。“治疗(Treatment)”或“治疗(treating) ”并不必 然表示疾病或疾病状态或其相关症状的彻底根除。接受该治疗的个体是有需要的任何动物，包括灵长类，特别是人，以及诸如马、牛、猪和羊的其他动物，以及通常的家禽和宠物。如 本文所述的，临床改善的示例性标志物包括血小板生成的YRS多肽给药后增加的血小板计 数、维持正常血小板计数、和/或增加的巨核细胞数。所用“载体“指在其中可以插入或克隆多核苷酸的多核苷酸分子，优选DNA分子， 例如来自质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子。载体优选包含一个或多个独特的限制性位 点，并能够在包括靶细胞或组织或者其祖细胞或组织在内的限定的宿主细胞中自主复制， 或者与限定的宿主的基因组整合以使克隆的序列可复制。因此，载体可以是自主复制的载 体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如，线性或闭环质粒、 染色体外元件、小型染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何元件。可 选择地，载体可以是当导入宿主细胞时，被整合进基因组并与它被整合进的染色体一起复 制的载体。载体系统可以包含单一载体或质粒，两个或更多个载体或质粒，其一起包含待被 导入宿主细胞基因组的总DNA，或者转位子。载体的选择通常会依赖于载体与它被导入的宿 主细胞的相容性。在本例中，载体优选是在细菌细胞中具有可操作功能的载体。载体还可 以包括选择性标志物，诸如能够用于选择合适的转化子的抗生素抗性基因。术语“野生型”和“天然存在的”交替使用，指具有从天然存在的来源分离的基因 或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如，多肽)是在群体中 最常见的，并因此任意地指定为基因的“正常”或“野生型”形式。血小板生成性酪氨酰-tRNA多肽以及其变体本发明部分涉及意外的发现某些酪氨酰-tRNA合成酶多肽，包括其截短体和/或 变体，模拟并刺激体内的天然血小板生成过程。因此，本发明的血小板生成性多肽包括全长 酪氨酰-tRNA合成酶多肽，以及酪氨酰-tRNA合成酶多肽的任何生物活性片段，或者其变体 或修饰体，其中所述多肽能够刺激个体内或体外血小板生成(即血小板形成)、巨核细胞增 殖和/或分化、和/或嗜中性细胞增殖。氨酰-tRNA合成酶，诸如酪氨酰-tRNA合成酶，通常通过它们的关联氨基酸催化 tRNA的氨酰化。因为它们在连接氨基酸与tRNAs内包含的核苷酸三联子中的中心作用，氨 酰-tRNA合成酶被认为是进化中首先出现的蛋白之一。酪氨酰-tRNA合成酶特别属于I类 tRNA合成酶家族，其在活性部位具有两个高度保守的序列基序，HIGH和KMSKS。I类tRNA 合成酶在腺核苷酸的2' -OH进行氨酰化，并且通常是单聚或双聚的(分别是一个或两个亚 单位)。人酪氨酰-tRNA合成酶由三个结构域组成1)氨基末端Rossmarm折叠结构域， 其负责形成活化的E. Tyr-AMP中间物，并在细菌、古菌(archeae)和真核生物中是保守的； 2) tRNA反密码子识别结构域，其在细菌和真核生物间不是保守的；以及3)人酪氨酰-tRNA 合成酶独特的羧基末端结构域，其主要结构与假定的人细胞因子内皮单核细胞激活蛋白II 49%—致，与来自秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的甲硫氨酰-tRNA合成酶的羧 基末端结构域50%—致，以及与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Arclp羧基 末端结构域43%—致。人酪氨酰-tRNA合成酶的前两个结构域与来自酿酒酵母、詹氏甲烷球菌 (Methanococcus jannaschii)禾口月旨肪嗜热芽抱杆菌(Bacillus, stearothermophitus)分 别有52，36和16% —致性。已知参与脂肪嗜热芽孢杆菌中的酪氨酰-腺苷酸复合物形成的15个氨基酸中的9个在所有生物体中是保守的，而参与tRNATiT识别的氨基酸不是保守 的。大肠杆菌中表达的重组人和脂肪嗜热芽孢杆菌酪氨酰-tRNA合成酶的动力学分析表示 人酪氨酰-tRNA合成酶氨酰化人但不是脂肪嗜热芽孢杆菌的tRNAT、或者相反。据认为人 酪氨酰-tRNA合成酶的羧基末端结构域从甲硫氨酰基-tRNA合成酶的羧基末端结构域的基 因复制发展而来，并且可以指引tRNA到酶的活性部位。真核生物的酪氨酰-tRNA合成酶的生物片段将蛋白合成与细胞信号传导通路关 连，诸如血小板生成。这些片段可以通过可选的剪接或蛋白水解天然产生。例如，如本发明 所提供的，前血小板生成N-末端片段小型-YRS能够刺激体内血小板生成。此外，全长YRS 多肽序列的某些突变赋予野生型参照序列增加的血小板生成活性(例如，Y341A)。全长YRS 多肽序列的截短的剪接变体的实例包括图17-19中所述的SP1-SP5多肽。包含催化的结构域和反密码子识别结构域的人小型YRS的结构(即，SEQ ID NO 3;或者小型-Tyr)已经被报道为1.18 A的分辨率。然而人和细菌的酶的催化结构域重叠， 相对于催化结构域的反密码子识别结构域的空间布置在关于细菌直向同源物(orthologs) 的小型YRS中是独特的。不希望受任一理论约束，反密码子识别结构域的独特位置可以解 释为什么片段小型YRS在不同细胞信号传导通路中更有活性。因此，本发明的实施方案包括组合物用于刺激个体的血小板生成的用途，所述组 合物包含血小板生成性YRS多肽，包括其截短的、变体和/或修饰的多肽。本发明包括的变 体蛋白是有生物活性的，即它们继续具有参照YRS多肽序列的血小板生成活性(例如，SEQ ID NOS :1，2，3，6，8，10，12和14)。这种变体可以由例如基因多态性或由人工操纵而产生。 参照YRS多肽片段的生物活性变体会具有与参照蛋白的氨基酸序列至少40^,50^,60%, 70 %，一般至少75 %，80 %，85 %，通常约90 %至95 %或者更大，以及典型地约98 %或更大 的序列相似性或一致性，如本文其他地方描述的利用缺省参数的序列比对程序所确定的。 一般地，参照YRS多肽的生物活性变体可以与该蛋白的区别多达200，100,50或20个氨基 酸残基或适宜地少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个，诸如6-10个、少至5个、少至4、3、 2或甚至1个氨基酸残基。在一些实施方案中，YRS多肽与SEQ ID NOS 1，2，3，6，8，10，12 和14中的参照序列的不同达至少一个但少于15，10或5个氨基酸残基。在另外的实施方 案中，它与SEQ ID NOS :1，2，3，6，8，10，12和14中的参照序列的不同达至少一个残基但少 于残基的20%，15%，10%或5%。YRS多肽可以以不同方式改变，包括氨基酸取代、删除、截短和插入。用于这种操 纵的方法通常是本领域已知的。例如，截短的和/或变异的YRS多肽的氨基酸序列变体可 以通过DNA中的突变制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域已知的。例如，参 见 Kunkel (1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 :488-492)，Kunkel et al, (1987，Methods in Enzymol,154 :367-382), U. S. Pat. No. 4,873,192, Watson, J. D. et al, (" Molecular Biology of the Gene"，第四版，Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif, 1987)以及其 中引用的参考文献。关于不影响感兴趣蛋白的生物活性的合适氨基酸取代的指导可以见于 Dayhoff et al. , (1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C)的模型中。本领域已知用于筛选组合文库基因产物的方法以及 用于筛选cDNA文库具有选定特性的基因产物的方法，所述组合文库通过点突变或截短制 备。这些方法适用于通过YRS多肽的组合诱变产生的基因文库的快速筛选。增强文库中的功能突变体频数的技术，递归集合诱变(Recursive ensemble mutagenesis) (REM)可以用 于与筛选测定组合以鉴定YRS多肽变体(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :7811-7815 ；Delgrave et al.，(1993)Protein Engineering, 6 :327-331)。保守性 取代，诸如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，可以是理想的，如下文更详 细地讨论的。血小板生成活性截短的和/或变体YRS多肽可以在沿它们序列不同位置包含保守 性氨基酸取代，如与参照YRS氨基酸序列所比较的(例如，SEQ ID NOS =1,2,3,6,8,10,12 或14)。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。 具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中被定义，其通常可以如下进行亚分类酸性的残基由于丢失了 H离子在生理pH下带负电荷，以及该残基被水性溶液吸 引以使它在包含它的肽在生理PH的水性介质中时寻找该肽构象的表面位置。具有酸性侧 链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。碱性的残基由于结合H离子在生理pH下或其一个或两个pH单位内带正电荷(例 如，组氨酸)，以及该残基被水性溶液吸引以使它在包含它的肽在生理PH的水性介质中时 寻求该肽构象的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的残基在生理pH下带电荷，并且因此包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸 (即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。疏水的残基在生理pH下不带电荷，并且该残基在水性溶液中被排斥以使它在包 含它的肽在水性介质中时寻求该肽构象的内部位置。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、 缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性/极性的残基在生理pH下不带电荷，但该残基不足以被水性溶液排斥以使 它会在包含它的肽在水性介质中时寻求该肽构象的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基 酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。该说明还将某些氨基酸表征为“小的”，因为它们的侧链不足够大到提供疏水性， 即便缺乏极性基团。除脯氨酸外，“小”氨基酸是具有4个或更少的碳的那些，其时至少一 个极性基团在侧链上，另三个碳或更少不在侧链上。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝 氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的次级氨基酸脯氨酸是特例，由于它已知的对肽链的次 级构象的影响。脯氨酸的结构与所有其他天然存在的氨基酸的不同在于它的侧链结合到 α-氨基基团的氮，以及α-碳。然而，几个氨基酸相似矩阵(例如，ΡΑΜ120矩阵和ΡΑΜ250 矩阵，如例如 Dayhoff et al. , (1978), A model of evolutionary change in proteins. Matrices for determining distance relationships In M. 0. Dayhoff, (ed. )，Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp.345—358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC;以及 Gonnet et al.，Gcience，256 :14430-1445，1992 所公 开的)将脯氨酸与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸包括在同一组中。因此，出于本发明的 目的，脯氨酸被分类为“小”氨基酸。用于极性或非极性分类所需的吸引或排斥程度是主观的，因此，本发明特别包括 的氨基酸已经被分类为一种或另一种。没有具体命名的大多数氨基酸可以基于已知的行为 进行分类。氨基酸残基可以进一步亚分类为环状的或非环状的，芳香族的或非芳香族的，与残基侧链取代基因有关的自明的分类，以及分类为小的或大的。如果残基包括羧基碳在内 总共含4个碳原子或更少，被视为小的，前提是存在额外的极性取代基，三个或更少的不存 在。当然，小残基一直不是芳香族的。取决于它们的结构特性，氨基酸残基可以分为两类或 更多类。对于天然存在的蛋白氨基酸，根据该方案的亚分类呈现在表A中。表 A氨基酸亚分类
权利要求
1.包含血小板生成有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽的药物，其用于治疗个体的血 小板减少症或降低个体发展为血小板减少症的风险，或者用于增加或维持个体的血小板计数。
2.增加个体的血小板计数的方法，包括给予所述个体包含血小板生成有效浓度的酪氨 酰-tRNA合成酶多肽的组合物，由此增加所述个体的血小板计数。
3.治疗个体的血小板减少症或降低个体发展为血小板减少症的风险的方法，包括给予 所述个体包含血小板生成有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽的组合物，由此治疗所述个 体的血小板减少症或降低所述个体发展为血小板减少症的风险。
4.刺激个体的血小板生成的方法，包括给予所述个体包含血小板生成有效浓度的酪氨 酰-tRNA合成酶多肽的组合物，由此刺激所述个体的血小板生成。
5.维持个体的血小板计数的方法，包括给予所述个体血小板生成有效浓度的酪氨 酰-tRNA合成酶多肽，由此维持所述个体的血小板计数。
6.刺激个体的巨核细胞增殖、迁移和/或分化的方法，包括给予所述个体血小板生成 有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，由此刺激所述个体的巨核细胞增殖和/或分化。
7.刺激个体的嗜中性细胞增殖的方法，包括给予所述个体血小板生成有效浓度的酪氨 酰-tRNA合成酶多肽，由此刺激所述个体的嗜中性细胞增殖。
8.如权利要求1-7中任一项所述的药物或方法，其中所述个体患有与降低或减少的血 小板计数有关的疾病或疾病状态，或处于患所述疾病或疾病状态的风险中。
9.如权利要求1-7中任一项所述的药物或方法，其中所述个体具有约150，000/mm3或 更低的血小板计数。
10.如权利要求8所述的药物或方法，其中所述与降低或减少的血小板计数有关的疾 病或疾病状态选自出血、鼻衄、脾功能亢进、低体温、Epstein-Barr病毒感染、传染性单核细 胞增多症、Wiskott-Aldrich综合征、母源性噻嗪类药物摄入、先天性缺巨核细胞性血小板 减少症、血小板减少-桡骨缺失综合征、范科尼贫血、巨大血小板综合征、May-Hegglin畸 形、灰白血小板综合征、奥尔波特综合征、新生儿风疹、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合 征、白血病、淋巴瘤、骨髓的肿瘤、癌症、营养缺乏、放射接触、肝功能衰竭、细菌性脓毒症、麻 疹、登革热、HIV感染或AIDS、早熟、胎儿成红细胞增多症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、 母源性ITP、溶血尿毒症综合征、弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血 后紫癜、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、新生儿同种免疫血小板减少症、以及阵发性睡 眠性血红蛋白尿症、丙型肝炎病毒感染(HCV)、药剂诱发的血小板减少症、和化疗诱发的血 小板增多症(CIT)。
11.如权利要求8所述的药物或方法，其中与降低或减少的血小板计数有关的疾病或 疾病状态由药剂或药品诱发。
12.如权利要求11所述的药物或方法，其中所述药剂或药品选自化疗剂、非留体抗炎 剂、磺胺类药、万古霉素、氯吡格雷、糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂、干扰素、丙戊酸、阿昔单抗、利 奈唑胺、法莫替丁、美贝维林、组胺阻断剂、烷化剂、肝素、乙醇和抗菌化疗剂。
13.如权利要求12所述的药物或方法，其中所述化疗剂选自顺钼(CDDP)、卡钼、甲基 苄胼、氮介、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基尿、更生霉 素、道诺霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP 16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉酚、吉西他滨、长春瑞宾、法尼基蛋白转移酶抑制剂、反钼、5-氟 尿嘧啶、长春新碱、长春花碱和甲氨蝶呤、temazolomide以及其衍生物。
14.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含在它的C-末端截短的哺乳动物酪氨酰-tRNA合成酶。
15.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约1-50个氨基酸残基从 它的C-末端截去。
16.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约50-100个氨基酸残基 从它的C-末端截去。
17.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约100-150个氨基酸残基 从它的C-末端截去。
18.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中至少约150-200个残基从它的C-末端截去。
19.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中至少约200-250个氨基酸残基从它的 C-末端截去。
20.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含在它的N-末端截短的哺乳动物酪氨酰-tRNA合成酶。
21.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约1-50个氨基酸残基从 它的N-末端截去。
22.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约50-100个氨基酸残基 从它的N-末端截去。
23.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约100-150个氨基酸残基 从它的N-末端截去。
24.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中至少约150-200个残基从它的N-末端截去。
25.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 包含SEQ ID NO :1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中至少约200-250个氨基酸残基从它的 N-末端截去。
26.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 选自(a)包含与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列至少80%—致的氨基酸序列的多肽，其中341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(b)包含与SEQID NO :2所示的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(c)包含与SEQID NO :2所示的氨基酸序列至少95%—致的氨基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(d)包含与SEQID NO :2所示的氨基酸序列至少98%—致的氨基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；以及(e)包含SEQID NO :2所示的氨基酸序列的多肽。
27.如权利要求1至7中任一项所述的药物或方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 选自(a)包含与SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列至少80% —致的氨 基酸序列的多肽；(b)包含与SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列至少90% —致的氨 基酸序列的多肽；(c)包含与SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列至少95% —致的氨 基酸序列的多肽；(d)包含与SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列至少98% —致的氨 基酸序列的多肽；以及(e)包含SEQID NO :1，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列的多肽。
28.适合用于给药的组合物，包含生理学上可接受的赋形剂和/或载体以及血小板生 成有效浓度的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述组合物能够刺激个体的血小板生成和/ 或增加个体的血小板计数。
29.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含在它的C-末 端截短的哺乳动物酪氨酰-tRNA合成酶。
30.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约1_50个氨基酸残基从它的C-末端截去。
31.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1,2,3,6,8,10，12或14的氨基酸序列，其中至少约50-100个氨基酸残基从它的C-末端截 去。
32.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约100-150个氨基酸残基从它的C-末端截去。
33.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中至少约150-200个残基从它的C-末端截去。
34.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中至少约200-250个氨基酸残基从它的C-末端截去。
35.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含在它的N-末 端截短的哺乳动物酪氨酰-tRNA合成酶。
36.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID N0:.1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约1_50个氨基酸残基从它的N-末端截去。
37.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1,2,3,6,8,10，12或14的氨基酸序列，其中至少约50-100个氨基酸残基从它的N-末端截去。
38.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8，10，12或14的氨基酸序列，其中至少约100-150个氨基酸残基从它的N-末端截去。
39.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO 1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中至少约150-200个残基从它的N-末端截去。
40.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽包含SEQID NO: 1，2，3，6，8或10的氨基酸序列，其中至少约200-250个氨基酸残基从它的N-末端截去。
41.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽选自(a)包含与SEQID NO :2所示的氨基酸序列至少80%—致的氨基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(b)包含与SEQID NO :2所示的氨基酸序列至少90%—致的氨基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(c)包含与SEQID NO :2所示的氨基酸序列至少95%—致的氨基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；(d)包含与SEQID NO :2所示的氨基酸序列至少98%—致的氨基酸序列的多肽，其中 341位的丙氨酸不被酪氨酸取代；以及(e)包含SEQID NO :2所示的氨基酸序列的多肽。
42.如权利要求观所述的组合物，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽选自(a)包含与SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列至少80% —致的氨 基酸序列的多肽；(b)包含与SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列至少90% —致的氨 基酸序列的多肽；(c)包含与SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列至少95% —致的氨 基酸序列的多肽；(d)包含与SEQID N0:l，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列至少98% —致的氨 基酸序列的多肽；以及(e)包含SEQID NO :1，2，3，6，8，10，12或14所示的氨基酸序列的多肽。
43.如权利要求观所述的组合物，还包含第二酪氨酰-tRNA合成酶多肽，其中两个酪氨 酰-tRNA合成酶多肽形成二聚体。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述二聚体是同型二聚体。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述二聚体是异质二聚体。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述异质二聚体包含全长的酪氨酰-tRNA合成 酶多肽和截短的酪氨酰-tRNA合成酶多肽。
47.如权利要求观所述的组合物，还包含异源多肽，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽 和所述异源多肽形成异质二聚体。
48.组合物，其包含生理学上可接受的赋形剂和/或载体以及血小板生成有效浓度的 嵌合的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述嵌合的多肽包含酪氨酰-tRNA合成酶多肽的两 个或更多个生物活性片段，其中所述两个或更多个片段包含权利要求观-42中任一项所述 的多肽的至少10个连续的氨基酸，其中所述两个或更多个片段相连接以形成嵌合的多肽， 以及其中所述嵌合的酪氨酰-tRNA合成酶多肽能够刺激个体的血小板生成和/或增加个体 的血小板计数。
49.组合物，其包含生理学上可接受的赋形剂和/或载体以及血小板生成有效浓度的 嵌合的酪氨酰-tRNA合成酶多肽，其中所述嵌合的多肽包含(a)酪氨酰-tRNA合成酶多肽 的一个或多个生物活性片段，其中所述一个或多个片段包含权利要求观-42中任一项所述 的多肽的至少10个连续氨基酸；和(b) —个或多个异源多肽，其中所述(a)的一个或多个 片段以及所述(b)的一个或多个异源多肽相连接以形成嵌合的多肽，以及其中所述嵌合的 多肽能够刺激个体的血小板生成和/或增加个体的血小板计数。
50.抗体或抗原结合片段，其特异地结合权利要求观-49中任一项所述的酪氨酰-tRNA 合成酶多肽。
51.鉴定或表征样品中YRS多肽的方法，包括(a)获得生物样品；(b)用权利要求50所述的抗体或抗原结合片段接触所述生物样品；以及(c)检测所述抗体或抗原结合片段对所述生物样品的特异性结合的存在或缺乏，由此 鉴定或表征所述样品中的YRS多肽。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述生物样品获自个体。
53.组合物，其包含分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自(a)包含与SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列至少80%—致的核苷酸 序列的多核苷酸；(b)包含与SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列至少90%—致的核苷酸 序列的多核苷酸；(c)包含与SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列至少95%—致的核苷酸 序列的多核苷酸；(d)包含与SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列至少98%—致的核苷酸 序列的多核苷酸；(e)包含SEQID NO :4，7，9，11，13或15所示的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码能够刺激个体的血小板生成和/或增加个体的血小板计数的 酪氨酰-tRNA合成酶多肽。
54.载体，其包含权利要求53所述的多核苷酸。
55.宿主细胞，其包含权利要求M所述的载体。
56.刺激早期巨核细胞祖细胞增殖和/或分化的方法，包括用酪氨酰-tRNA合成酶多肽 孵育造血干细胞培养物足够的时间以允许所述早期巨核细胞祖细胞增殖，由此刺激早期巨 核细胞祖细胞增殖和/或分化。
57.如权利要求56所述的方法，其中离体或体外实施所述方法。
58.如权利要求57所述的方法，其中从骨髓获得所述培养物。
59.如权利要求57所述的方法，其中从脐带血获得所述培养物。
60.如权利要求57所述的方法，还包括将所述细胞给予有需要的个体。
61.刺激表达CXCR-2的细胞迁移的方法，包括用酪氨酰-tRNA合成酶多肽接触所述细 胞，由此刺激所述表达CXCR-2的细胞迁移。
62.如权利要求61所述的方法，其中接触所述细胞的步骤体外或离体发生。
63.如权利要求61所述的方法，其中接触步骤包括给予有需要的个体包含有效浓度的 酪氨酰-tRNA合成酶多肽的组合物。
64.减轻个体的肺部炎症和/或其症状的方法，包括给予所述个体有效浓度的酪氨 酰-tRNA合成酶多肽，由此减轻所述个体的肺部炎症和/或其症状。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述个体患有慢性阻塞性肺部疾病(COPD)。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述酪氨酰-tRNA合成酶多肽的给药对于实现循 环中的嗜中性细胞对变应原的脱敏是有效的。
全文摘要
本文提供了血小板生成组合物，其包含酪氨酰-tRNA合成酶多肽，包括其截短体和/或变体。还提供了利用这种组合物治疗疾病状态的方法，所述疾病状态受益于增加的血小板生成，诸如血小板减少症。
文档编号A61K38/53GK102105164SQ200980129525
公开日2011年6月22日 申请日期2009年6月10日 优先权日2008年6月11日
发明者张伟, 拉杰什·贝拉尼, 杰弗里·迪安·沃特金斯, 阿兰·菲利普·瓦瑟洛特 申请人:Atyr医药公司