专利名称：包含酪氨酰－丝氨酰－缬氨酸(ysv)的生物活性肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及短肽及其用途。特别是，本发明涉及具有免疫调节性能和抗癌性能的短肽。
相关领域的描述本领域已知生物活性肽可用于治疗疾病和用作药物组合物。例如，US6,191,113公开了一种对平滑肌细胞生长具有抑制活性的肽，其因此可以用于防治与平滑肌细胞生长有关的病理状态，如动脉硬化、血管成形术后的再狭窄、移植血管后的腔狭窄、及平滑肌肉瘤等。US 6,184,208公开了另一种肽，发现其调节一些生理过程，如上皮生长带的增重活性和头发生长。此外，PCT公开WO 03/006492和美国专利申请10/237,405表明某些肽以及它们的药物组合物具有生物活性并可调节免疫反应。(需要说明的是，在本公开文本中引用的参考文献并不一定构成现有技术，因此对它们的引用并不等于在任何司法效力上承认这些参考文献为现有技术)。
因此，本发明的一个目的是提供具有生物活性的短肽及其用途。
发明概述本发明一方面涉及酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽(简称YSV)，已经发现该三肽具有生物活性。为了进行测试，采用肽L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-缬氨酸。本发明另一方面包括分离或纯化的肽，所述肽包括酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸、基本上由酪氨酰-丝氨酰-缬氨组成或由酪氨酰-丝氨酰-缬氨组成。本发明又一方面还涉及基本纯化的YSV肽。
本发明再一方面包括分离或纯化的基本上由YSV组成的肽，所述肽具有选自以下的活性免疫响应的调节作用、T淋巴细胞转化的刺激作用、细胞增殖紊乱的调节作用、癌生长的调节作用、肝癌生长的调节作用、白血病细胞生长的调节作用、宫颈癌生长的调节作用、肺癌生长的调节作用以及黑素瘤生长的调节作用。
本发明再一方面还包括含肽的药物组合物，所述肽包含YSV肽、基本上由YSV肽组成或由YSV肽组成。本发明其他方面涉及含肽的药物组合物，所述肽包含YSV肽的功能衍生物、基本上由YSV肽的功能衍生物组成或由YSV肽的功能衍生物组成。再有的方面包括药物组合物，所述组合物包含L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-缬氨酸三肽、基本上由L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-缬氨酸三肽组成或由L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-缬氨酸三肽组成。
本发明的另一方面涉及制备药物组合物的方法，包括提供酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽，并将所述三肽与一种药物可接受载体混合。
本发明的另一方面涉及一种降低人疾病影响的方法，所述方法包括给予人药学有效剂量的酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽。在本发明的另外方面，所述人疾病选自其效应可通过刺激Y淋巴细胞转化而降低的病症和细胞增殖紊乱。在本发明的其他方面，所述细胞增殖紊乱为癌症，包括但不限于肝癌、白血病、宫颈癌、肺癌和黑素瘤。
本发明的另一方面涉及酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽作为药物组合物的用途。此外，所述三肽可用于调节免疫系统，也可用于治疗细胞增殖紊乱。在本发明的具体方面，所述细胞增殖紊乱为癌症。在本发明的具体方面，治疗肝癌、白血病、宫颈癌、肺癌和/或黑素瘤。
本发明的另一方面涉及营养组合物及其在制备营养增补剂中的用途，所述组合物包含酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸。本发明的具体方面涉及含肽的营养增补剂，所述肽包括酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽、基本上由酪氨酰-丝氨酰-缬氨三肽组成或由酪氨酰-丝氨酰-缬氨三肽组成。
本发明另外的方面提供了YSV的增效的衍生物或其功能衍生物。所述酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽的增效的衍生物包含能够以提高或促进所述三肽的疗效的方式与三肽连接的增效的分子。增强效果可为延长的效果、缩短的效果、延迟发效的效果、加速发效的效果、提高强度的效果、降低强度的效果、减少副作用的效果、产生一种或多种作用的效果、延迟平息的效果、加速平息的效果和将所述肽定位于个体中分散的区域的作用。这种增效的分子和增效的衍生物的实例如下所述。在本发明的一些方面中，所述增效的分子可为调节(但不限于调节)免疫活性和/或癌症的生长，其中所述癌包括但不限于宫颈癌、肝癌和白血病。本发明的其他方面包括增强肽的疗效的方法，所述肽包括YSV或其衍生物、基本上由YSV或其衍生物组成或由YSV或其衍生物组成，所述方法包括将所述肽可操作地连接到增强所述肽的疗效的分子上。在本发明的一些方面，所述方法不包括天然存在的肽中与所述YSV肽或其衍生物相邻的肽。本发明的其他方面包括药物组合物，所述药物组合物包括YSV的增效的衍生物或其功能衍生物、基本上由YSV的增效的衍生物或其功能衍生物组成或由YSV的增效的衍生物或其功能衍生物组成。
本发明一方面涉及基本纯化的上述YSV肽或其功能衍生物，所述YSV肽或其功能衍生物可连接到能够增强其疗效的分子(也称为“增效的分子”)上。这些分子可按照美国临时专利申请60/435,796(于2002年12月18日提交，发明名称为“生物活性肽结合物”)中公开的任何方式制备和使用，该专利申请通过引用结合到本文中。可连接到所述肽的候选分子以及实施这种连接的方式与本领域所用的常规方式相同。一些可连接到YSV肽及其功能衍生物的分子包括但不限于有机化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、类固醇、蛋白质、隔离的蛋白质结构域、半抗原、抗原、脂类分子、脂肪酸、胆汁酸、聚胺、蛋白酶抑制剂、硅酸盐以及前述分子的任何组合。本发明还涉及基本纯化的上述YSV肽或其功能衍生物，所述YSV肽或其功能衍生物连接到能够增强其疗效的分子，其中所述可连接分子不是天然存在的肽中与上述肽相邻的肽。在本发明的另一方面，所述基本纯化的YSV肽或其功能衍生物可调节但不限于调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱，如癌症，其中所述癌症包括但不限于宫颈癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。所述分子可通过共价键或非共价作用连接到本发明的肽上。
在具体的实施方案中，当生物活性分子与YSV或其功能衍生物连接时，可通过将部分连接分子的性能赋予所述肽而改变其药代动力学。连接分子可赋予肽的一些性能包括但不限于将肽传递到体内分散的区域；将肽的活性集中于体内所需的位置，而降低其在其他位置的作用；减少用肽治疗的副作用；改变肽的渗透性；改变肽传递给身体的生物利用度或速率；改变用肽治疗的效果的时间长短；改变肽的稳定性；改变肽作用起始和衰退的速率；通过使肽具有某种性能而提供允许作用。
本发明另一方面涉及基本纯化的肽，所述肽包括YSV或其功能衍生物、基本上由YSV或其功能衍生物组成或由YSV或其功能衍生物组成，所述YSV或其功能衍生物连接于可增强其疗效的分子上，其中所述连接分子不是天然存在的肽中与YSV或其一种功能衍生物相邻的肽。一些可连接到YSV肽及其功能衍生物的分子包括但不限于有机化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、类固醇、蛋白质、隔离的蛋白质结构域、半抗原、抗原、脂类分子、脂肪酸、胆汁酸、聚胺、蛋白酶抑制剂、硅酸盐以及前述分子的任何组合。本发明的其他方面包括基本纯化的肽，所述肽包括YSV肽或其功能衍生物、基本上由YSV肽或其功能衍生物组成或由YSV肽或其功能衍生物组成，所述YSV肽或其功能衍生物连接于可增强其疗效的分子上，所述增效的分子可调节但不限于调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱，如癌症，其中所述癌症包括但不限于宫颈癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。所述分子可通过共价键或非共价作用连接到本发明的肽上。所述基本纯化的肽与增强其疗效的分子的连接的作用包括但不限于将肽传递到体内分散的区域；将肽的活性集中于体内所需的位置，而降低其在其他位置的作用；减少用肽治疗的副作用；改变肽的渗透性；改变肽传递给身体的生物利用度或速率；改变用肽治疗的效果的时间长短；改变肽的稳定性；改变肽作用起始和衰退的速率；通过使肽具有某种性能而提供允许作用。
本发明另一方面涉及包括含有YSV或其一种功能衍生物的肽与另外结合肽序列的杂化肽，其中所述结合的另外的序列不是在天然存在的肽中与上述公开的肽相邻的序列。在具体的实施方案中，所述杂化肽可调节但不限于调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱，如癌症，其中所述癌症包括但不限于宫颈癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。在具体的实施方案中，这些非天然存在肽中与YSV或其功能衍生物相邻的另外结合肽序列可通过将部分杂化分子的性能赋予所述肽而改变本发明上述实施方案中的肽的药代动力学。连接分子可赋予YSV或其功能衍生物的一些性能包括但不限于将肽传递到体内分散的区域；将肽的活性集中于体内所需的位置，而降低其在其他位置的作用；减少用肽治疗的副作用；改变肽的渗透性；改变肽传递给身体的生物利用度或速率；改变用肽治疗的效果的时间长短；改变肽的稳定性；改变肽作用起始和衰退的速率；通过使肽具有某种性能而提供允许作用。
本发明另一方面涉及基因载体，所述基因载体包括编码YSV肽或其一种功能衍生物的第一核苷酸序列、基本上由所述第一核苷酸序列组成或由所述第一核苷酸序列组成，所述第一核苷酸序列在框架中与第二核苷酸序列稠合，所述第二核苷酸序列编码增强上述肽的疗效的肽，所述第二核苷酸序列编码的肽不是天然存在的肽中与所述YSV肽或其一种功能衍生物相邻的肽。本发明还涉及基因载体，所述基因载体包括编码基本上由YSV肽或其一种功能衍生物组成的肽的第一核苷酸序列、基本上由该所述第一核苷酸序列组成或由该所述第一核苷酸序列组成，所述第一核苷酸序列在框架中与第二核苷酸序列稠合，所述第二核苷酸序列编码增强上述肽的疗效的肽，所述第二核苷酸序列编码的肽不是天然存在的肽中与所述YSV肽或其一种功能衍生物相邻的肽。本发明还涉及基因载体，所述基因载体包括编码由YSV肽或其一种功能衍生物的氨基酸序列组成的肽的第一核苷酸序列、基本上由所述第一核苷酸序列组成或由所述第一核苷酸序列组成，所述第一核苷酸序列在框架中与第二核苷酸序列稠合，所述第二核苷酸序列编码增强上述肽的疗效的肽，所述肽不是天然存在的肽中与所述YSV肽或其一种功能衍生物相邻的肽。在具体的实施方案中，所述YSV肽或其一种功能衍生物可调节但不限于调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱，如癌症，其中所述癌症包括但不限于宫颈癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。连接分子可赋予所述YSV肽或其一种功能衍生物的一些性能包括但不限于将肽传递到体内分散的区域；将肽的活性集中于体内所需的位置，而降低其在其他位置的作用；减少用肽治疗的副作用；改变肽的渗透性；改变肽传递给身体的生物利用度或速率；改变用肽治疗的效果的时间长短；改变肽的稳定性；改变肽作用起始和衰退的速率；通过使肽具有某种性能而提供允许作用。本发明的另一方面涉及包含选自以下列表的核苷酸序列的微生物，所述列表包括上述载体的核苷酸序列；包括编码含所述YSV肽或其一种功能衍生物的氨基酸序列的肽的第一核苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列在框架中与第二核苷酸序列稠合，所述第二核苷酸序列编码不是天然存在的肽中与所述YSV肽或其一种功能衍生物相邻的肽。
就上述核酸序列而言，由这些核酸序列表达的肽和/或杂化肽可调节但不限于调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱，如癌症，其中所述癌症包括但不限于宫颈癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。
本发明再一方面涉及一种制备药物组合物的方法，所述方法包括提供连接在能增强其疗效的分子上的YSV肽或其一种功能衍生物；将所述连接在所述分子上的肽与药学上可接受的载体一起调配。本发明涉及的所述方法中，所述肽可调节但不限于调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱，如癌症，其中所述癌症包括但不限于宫颈癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。可连接在所述YSV肽或其一种功能衍生物的生物有效性分子的一些实例包括但不限于有机化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、类固醇、蛋白质、隔离的蛋白质结构域、半抗原、抗原、脂类分子、脂肪酸、胆汁酸、聚胺、蛋白酶抑制剂、硅酸盐以及前述分子的任何组合。本发明还涉及一种制备含肽的药物组合物的方法，其中所述肽包含所述YSV肽或其一种功能衍生物，所述方法包括将所述肽连接到增强所述疗效的分子上，其中所述分子不是天然存在的肽中与所述YSV肽或其一种功能衍生物相邻的肽。所述分子可通过共价键或非共价作用与本发明的肽连接。在一个具体的实施方案中，所述连接分子可赋予所述肽以增强其疗效的性能包括但不限于将肽传递到体内分散的区域；将肽的活性集中于体内所需的位置，而降低其在其他位置的作用；减少用肽治疗的副作用；改变肽的渗透性；改变肽传递给身体的生物利用度或速率；改变用肽治疗的效果的时间长短；改变肽的稳定性；改变肽作用起始和衰退的速率；通过使肽具有某种性能而提供允许作用。本发明还涉及一种制备药物组合物的方法，所述方法包括提供基本纯化的肽，所述肽基本上由连接在能增强其疗效的分子上的YSV肽或其一种功能衍生物的氨基酸序列组成；将所述连接在所述分子上的肽与药学上可接受的载体一起调配。本发明还涉及一种制备药物组合物的方法，所述方法包括提供基本纯化的肽，所述肽由连接在能增强其疗效的分子上的YSV肽或其一种功能衍生物组成；将所述连接在所述分子上的肽与药学上可接受的载体一起调配。
本发明还有一个方面是涉及一种治疗人的方法，所述方法包括给予人药学有效剂量的基本纯化的包括YSV肽或其一种功能衍生物的肽，所述肽连接在能够增强其疗效的分子上。可连接所述YSV肽或其一种功能衍生物的生物学活性分子的一些实例包括但不限于有机化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、类固醇、蛋白质、隔离的蛋白质结构域、半抗原、抗原、脂类分子、脂肪酸、胆汁酸、聚胺、蛋白酶抑制剂、硅酸盐以及前述分子的任何组合。在一些实施方案中，所述连接分子可赋予所述肽以增强其疗效的性能包括但不限于将肽传递到体内分散的区域；将肽的活性集中于体内所需的位置，而降低其在其他位置的作用；减少用肽治疗的副作用；改变肽的渗透性；改变肽传递给身体的生物利用度或速率；改变用肽治疗的效果的时间长短；改变肽的稳定性；改变肽作用起始和衰退的速率；通过使肽具有某种性能而提供允许作用。
在具体的实施方案中，上述用于治疗人的肽可用于调节但不限于调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱，如癌症，其中所述癌症包括但不限于宫颈癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。
本发明其他方面包括药物组合物，所述药物组合物包括连接于能增强其疗效的分子上的YSV肽或其功能衍生物以及药学上可接受的载体、基本上由所述YSV肽或其功能衍生物以及药学上可接受的载体组成或由所述YSV肽或其功能衍生物以及药学上可接受的载体组成。本发明还涉及所述增强的YSV肽或其衍生物，其中所述肽可调节但不限于调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱，如癌症，其中所述癌症包括但不限于宫颈癌、肝癌、白血病、肺癌和黑素瘤。可连接所述YSV肽或其一种功能衍生物学活性分子的一些实例包括但不限于有机化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、类固醇、蛋白质、隔离的蛋白质结构域、半抗原、抗原、脂类分子、脂肪酸、胆汁酸、聚胺、蛋白酶抑制剂、硅酸盐以及前述分子的任何组合。在一些实施方案中，所述连接分子可赋予所述肽以增强其疗效的性能包括但不限于将肽传递到体内分散的区域；将肽的活性集中于体内所需的位置，而降低其在其他位置的作用；减少用肽治疗的副作用；改变肽的渗透性；改变肽传递给身体的生物利用度或速率；改变用肽治疗的效果的时间长短；改变肽的稳定性；改变肽作用起始和衰退的速率；通过使肽具有某种性能而提供允许作用。
附图概述如下五幅附图分别举例说明了将肽连接到类固醇分子的化学反应。
图1显示了将肽通过共价键连接到雌酮分子上的一系列化学反应。
图2显示了用于创建图1所示相同连接键的第二种作为选择的系列反应。
图3包含设计用于将肽通过共价键连接到雌二醇分子上的一系列化学反应。
图4包含用于创建图3所示相同连接键第二种系列反应。
图5说明了将肽通过共价键连接到氢化可的松的方法。
优选实施方案的详细描述在研究可用作人的免疫调节、抗细胞增殖紊乱、抗癌和/或抗肉瘤药物的短肽分子中，本发明人发现L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-缬氨酸(YSV)分子具有体外免疫调节和抗癌性能。该发现表明YSV分子、含该分子的较大分子，包括较大的肽和在它们的序列中含所述YSV序列的肽以及YSV的功能衍生物可用作免疫调节剂和/或抗细胞增殖紊乱药物或食物增补剂。
应理解可以将其他氨基酸加至所述YSV肽的氨基端或羧基端而作为实施本发明的另一种方法。在这样的实施方案中，所述YSV肽保持本文所描述的一种或多种治疗或功能性能。例如，在一些实施方式中，在所述肽中增加一个或两个氨基酸而并未使其生物功能受到影响。在进一步的实施例中，也可以增加三或四个氨基酸而仍保持肽的功能。这些均称为该肽的变异体。另外，肽的衍生物如在同一功能区内进行一个氨基酸的保守置换也可用于实施本发明的另一方面。例如，具有非极性端或称疏水侧链的肽可以被取代一个侧基而其生物学功能并不减弱。作为进一步的例子，接头/间隔基可被插入肽形成变体，但这些变体仍保持本研究中所用的原始肽的活性部分。这些被视为本发明肽的变体。本文所用术语肽类似物包括具有模拟天然氨基酸结构的氨基酸分子的肽，例如具有不同骨架结构或D-氨基酸取代的类似物。作为进一步的例子，尽管用于合成肽的氨基酸是L-光学异构形式，但是序列中一或多个氨基酸被D-型取代的肽可能具有类似的生物活性。本申请权利要求中所用术语“功能性衍生物”涵盖本发明肽的片段、变体、类似物和化学衍生物。
“基本上纯化的肽”是指纯度至少为10％(w/w)的肽，优选纯度为20％，更优选为40％，更优选为60％，进一步优选为大于90％。在最优选的实施方案中，纯度大于99％。如下文所述，基本上纯化的肽可做为混合物中的部分成分进行药物或营养配方的制备。
上述肽用在药物配方中可用于治疗免疫失调以及对于免疫性有继发作用的疾病，例如细胞增殖紊乱，如癌症或感染。在这些肽的药物配方可能是YSV或其功能衍生物与其它活性或非活性成分的混合，包括其他肽，例如两个或若干个(例如3-5个)肽可以加到同一配方中，可伴有或不伴有其它成分。或者，YSV或其功能衍生物可以与这儿未列出的肽一起用于制备配方。此类配方可以经静脉、肌肉、皮内、皮下或真皮内给药，或动脉注射直接作用于器官，还可以以粉末、喷雾的方式经呼吸道吸入，经皮吸收或本领域已知的其它输送方式。配方还可以中服，并可含有可用于在口服后防肽的胃消化的载体，或本领域已知的任何其它载体(对于经皮，如脂质体)。
本文所用术语“杂合肽”是指含有插入具有上述序列的原始生物活性肽或其功能衍生物中的额外肽但仍保持基本类似的活性的肽。额外肽包括前导肽，其含有例如由一或多个原核或真核细胞识别作为将该杂合肽分泌至胞外的信号的氨基酸序列。分泌可以是直接分泌，或通过分泌小泡间接分泌。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“包含”或“包括”等是指“包含/包括，但不限于”。例如，包括A、B和C的方法、装置、分子或其他术语可描述为包含A和B。同样，包含A和B的方法、装置、分子或其他属于可包括任何数量的其他步骤、组分、原子或其他术语。
这里所用的术语“基本上由……组成”是指这样的一种肽或多肽，其包括YSV肽或其一种功能衍生物的氨基酸序列和羧基和/或氨基末端的额外氨基酸并保持本文所提供的所述肽的活性。因此，作为非限定性实例，在该实例中YSV肽或其一种功能衍生物的活性可调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱(如癌症)，基本上由YSV肽或其一种功能衍生物组成的肽或多肽将具有本文提供的与该肽有关的调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱(如癌症)的活性，并且不具有在其内部和其自身的(即在连接到生物活性分子而进行修饰前)实质上降低肽或多肽调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱(如癌症)的能力或构成对该肽作为免疫活性调节剂这一基本新特征的实质改变的任何特征。因此，在前述实例中，其主要活性不是调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱(如癌症)，并且在其中的某处含有所述YSV肽或其一种功能衍生物的氨基酸序列的全长天然存在的多肽不是“基本由”YSV肽或其一种功能衍生物组成的肽或多肽。同样，在前述实例中，其主要活性不是调节免疫活性和/或细胞增殖紊乱(如癌症)，但在其中的某处含有所述YSV肽或其一种功能衍生物的氨基酸序列的基因工程化肽或多肽不是“基本由”YSV肽或其一种功能衍生物组成的肽或多肽。
通过使用本文提供的针对所述YSV肽的测定调节免疫活性和/或调节细胞增殖紊乱(如癌症，包括但不限于宫颈癌、肝癌和白血病)的分析来测定肽或多肽的活性，本领域技术人员可容易地确定肽或多肽是否符合前述定义的基本上由YSV肽或其一种功能衍生物组成。同样，通过使用本文提供的针对所述YSV肽的调节细胞增殖紊乱(包括但不限于癌症，所述癌症包括但不限于黑素瘤、肺癌和癌影响的肺组织)的分析来测定肽或多肽的活性，本领域技术人员可容易地确定肽或多肽是否符合前述定义的基本上由YSV肽或其一种功能衍生物组成。
在优选的实施方案中，术语“基本上由.....组成”是指除了所述YSV肽或其一种功能衍生物之外另外还有少于20个氨基酸残基的肽和多肽。在更优选的实施方案中，该术语是指除了所述YSV肽或其一种功能衍生物之外另外还有少于15个氨基酸残基的肽。在进一步优选的实施方案中，该术语是指除了所述YSV肽或其一种功能衍生物之外另外还有少于10个氨基酸残基的肽。在另一优选的实施方案中，该术语是指除了所述YSV肽或其一种功能衍生物之外另外还有少于6个氨基酸残基的肽或多肽。在另一优选的实施方案中，该术语是指除了所述YSV肽或其一种功能衍生物之外另外还有少于4个氨基酸残基的肽或多肽。在最优选的实施方案中，该术语是指除了所述YSV肽或其一种功能衍生物之外另外还有少于2个氨基酸残基的肽或多肽。
药物制剂可包括任何已知的药物载体。合适的载体的实例包括本领域技术人员已知的任何标准药学上可接受的载体。这些载体包括但不限于生理盐水、水、乳液(包括油水混合物或甘油三酸酯乳液)及其他类型的试剂、填料、包衣片剂和胶囊。可根据药物组合物的给药方式选择合适的载体。
所述YSV肽及其功能衍生物可经静脉注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射、皮下植入给药。所述肽还可以任一口服给药形式如片剂、胶囊、悬液、溶液等，以未经修饰的常用形式或缓释形式或肠胃道保护或不保护形式给药。所述肽可进一步以任何局部应用的形式如软膏、霜、凝胶等经过或不经过皮促进装置给药(transdermal facilitating device)。肽还可转化成其遗传序列并克隆进表达系统，或以其本身或与其他肽序列组合以产生肽分子而利用本文所述肽的活性。
每种肽的剂量可以是1ng-10g/kg体重。注射用给药剂量可以是10ng-10mg/kg，更优选1μg-1mg/kg。药物的起效剂量可以低至1ng/kg体重，这可通过一个或多个肽与受体结合诱导一系列正常机体反应而起效。或者一个或多个肽直接诱导引起全系列反应。对于口服，给药剂量可以是1ng-10g/kg体重/天，优选0.1μg-1g/kg体重/天，更优选是1μg-10mg/kg体重/天。
I.有关YSV肽作用的实施方案1.1用于2.1-2.4的材料BALB/c小鼠，体重18-22g，中国医学科学院实验动物中心提供。
YSV由CS Bio，USA定制。
胎牛血清(FBS)和RPMI-1640细胞培养基由美国Gibco公司提供。
四甲基偶氮唑盐(MTT)和刀豆蛋白A(ConA)由美国Sigma公司提供。
人肝癌细胞BEL7402由中国医学科学院癌症研究所提供。
人白血病细胞K562由中国医学科学院血液疾病研究所提供。
人宫颈癌海拉(Hela)细胞由天津医科大学免疫学研究所提供。
2.1YSV对体外T淋巴细胞转化的作用2.1.1方法(如参考文献1所述，该文献通过引用结合到本文中)将健康的小鼠颈椎脱臼致死。无菌操作取脾。将脾淋巴细胞悬浮液洗涤并用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基调节至细胞密度为5×106/ml。用RPMI-1640培养基稀释YSV至各种浓度2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml。刀豆蛋白A工作液用RPMI-1640培养基调节至1mg/ml。
将所述反应剂如下加入96孔细胞培养板中100μl/孔的淋巴细胞悬浮液，20μ1/孔的ConA和100μl/孔的各种浓度的YSV溶液，各浓度设置6个平行孔；向12个平行孔中加入100μl/孔的淋巴细胞悬浮液和120μl/孔的RPMI-1640培养基(含10％FBS)作为负对照；向12个平行孔中加入100μl/孔的淋巴细胞悬浮液，100μl/孔的RPMI-1640培养基(10％FBS)和20μl/孔的ConA作为正对照。
将所述细胞在37℃、5％CO2下培养68小时，随后在150g下离心10min。弃上清液后，向细胞沉淀中加入50μl/孔的1mg/ml MTT的RPMI-1640溶液，振荡2min后再制成悬浮液。继续培养4小时。在150g下离心10分钟，弃上清液。用滤纸吸干后，将细胞与120μl 40mM的盐酸-2-丙醇混合，并振荡3min。在ELISA-reader上测定每孔的吸光度(OD值)，测定波长570nm，参考波长630nm。
2.1.2结果表1YSV对T淋巴细胞转化的作用
*与负对照组比较，P＜0.0012.1.3结论在浓度为0.016μg/ml至2μg/ml时，YSV能够刺激体外T淋巴细胞转化活性，具有统计学意义(p＜0.001)。
2.2 YSV对体外培养的人肝癌BEL7402细胞增殖的作用2.2.1方法(如参考文献2描述，该文献通过引用结合到本文中)将对数生长期的人肝癌BEL7402细胞与含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)一起培养2至3min，以将其分离。采用倒置显微镜检验细胞。在观察到细胞质致密化及细胞小室膨胀后，除去上清液。加入几毫升含10％FBS的RPMI-1640培养基以终止消化。用移液管温和地吹气收获细胞。将悬浮的细胞在150g下离心10min收集，用冷D-Hank氏溶液再悬浮和离心来进行洗涤两次。将经洗涤的细胞再悬浮于含10％FBS的RPMI-1640培养基中，调节至密度为5×104/ml。将经过处理的BEL7402细胞置于96孔细胞培养板，每孔100μl。将细胞在37℃、5％CO2下培养24小时，以进行预活化和附着。
该试验包括三组具有不同YSV浓度的测试组和负对照组。YSV在培养基中的最终浓度为20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。在负对照组中，YSV溶液采用含10％FBS的RPMI-1640培养基替代。每组包含5个平行孔。将细胞在37℃、5％CO2下培养48小时。
随后通过在150g下离心10min以沉淀细胞。除去上清液后，将100μl/孔的0.5mg/ml MTT的RPMI-1640溶液加入所述细胞沉淀中，并通过振荡2min将细胞重悬浮。继续培养4小时。在150g下离心10min后除去上清液。用滤纸吸干后，将100μl/孔40mM的盐酸-2-丙醇加入细胞沉淀中并振荡3min。在ELISA-reader上测定每孔的吸光度(OD值)，测定波长570nm，参考波长630nm。
2.2.2结果表2YSV对人肝癌BEL7402细胞生长的体外抑制作用
*与负对照组比较，P＜0.052.2.3结论在浓度为5μg/ml至20μg/ml时，YSV能够抑制体外人肝癌细胞BEL7402的生长，并具有统计学意义(p＜0.05)。
2.3 YSV对体外培养的人白血病K562细胞的增殖的作用
2.3.1方法(如参考文献2所述，通过引用结合到本文中)用含10％FBS的RPMI-1640培养基将处于对数生长期的人白血病K562细胞调节至密度为5×104/ml。将所述细胞置于96孔细胞培养板中，每孔100μl。将细胞在37℃、5％CO2下培养24小时。该试验包括五组在培养基中具有不同YSV浓度的测试组和仅含培养基的负对照组。YSV的最终浓度为40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml和5μg/ml。每组包含5个平行孔。将100μl/孔测试溶液加入经处理的细胞中。将细胞在37℃、5％CO2下培养48小时。
随后通过在150g下离心10min沉淀细胞。除去上清液后，将100μl/孔的0.5mg/ml MTT的RPMI-1640溶液加入所述细胞沉淀中，并通过振荡2min将细胞重悬浮。继续培养4小时。在150g下离心10min后除去上清液。用滤纸吸干后，将100μl/孔40mM的盐酸-2-丙醇加入细胞沉淀中并振荡3min。在ELISA-reader上测定每孔的吸光度(OD值)，测定波长570nm，参考波长630nm。
2.2.2结果表3YSV对人白血病K562细胞的体外抑制作用
*与负对照组比较，P＜0.052.3.3结论在浓度为5μg/ml至40μg/ml时，YSV能够抑制体外人白血病K562细胞的生长，并具有统计学意义(p＜0.05)。
2.4对人宫颈癌海拉细胞生长的体外抑制作用2.4.1方法(如参考文献2所述，通过引用将其结合到本文中)
将处于对数生长期的人宫颈癌海拉细胞与含0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的PBS培养一起培养2至3min，以将其分离。采用倒置显微镜检验细胞。在观察到细胞质致密化及细胞小室膨胀后，除去上清液。加入几毫升含10％FBS的RPMI-1640培养基以终止消化。用移液管温和地吹气收获细胞。将悬浮的细胞在150g下离心10min收集，用冷D-Hank氏溶液再悬浮和离心来进行洗涤两次。将经洗涤的细胞再悬浮于含10％FBS的RPMI-1640培养基中，调节至密度为5×104/ml。将经过处理的细胞置于96孔细胞培养板，每孔100μl。将细胞在37℃、5％CO2下培养24小时，以进行预活化和附着。
该试验包括两组在培养基中具有不同YSV浓度的测试组和仅含培养基的负对照组。YSV在培养基中的最终浓度为10μg/ml和5μg/ml。每组包含5个平行孔。在经处理的细胞中加入100μl孔的测试溶液。将细胞在37℃、5％CO2下培养48小时。
随后通过在150g下离心10min以沉淀细胞。除去上清液后，将100μl/孔的0.5mg/ml MTT的RPMI-1640溶液加入所述细胞沉淀中，并通过振荡2min将细胞重悬浮。继续培养4小时。在150g下离心10min后除去上清液。用滤纸吸干后，将100μl/孔 40mM的盐酸-2-丙醇加入细胞沉淀中并振荡3min。在ELISA-reader上测定每孔的吸光度(OD值)，测定波长570nm，参考波长630nm。
2.4.2结果表4YSV对人宫颈癌海拉细胞生长的体外抑制作用
*与负对照组比较，P＜0.052.4.3结论在浓度为5μg/ml至10μg/ml时，YSV能够抑制体外人宫颈癌海拉细胞的生长，并具有统计学意义(p＜0.05)。
2.5 YSV对移植于裸鼠上的人白血病K562生长的作用2.5.1材料YSL深圳康哲药业有限公司定制生理盐水中国OTSUKA药业公司RPMI-1640细胞培养基美国GIBCO公司胎牛血清(FBS)美国HYCLONE公司人白血病K562细胞组由中国医学科学研究院血液疾病研究所提供健康裸鼠(BALB/C(nu/nu)，SPF，雄性，年龄4-5周，体重18-22g)由中国医学科学院上海肿瘤研究所提供2.5.2方法2.5.2.1细胞培养液将K-562细胞保存在含10％FBS的RPMI-1640培养基中，37℃，5％CO2。
2.5.2.2白血病小鼠模型的制备[3]用RPMI-1640将处于对数生长期的K562细胞调节至密度为1.6×108/ml。取0.1ml经皮下注射到健康裸鼠的右胁腹，以制备白血病模型。
2.5.2.3动物分组和给药携带人白血病K562细胞的小鼠随机分成生理盐水对照组(0.2ml/天)和YSV组(160μg/kg/天)。将受测物质溶于0.2ml盐水中并在接种K562的第二天开始通过腹膜内注射给予受测化合物，在连续的30天内每天给药一次。
2.5.2.4监测参数每天检测裸鼠的全身状况，每隔3-4天检测一次肿瘤尺寸。肿瘤体积(mm3)V＝(1/6)πXYZ，其中X、Y和Z为肿瘤在三个平面上的直径。
在最后一次给予受测物质的第二天，切除下肿瘤，记录肿瘤的重量并测量肿瘤的体积。肿瘤生长抑制指数(％)＝(对照组的平均肿瘤重量-治疗组的平均肿瘤重量)/对照组的平均肿瘤重量×100。
2.5.2.5统计学方法所有数据均显示为算数平均值±SD。使用SPSS软件的ANOVA测试分析数据。P＜0.05，为具统计学意义，可被接受。
2.5.3结果表1YSV对移植于裸鼠上的人白血病K562生长的作用
*与生理盐水比较，P＜0.052.5.4.结论合适剂量的YSV能够抑制移植于裸鼠上的人白血病K562的生长，与生理盐水对照组比较，具有统计学意义(p＜0.05)。
2.6 YSV对移植于C57BL/6小鼠上的黑素瘤B16生长的抑制作用2.6.1材料2.6.1.1肽YSL深圳康哲药业有限公司定制2.6.1.2对照物质和其他试剂环磷酰胺(Cy)上海华联药业有限公司生理盐水中国OTSUKA药业公司RPMI-1640细胞培养基美国GIBCO公司胎牛血清(FBS)美国HYCLONE公司Hank氏溶液Dingtian有限公司2.6.1.3细胞系小鼠B16黑素瘤细胞系中国医学科学研究院生物化学和细胞生物学研究所提供2.6.1.4动物健康C57 BL/6小鼠(SPF，雄性，年龄4-5周，14-18g)来自军事医学科学研究院(Academy of Military Medical Sciences)2.6.2方法2.6.2.1细胞培养液将B16细胞保存在含10％FBS的RPMI-1640培养基中，37℃，5％CO2。
2.6.2.2黑素瘤小鼠模型的制备[4]用Hank氏溶液将处于对数生长期的小鼠B16黑素瘤培养物调节至细胞密度为2.5×106/ml，取0.2ml经皮下注射到健康C57 BL/6小鼠的右腋窝，以制备黑素瘤小鼠模型。
2.6.2.3动物分组和受测物质的给药将携带黑素瘤B16的小鼠随机分成生理盐水组(0.2ml/天)、环磷酰胺组(Cy)(20mg/kg/天)和YSV组(640μg/kg/天和320μg/kg/天)。将受测物质溶于0.2ml盐水中并在接种肿瘤的第二天开始通过腹膜内注射给予受测化合物，在连续的20天内每天给予黑素瘤小鼠模型一次。
2.6.2.4监测参数自肿瘤植入第二天起，每天观察小鼠的全身状况和肿瘤的生长情况。
在最后一次给予受测物质的第二天，切除下肿瘤，测量肿瘤的重量。
肿瘤抑制率(％)＝(1-测试组的平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量)×100％。
2.6.2.5统计学方法所有数据均显示为算数平均值±SD。使用SPSS软件的ANOVA测试分析数据。P＜0.05被认为具有统计学意义。
2.6.3结果表1YSV对C57 BL/6小鼠上的黑素瘤B16生长的抑制作用
*与生理盐水比较，P＜0.052.6.4.结论在合适剂量下，YSV能够抑制C57 BL/6小鼠上的黑素瘤B16的生长，与生理盐水对照组比较，具有统计学意义(p＜0.05)。
2.7 YSV对裸鼠上的A549人肺癌异种移植物的抑制作用2.7.1材料2.7.1.1肽YSV美国CS Bio公司定制合成2.7.1.2对照物质和其他试剂环磷酰胺(Cy)上海华联药业有限公司生理盐水中国OTSUKA药业公司胎牛血清(FBS)美国HYCLONE公司RPMI-1640细胞培养基美国GIBCO公司2.7.1.3动物健康BALB/C(nu/nu)无胸腺裸鼠(SPF,年龄4-5周，体重18-22g)购自中国医学科学院上海肿瘤研究所。第一个实施方案使用雌性小鼠。第二个实施方案使用雄性小鼠。
携带A549人肺癌异种移植物的裸鼠来自中国医学科学院上海肿瘤研究所。
2.7.2方法2.7.2.1肺癌裸鼠模型的制备[5]选择直径长度大于1cm并在裸鼠上良好生长的A549人肺癌异种移植物。无菌切除肿瘤块，切成2-4mm3的片并浸入RPMI1640中。经胸腹切口，将肿瘤块经皮下移植到健康裸鼠的背部接近颈部以制备肺癌裸鼠模型。
2.7.2.2分组和给药方法将携带A549异种移植物的裸鼠随机分成生理盐水对照组(0.2ml/天)、不同剂量的YSV组和Cy对照组(0.2mg/kg/天)。将受测物质溶于0.2ml盐水中并在接种肿瘤的第二天开始通过腹膜内注射给予受测化合物，在连续的40天内每天给予黑素瘤小鼠模型一次。
2.7.2.3监测参数每天观察小鼠的全身状况。每3-4天测量小鼠的重量并测试肿瘤的体积V＝(1/6)πXYZ，其中X、Y和Z为肿瘤在三个平面上的直径。
在最后一次注射的第二天，切除下肿瘤，测量肿瘤的重量和体积。检验肿瘤坏死的情况。
肿瘤抑制指数(％)＝(生理盐水组的平均肿瘤重量-治疗组的平均肿瘤重量)/生理盐水组组的平均肿瘤重量×100％。
选择部分具有良好生长条件和坚实密度并且没有溃疡或坏死的肿瘤，修整并用10％甲醛固定以进行病理学试验。
2.7.2.4统计分析执行SPSS软件，利用一元方差分析(one-way ANOVA analysis)进行统计分析。
2.7.3结果表1YSV对移植于雌性裸鼠上的A549人肺癌的生长的抑制作用—实验1
*与生理盐水比较，P＜0.05表2YSV对移植于雄性裸鼠上的人肺癌的生长的抑制作用—实验2
*与生理盐水比较，P＜0.052.7.4.结论合适剂量的YSV能够抑制移植于裸鼠上的A549人肺癌异种移植物的生长，与生理盐水对照组比较，具有统计学意义(p＜0.05)。
3.总结论YSV显示出能够促进T淋巴细胞的转化，表明其可用作人用的免疫调节剂。
YSV显示出能够抑制体外人肝癌细胞BEL7402、人白血病细胞K562、人宫颈癌海拉细胞的生长，以及体内人白血病细胞K562、鼠科B16黑素瘤细胞和A549人肺癌细胞的生长，表明YSV可用于治疗人细胞增殖疾病。
4.参考文献1.徐叔云、卞如濂和陈修，药理实验方法学(第3版)，人民卫生出版社，2002，第1427页；2.徐叔云、卞如濂和陈修，药理实验方法学(第3版)，人民卫生出版社，2002，第1785-1786页；3.Potter G K，Shen R N，Chiao J W et al.Nude mice as models for humanleukemia studies.Am J Pathol，1984，114360；4.Zhunjiang Xie，Wenqing Liu，Yechun He et al.The inhibition of ginsengglycan and IL-2 on mice melanoma cells in vivo.ACTA ANATOMICA SINICA，2002，33(5)538-540；
5.Hanyue，抗癌药物的研究和实验技术(第一版)，北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社(1997)299。
II.基因治疗及治疗方法基于上述肽序列的基因疗法是通过设计编码这些肽之一的核酸序列而进行。核酸可化学合成并与启动子有效连接而克隆到表达载体内。表达载体随后以基因治疗的形式给予人体，以在人体细胞内表达。本文所采用的“基因载体”一词包括这些表达载体。可以用于基因治疗的载体包括腺相关病毒(Mizuno，M等(1998)，日本癌症研究杂志89，76-80)、LNSX载体(Miller，A.D.等(1993)酶学方法217，581-599)和慢病毒(Goldman，M.J.等(1997)人类基因治疗8，2261-2268)。
用于肽输送的其它载体包括可在宿主生物体中复制的生物中的编码所需肽的表达载体，该宿主生物体希望被给予该肽而不明显影响该宿主生物体的健康。例如，表达载体可以被转移至对希望被给予该肽的宿主生物体是非致病性的生物体中。在某些实施方案中，表达载体在一种对希望被给予该肽的宿主生物体的健康没有明显有害作用的细菌或真菌生物中以产生所需的肽。例如，编码所需的肽的表达载体可以是在如乳酸菌、大肠杆菌或酵母的生物体中产生所需的肽的表达载体。在一个实施方案中，表达载体在一种哺乳动物消化道中天然存在的微生物或哺乳动物消化道耐受的微生物中产生所需的肽。可以表达所需的肽的一些微生物物种包括但不限于乳杆菌菌种，如L.acidophilus，L.amylovorus，L.casei，L.crispatus，L.gallinarum，L.gasseri，L.johnsonii，L.paracasei L.plantarum，L.reuteri，L.rhamnosus，等；双歧杆菌菌种，如B.adolescentis，Banimalus，B.bifidum，B.breve，B.infantis，B.lactis，B.longum等；Enterococcus faecalis或Ent.facium；Sporolactobacillusinulinus；Bacillus subtilis或Bacillus cereus；Escherichiacoli；Propionibacterium freudenreichii；或Saccharomyces cerevisiae或Saccharomyces boulardii。
化学合成的或以其它方式包括但不限于将mRNA逆转录产生cDNA分子而产生的编码本发明肽的核酸序列被掺入表达载体中，以通过本领域已知的基因工程方法基因转移进所希望的宿主中。表达载体可以是DNA载体或RNA载体。例如，表达载体可以基于质粒或病毒遗传元件。表达载体可以是染色体外复制的载体或者整合进染色体的载体。
表达载体包括与编码本发明肽的核酸有效连接的启动子。启动子可以是可调控的启动子，如诱导型启动子或组成型启动子。在一些实施方案中，可以选择启动予以提供所需水平的肽表达。另外，如果需要，表达载体可以包括其它序列以促进肽的产生、呈递和/或分泌。在一些实施方案中，编码本发明肽的核酸与指导肽分泌的核酸序列有效连接。例如，编码本发明肽的核酸可以与编码信号肽的核酸序列有效连接。
在一些实施方案中，被工程化以编码本发明肽的表达载体可以是适于在组成哺乳动物正常消化道菌群的细菌菌种如乳杆菌菌种和枯草芽孢杆菌中表达本发明肽的表达载体。这种表达载体的例子可参见美国专利6,100,388和5,728,571。这些文献以其全文引入本文作参考。应理解的是促进本发明肽在不损害希望给予该肽的宿主生物体的健康的生物体中的表达的任何表达载体均可使用。
在一些实施方案中，被工程化以编码本发明肽的表达载体可以是适于在被哺乳动物消化道耐受的酵母菌种如Saccharomycescerevisiae或更优选地Saccaromyces boulardii(其可在人消化道中寄居并用于治疗某些形式的腹泻)中表达本发明肽的表达载体。组成性表达异源蛋白和肽的酵母表达载体可以使用，因为其非常稳定，因此在有丝分裂和减数分裂过程中可以传递至子代，所述载体可包括信号肽或指导重组蛋白高水平分泌的编码序列。这种酵母载体的例子参见美国专利6,391,585，该文献引入本文作参考。
编码本发明肽的表达载体可以经本领域已知技术导入欲表达该肽的生物体中。这些技术包括转化细菌、酵母或其它微生物的传统方法，例如经使用化学感受态细菌细胞、电穿孔或乙酸锂转化(用于酵母)，以及用这些程序无效的一些细菌菌种的转化方法的最近进展。在一些实施方案中，表达载体用Leer等(WO95/35389)公开的方法导入已知不能转化的乳酸菌中(该文献引入本文作参考)。导入的序列可以掺入微生物染色体DNA中或保持染色体外DNA元件的形式。
含有表达载体的这一基因工程微生物随后可以接种消化道、阴道、气管等以实现免疫治疗。在一些实施方案中，表达本发明肽的生物体以无活性形式摄入，或者优选地，以活性形式摄入。在消化道中，这些微生物产生所述肽，通过分泌或微生物的裂解将其释放进腔内，或以其它方式将肽呈递给宿主，由此肽产生其对宿主生物体的预期作用。在其它实施方案中，在鼻通道、阴道或小肠粘膜处将肽呈递给宿主生物体。
另一种治疗方法是使用脂质体作为输送特异核酸至人体细胞的方式。核酸(如含有编码SEQ ID NO1-30的肽的核酸的表达载体)在有利于细胞吸收和染色体掺入的环境中被输送，如Gao，X.和Huang，L.(1995)基因治疗2，710-722和美国专利6,207,456所述。或者，使用US6,245,427的方法，肽本身可包在脂质体中并直接输送。上述所有科学出版物和专利均引入本文作参考。
可用于上述基因治疗和治疗方法的核酸序列包括编码这些肽及其功能衍生物的序列。基于简并密码系统，许多核酸序列中的任何一种均可用于编码这些肽及其衍生物。
下述参考文献引入本文作参考1.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，713_1352.徐叔云，卞如濂，陈修主编。药理实验方法学。1991，1221-12343.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，71404.何金生，李瑞珠，宗庭益。MTT还原法检测NK细胞活性的方法学研究。中国免疫学杂志，1996；1(6)356-3585.汪谦.现代医学实验方法。人民卫生出版社。1998，482-4836.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，71417.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，7132-1338.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，7128-1299.章元沛，苏怀德.药理学实验(第二版).人民卫生出版社.1998，137-13810.李家泰.临床药理学(第二版).人民卫生出版社.1998，1338-1339III.YSV及其衍生物的肽结合物与配方本发明的生物活性肽可与其它具生物学效应或作用的分子相结合，来提供额外的效果或作用，或者增强它们的治疗效力。许多可能的结合分子，它们的生物学作用以及与肽相结合的方法在本领域内是熟知的。对于其它可能的结合物而言，结合到肽的化学反应可由本领域的技术人员无需经过过度实验而推导出。效应分子(effective molecule)会在下文描述。具体的例子中描述了本发明的各种肽如何与它们的效应分子相结合，以及作为结果的结合产物的特性。可以理解的是，本发明的其它肽也可在类似的反应中被结合。
YSV及其衍生物在特定的细胞或组织类型中具有独特的医疗效力。将分子结合到肽药物的一个重要目的是为了将肽定位于被治疗个体体内的特定位置或区室(compartment)。在这种方式中，肽药物及其效应分子可被集中在细胞或组织类型的特定区域，在所述的特定区域中，药物具有预期的治疗效果。这样能增加相同摩尔数量的、游离的、非结合的肽可能具有的效果。相反地，被定位在其治疗活性位点的结合肽药物的剂量可以显著的低于为取得相同治疗效果所需要的、游离的、非结合形式药物的剂量。
将肽药物定位在最容易发挥其活性的位点的另一个有益效果在于，减少了不必要的副作用。给予的肽药物是为了在特定细胞或组织类型中实现一种变化，但是所给予的肽药物在个体体内也会在其它部位发挥作用，有时带来有害的结果。通过与一个定位分子(targeting molecule)结合而将肽定位在所需要的活性位点，可以减少在该个体中其它部位的所述肽的浓度以及带来的副作用。
包含YSV或其功能衍生物之一的肽、基本由YSV或其功能衍生物之一组成的肽或者由YSV或其功能衍生物之一组成的肽，为了定位到个体体内全身的不同部位，可与不同的分子相结合。下文所描述的将肽定位到所需位置的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其他结合技术，可被应用于本发明的任意的肽。例如，文献公开了抗乙型肝炎的药物的选择性传递到肝细胞(Fiumeetal.，Ital J Gastroenterol Hepatol，29(3)275，1997，which is incorporated herein by reference in its entirety)。在该项研究中，研究者将腺嘌呤阿拉伯糖苷一磷酸盐(adenine arabinoside monophosphate，简称ara-AMP)，一种活性对抗乙型肝炎病毒的磷酸化的核苷类似物，结合到乳糖化的人清蛋白(lactosaminated human albumin)，一种末端为半乳糖基的高分子。肝细胞表达一种能与末端的半乳糖残基起高亲和力反应的受体蛋白。通过结合在该受体上，结合药物能够被肝细胞选择性的吸收。吸收以后，结合药物被运输到溶酶体，在那儿，结合药物两部分之间的键被断开，以其活性形式释放ara-AMP。在上述所引用的研究中，结合药物在治疗慢性乙肝感染的病人时，与游离的ara-AMP具有同样的效果，但不会导致临床副作用，例如施用游离的ara-AMP所导致的神经毒性。这样的途径可用于本发明的任意的肽。
在上述相关的一个研究中，同一个研究团队(Di Stefanoet al.，Biochem.Pharmacol.，61(4)459，2001)将一种抗癌的化学疗法试剂，5-荧光-2脱氧尿苷(5-fluoro2-deoxyuridine，简称FUdR)，结合到乳糖化的聚L-赖氨酸(lactosaminated poly-L-lysine)上，以达到将化合物定位在肝以及治疗肝癌的微小转移。药物被肝细胞选择性吸收，并打断FUdR与目标分子之间的化学键。然后，部分游离的FUdR离开肝细胞，抗癌试剂停留在肝细胞中形成集中的治疗浓度。这种浓度对于渗透到肝脏中的转移细胞的药理学活性是足够的。由于这种结合药物是选择性集中在肝脏中，因此其剂量与游离的、非结合化合物的最小药理学活性剂量相比，显著降低。这种策略可应用到本发明的任意的肽。例如，乳糖化的聚L-赖氨酸(lactosaminatedpoly-L-lysine)与YSV的结合可以显著的减少在个体中为治疗乙型肝炎感染和肝癌的必需的剂量。
将化合物定位在体内特定组织或细胞类型已成功应用于大量的不同组织或细胞类型中。例如，肿瘤细胞常常在其表面表达非正常的高水平的肽激素受体，比如蛙皮素(bombesin)、促黄体生成素释放激素及生长激素抑制素。在一项研究中，抗癌化合物太平洋紫杉醇(紫杉醇)通过与奥曲肽，一种生长激素抑制素类似物相结合，被选择性定位到分泌激素的肿瘤细胞，这种肿瘤细胞高密度地表达生长激素抑制素受体。结合奥曲肽的紫杉醇与游离的紫杉醇具有相同的效果，但能减少对正常细胞的毒性(Huang et al.，Chem.Biol.，7(7)453，2000)。本发明的几种肽，例如CMS024和CMS034，在动物研究中显示出有效的抗癌活性。利用Huang等人的技术，将这些肽与奥曲肽相结合，可以形成一种可能的抗癌治疗方法，特别是针对高水平表达生长激素抑制素的肿瘤细胞。这种途径可适用于过量表达任何数量肽激素受体的目标肿瘤细胞。在另一个将药物定位到特定组织类型的例子中，聚L-天门冬氨酸被用来作为一种携带分子(carrier molecule)，特异性地将药物定位运送到结肠细胞(Leopold et al.，J.Pharmacokinet.Biopharm.，23(4)397，1995)。
除了肽药物到特定细胞或组织类型的特异性定位以外，肽与携带分子的结合可以提供增强肽药物的运输的其它方式，从而增加或从另一方面改善它们的治疗效果，所述肽包含YSV或其功能衍生物、基本由YSV或其功能衍生物组成或者由YSV或其功能衍生物组成。下文描述的任一结合技术以及本领域技术人员所熟悉的其它技术，可被用于本发明的任意的肽。如果化合物不能被运送到其高效的目标位置，任何药物的效力将会受到限制。药物必须在不存在由于新陈代谢过程或降解造成实质上的活性降低的情况下才能被积极地转运到其活性位点。
肽药物受肽酶活性的支配，并且，作为高带电分子，难于完成跨脂质细胞膜及内皮细胞的运输，例如血脑屏障。与其他分子的结合提供了一种保护肽避免降解，以及增强肽药物进入细胞或机体内区室的方式，而通常情况下，细胞或机体内区室会排斥该化合物。
通过允许肽进入到体内特定区域(而通常情况下，在这些区域中，肽会被排斥)，结合技术开启了给药的新途径。在Pateletal.，BioconjugateChem.，8(3)434，1997，其化学过程在下文实施例5中进行了详细描述，并在此处作为参考全文引用，研究者将一种已知作为有效止痛剂的肽药物，七肽δ啡肽(heptapeptide deltorphin)，与一种有机分子相结合，该有机分子经过特殊设计以允许肽穿过血脑屏障。这样药物可通过静脉给药，而不用通过脑室注射。
Patel等人研究中的携带分子被设计来特异性针对那些含有血脑屏障的内皮细胞，同时也允许肽穿越这些屏障。遍及全身的内皮细胞膜，包括血脑屏障，对于序列特异性及表达在其表面的膜结合肽链内切酶的浓度是不同的。分子的设计利用这种特性来使携带分子及其携带物的定位成为可能。该分子含有三条游离端标记了二肽Arg-Pro的脂肪酸链，其与血脑屏障的肽链内切酶优先结合。亲脂性的脂肪酸链使带电荷肽药物分子的转运成为可能。从而，标记二肽的甘油三酸酯分子既可实现定位也可实现跨血脑屏障的转运。
结合方法也可增强肽药物活性的动力学。下文所描述的用于增强肽活性动力学的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它结合技术都可用于包含YSV或其功能衍生物的肽、基本由YSV或其功能衍生物组成的肽或者由YSV或其功能衍生物组成的肽。Patel等人发现止痛剂肽的结合形式不仅能够从血流中进入脑，而且与游离肽相比较具有相同的反应性。比之颅内注射的游离肽的效果，静脉给药的药物需要更长时间来发挥治疗效果，但是效果的持续时间更长，减少得更慢。研究者们发现结合肽分子在血清中非常稳定，但注射入脑室中却无效果，显示出携带分子可能是在从血流转运到脑的过程中被降解和移除。他们猜测，转运结合物及降解携带分子所需要的时间是导致动力学改变的原因。不考虑延迟的力学，在临床应用中，结合肽分子的静脉稳定性、延迟发作以及药物效果的活性意味着它可以不用频繁地给药。更低的频率以及更方便的剂量给药时间表增强了这种药物作为可选治疗方案的应用价值。
对于本领域技术人员显然的是，Patel等人的技术和过程可以容易的适用于任何落入到有限大小范围的肽的运送，包括本发明的任意的肽。例如，本发明的一种肽，其显示出抗癌效果，比如YSV，能够与Patel等人所用的同样的分子相结合。在一个带有脑肿瘤的个体的治疗中，结合分子可允许YSV从血流中进入脑，并允许YSV在脑内的肿瘤组织中发挥作用。改变携带分子的定位的修饰对这个人同样显著。携带分子的定位特性是在脂肪酸链末端含有二肽修饰的两种氨基酸的特点的作用。Arg-Pro二肽与发现位于血脑屏障的内皮膜表面的一批膜结合肽链内切酶优先结合。其他的内皮细胞和膜可能通过其它二肽结合物被定位。
研究者们也利用结合状态来制造可通过消化道或者透皮被有效吸收的肽药物。下文所描述的用于增强吸收的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它结合技术，都可被用来增强包含YSV肽或其功能衍生物的肽的吸收、基本由YSV肽或其功能衍生物组成的肽的吸收或者由YSV肽或其功能衍生物组成的肽的吸收。Kramer等人描述了一种将肽药物连结到胆汁酸的过程。化合物口服给药之后的结合分子的吸收率与单独的肽相比显著增强(J.Biol.Chem.，269(14)10621，1994)。Toth等人(J.Med.Chem.，42(19)4010，1999)描述了将具有抗肿瘤特性的肽药物与脂氨基酸(lipoamino acid，简称LAA)或脂多糖(liposaccharides，简称LS)的结合，目的是为了增加吸收率以及增强抗癌肽到其活性位点的递送。在他们的研究中，生长激素抑制素的一种衍生物与LAA或LS中的任一个相结合，这种衍生物显示出很强的抗增殖特性，但具有削弱的药代动力学(pharmokinetics)。得到的结合药物具有跨皮肤和消化道上皮细胞的改善的吸收谱(absorption profile)，增加了抗降解的能力，并依然具有抗肿瘤细胞活性。这些技术与本发明的任意的肽相结合后将非常有用。通过增加分子的跨肠道上皮细胞的吸收率，更多的肽可被运送到血液中并在被治疗的个体体内发挥作用。
结合(Conjugation)也可被用来提供肽药物的持续的释放。用于提供持续释放的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其他结合技术，都可用于提供肽的持续释放，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物组成或者由YSV肽或其功能衍生物组成。如上文Patel等人的工作中所看到的，肽药物的持续的递送可通过结合方法达到。另一个例子是Kim等人的工作(Biomaterials，232311，2002)，在他们的工作中，重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，简称rhEGF)在被装入生物所能分解的聚乳酸聚甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球体胶囊以前，与聚乙烯乙二醇(polyethylene glycol，简称PEG)相结合。装入PLGA微胶囊被好几个小组用于递送不同的生长因子和形态发生蛋白(Meinel et al.，J.ControlledRel.，70193，2001)。与非结合的游离rhEGF相比较，通过与PEG结合，rhEGF可避免形成不溶于水的聚合体形式以及在与PLGA形成胶囊过程中吸附在水-有机相分界面。
与游离的激素相比较，具有结合激素的配方所表现出的药代动力学得到改善，显示出更持久、更稳定，以及全面增强的药物活性，研究者们推测，这是由于与PEG结合的激素具有增强的生理稳定性。类似的策略可以应用来制备本发明的任意肽的持续释放的配方。例如，YSV对免疫系统细胞具有有力的刺激作用。通过将PEG结合到这种肽并将结合药物加入到PLGA微球体中，YSV随着药物的定量给药，以及随着它从PEG结合物中释放出来，对于个体的刺激作用可持续更长，更稳定，更一致，并且确保肽药物到免疫系统的更持续的递送。
肽药物的延迟释放可显著增强其活性。下文所描述的任何用于提供肽的延迟释放的结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它结合技术，都可用于提供肽的延迟释放，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物组成或者由YSV肽或其功能衍生物组成。Oldham等人(Int.J.Oncology，16125，2000)比较了抗癌试剂太平洋紫杉醇与该药物的一种新形式，太平洋紫杉醇结合到聚L-谷氨酸(PG-TXL)。PG-TXL相比较游离的太平洋紫杉醇，显示出具有较高的抗癌活性，暗示该药物具有较好的药代动力学特性或者甚至具有更优的作用方法。然而，调查者发现PG-TXL通过与游离药物相同的作用机理来发挥作用，通过打乱微管亚单位的聚合来诱导细胞周期的停止。证据显示，与游离肽给药相比，结合药物的更好的抗癌活性来自于游离药物从结合物中的持续并稳定的释放，并更长时间地维持其治疗浓度。本发明的具有抗癌特性的肽，例如CMS008，其所增加的聚L-谷氨酸尾端也能够增强杀死肿瘤的能力。
在一些例子中，肽的酶降解可能会降低肽作为药物的效力。下文所描述的减少肽的酶降解的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它结合技术，可用于减少肽的酶降解，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物组成或者由YSV肽或其功能衍生物组成。研究者们已开发出很多方法来保护肽免受消化道中腔体分泌的蛋白酶以及结合在膜上的肽酶的降解。后者被发现位于所有粘膜组织的表面，而跨越粘膜组织经常是肽药物的进入路线。Bernkop-Schurch等人(J.Drug Target.，755，1999)，报道了含有胃蛋白酶抑制剂的肽药物配方的构建。一种胃酶抑素的类似物共价结合在粘膜附着聚合体(mucoadhesive polymer)上；这种新的胃蛋白酶抑制剂包含在含有胰蛋白酶的药片中。在模拟消化过程的实验室条件下的培养之后，对照药片的所有的胰蛋白酶都被代谢，然后在含有这种抑制剂的药片中大约50％的胰蛋白酶被保护不受降解。在另一项研究中，同一个研究小组利用蛋白酶抑制剂在通常会导致毒副作用的剂量下来抑制生物活性肽的降解(Bemkop-Schnurch etal.，Adv.Drug Del.Rev.，52127，2001)。该方法利用壳聚糖，一种从壳质中提取的与纤维素相关的氨基多糖，在甲壳类和其他生物体中发现的一种主要的结构多糖。通过将蛋白酶抑制剂结合到壳聚糖，以及在肽药物配方中包括这种结合分子，发现消化道蛋白酶的显著的抑制，增加了肽的生物利用率，并且没有在给予游离的蛋白酶抑制剂时可预见的副作用。在该研究中，各种蛋白酶抑制剂被单独以及联合使用来与壳聚糖携带物相结合。壳聚糖-EDTA结合物同样通过结合某些蛋白酶发挥活性所必需的无机辅助因子来抑制内生性蛋白酶。对于本领域技术人员显而易见的，携带分子(carrier molecule)与效应部分(effector moiety)之间的大量的可能的组合可以被构建来为肽配方提供有益的特性，它们中的任何一种均可容易地适用于本发明的肽。利用连接在壳聚糖的蛋白酶抑制剂，通过构建肽的口服给药配方，YSV的口服给药可被用来代替肌肉注射。这种方法并没有排除在配方中使用更容易被吸收的YSV的结合形式，来构建这种肽及其衍生物的更高水平的生物利用度。
除了被另一个分子定位在特定区域，肽自身可作为定位分子。下文所描述的任何利用肽来将分子定位到所希望区域的结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它定位技术，均可用于包含YSV肽或其功能衍生物的肽、基本由YSV肽或其功能衍生物组成的肽或者由YSV肽或其功能衍生物组成的肽。例如，研究者们已使用抗癌药物二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine，简称DFMO)，并为了定位将其结合到肽上。DFMO是一种高效的细胞毒素试剂，它可有效地杀伤多种的癌细胞类型。然而，由于它会很快地从体内被清除，它的治疗价值受到限制。在该项研究中，将DFMO结合到一个特殊的促黑细胞激素片段和含有两种氨基酸取代基的类似片段，其显示出能优先结合到人类黑素瘤细胞系促黑细胞激素受体(Suli-Vargha et al.，J.Pharm.Sci.，86997，1997)。为使DFMO从肽片断中通过氨基肽酶方便释放，药物被结合到肽的N末端。研究者们发现结合药物在杀伤黑素瘤细胞时比单独的非结合药物更有效。
本发明的肽的作用可部分的归因于肽自身的内在的定位能力。例如，像促黑细胞激素片断α，本发明的特定的肽可联结到某一受体，该受体被发现位于一种独特类型细胞的表面。通过使用该肽作为结合体，药物可被定位在用该药物治疗的个体体内的那些细胞的特定区域。
作为结合物的肽可发挥除定位以外的其它功能。下文所描述的任何提高肽的治疗效果的结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其他结合技术，均可用于增强肽的治疗效果，所述肽包含YSV肽或其功能衍生物、基本由YSV肽或其功能衍生物组成或者由YSV肽或其功能衍生物组成。Fitzpatrick等人通过在两个分子之间使用肽间隔，改进了结合抗癌试剂(Anticancer Drug Design，101，1995)。已将甲氨蝶呤(Methotrexate)与人血清蛋白(HSA)相结合，来增加被肿瘤细胞吸收以及抗肿瘤细胞的能力。一旦被细胞吸收，一些甲氨蝶呤被溶酶体中的酶从结合物中释放，并可发挥其细胞毒素作用。通过在甲氨蝶呤与容易被溶酶体酶消化的HAS之间插入一个四氨基酸的连接肽，增加了细胞内由结合分子产生的活性甲氨蝶呤的数量。本发明的肽可通过与特殊的酶的特定反应来发挥它们的作用。通过在结合分子内合并本发明的一种肽作为药物与其携带分子之间的连接片段，或者增加另一个连接片段，药物动力学可被改变。这能够构建一种对蛋白酶的活性更具抗性或更敏感，并且随后增加或减少药物分子从结合物中的释放率的前体药物。就像上文中结合的化学治疗试剂的例子那样，药物分子递送比例的改变可大大增强药物的作用效果。
药物对于一个特定细胞的作用可根据其它因素而被改变，例如细胞的活化状态，或者细胞周围或细胞内其它分子信号的存在。在一些实例中，为了药物能够发挥作用，另一个分子或信号必须存在。Damjancic等人(Exp.Clin.Endocrin.，95315，1990)研究了人心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，简称hANP)对内糖皮质激素缺乏综合症(deficient endogenousglucocorticoid synthesis)病人的影响。肽在糖皮质激素治疗的停药期间或随后使用地塞米松进行继续治疗期间给予病人。病人只有在伴随的地塞米松治疗期间给予肽激素，才对hANP起反应并且增加利尿与钠排泄。在糖皮质激素治疗的停药期间用hANP处理无效果。协同给予类固醇激素的作用也能增强肽的活性。在Zhu等人的报道中(Acta Pharm.Sinica，28166，1993)，止痛剂肽京都啡肽(kyotorphin，简称KTP)通过经由一个短连接片段结合到氢化可的松(hydrocortisone)，其活性与单独肽的活性相比较显著增强。单独给予氢化可的松无效果。
这些研究的结果表明，类固醇激素作为结合分子的能力或者作为配方中的成分可实现或增强生物活性肽的活性。本发明的任意的肽也可通过结合到或与类固醇激素共同应用被调节或活化。Zhu等人的技术可容易的适用于类固醇分子与本发明的肽的结合。图1至5也提供了连接类固醇激素到本发明的任意的肽的典型的逐步合成反应。
上述所举的例子提供了增加本发明的任意的肽的有效性及活性的典型方式。在这一领域中进一步的发展将有助于克服障碍来构建基于肽的有效的临床治疗。对于本领域技术人员显然的，开发用于肽生物化学、制药研究及临床检测的技术、试剂以及实验规程，都可容易地应用于本发明的任意的肽。
实施例1经基因工程乳杆菌菌种输送肽以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码YSV的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列导入一表达载体中。所选的表达载体含有在乳杆菌中有功能的组成型启动子，一个用于以特异的5’至3’方向异入DNA序列的多克隆位点，以及一个赋予对抗生素的抗性的选择标记基因(以辅助克隆程序)，并且还可含有有助于肽的产生和/或分泌的其它序列，如信号肽序列。这种载体的一个例子参见美国专利5,592,908，其引入本文作参考。简要地，该专利讨论了在乳杆菌菌种中有功能的若干已知启动子，以及在所述细菌中发现新启动子的方法，这些启动子的任一种均可与编码本发明肽的核酸有效连接以在乳杆菌中表达所述肽。编码信号肽如美国专利5,592,908所述的在乳酸乳杆菌中有活性的由16-35个多数为疏水的氨基酸组成的肽的核酸被插入启动子和编码本发明肽的核酸之间，从而编码信号肽的核酸与编码本发明肽的核酸同框。
除了肽的编码序列之外，合成的DNA序列还可包括有助于将所述DNA连接并克隆进表达载体的序列。例如，相应于载体的多克隆位点的一个位点的限制酶识别位点可在序列的5’和3’端被掺入合成DNA中，从而所述序列可以正确方向克隆进载体中。载体和合成DNA用特定限制酶消化，然后纯化。载体和合成DNA连接反应后转化进大肠杆菌合适菌株中。转化的细菌在含有载体赋予抗性的抗生素的培养基上铺板。选择转化细菌的菌落进行生长培养和质粒制备。证实存在正确方向的合成DNA。
然后将表达载体转化进乳杆菌菌种如L.acidophilus的细菌宿主细胞中。通过载体序列中的选择标记选择转化的细胞，肽的分泌可通过进行Western印迹、进行存在于培养基中的肽的凝胶电泳和其它标准技术证实。选择细菌转化菌落并用于制备基因工程菌的大规模培养物。培养表达所需肽的基因工程菌的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该细菌可在其中复制的其它区域。如果需要，可以各种方式处理细菌培养物以产生由宿主肠道吸收的补剂。这些处理包括冻干或其它保存细菌的方法，另外可将细菌与载体试剂如溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳液等组合。这些试剂制备补剂的用途是本领域熟知的。例如，细菌可用于制备酸奶产品或其它食品供人类消费，从而表达肽的微生物寄居在人消化道中。将乳酸菌的特殊菌株掺入食品如酸奶、泡菜、乳酪和奶油的各种不同方法参见美国专利6,036,952，其引入本文作参考。通过任一种途径摄入细菌后，工程菌可寄居在消化道中使得经消化道的粘膜层呈递和/或吸收本发明肽。
实施例2经基因工程形式的枯草芽孢杆菌输送肽以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码表A中所列的一个肽的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列号入一表达载体中。所选的表达载体包括穿梭载体，如pTZ18R(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均能繁殖并含有抗生素抗性基因以选择转化菌落。这一载体可以含有在枯草芽孢杆菌中有活性的启动子，如衍生自枯草芽孢杆菌SscB基因的启动子，以及编码在枯草芽孢杆菌中有活性的信号或前导肽的核苷酸序列，该信号或前导肽指导表达的异源蛋白从细菌细胞中有效输出。这种载体的一个例子参见美国专利6,268,169，其引入本文作参考。简要地，如上所述，以本领域熟知的技术合成具有限制酶位点和/或促进DNA克隆的其它序列的编码本发明肽的DNA。在转化进大肠杆菌、铺板、选择和繁殖质料产生质粒原液后，将质粒转化进枯草芽孢杆菌，并根据对铺板培养基中的抗生素的抗性选择转化子。
用本领域熟知的技术如在SDS-PAGE分析或Western印迹后放射标记肽以放射自显影来证实基因工程枯草芽孢杆菌对肽的产生和分泌。
培养表达所需肽的基因工程菌的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该细菌可在其中复制的其它区域。
实施例3经基因工程糖酵母菌种输送肽以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码表A中所列的一个肽的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列导入一表达载体中。所选的表达载体包括一稳定维持的酵母蛋白表达载体，包括组成型酵母启动子如pADH1，使载体在酵母和大肠杆菌中均能复制的位点，赋予营养缺陷型酵母突变体以原养型的用于选择目的的一个或多个基因，多克隆位点(MCS)，以及如果需要的编码信号肽的序列。这种载体是市售的并是本领域熟知的或者可用标准技术构建。在将合成DNA插入酵母载体、转化进大肠杆菌、在选择培养基上铺板转化的大肠杆菌、选择转化的细菌菌落并从所述菌落的细菌培养物中制备质粒DNA后，将载体经熟知技术如乙酸锂转化或电穿孔转化进啤酒糖酵母。选择用于转化的啤酒糖酵母菌株是突变的营养缺陷型菌株，其需要质粒上的一种基因以在基本培养基上生长。通过将酵母在缺少该载体上提供的基因的培养基上铺板而选择转化的酵母菌落。只有接受的载体及其选择基因并表达该基因产物的酵母可在基本培养基上生长成菌落。通过进行Westem印迹、存在于培养基中的肽的凝胶电泳或其它标准技术可以证实肽的表达。
选择酵母转化菌落并用于制备大规模培养物。培养表达所需肽的基因工程酵母的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该酵母可在其中复制的其它区域。如果需要，可以各种方式处理酵母培养物以产生由宿主肠道吸收的补剂。这些处理包括冻干或其它保存酵母的方法，另外可将酵母与载体试剂如溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳液等组合。这些试剂制备补剂的用途是本领域熟知的。在另一实施方案中，转化的酵母可用本领域已知技术制备食品如发酵奶制品如酸奶和kefir。与这些食品中的活乳酸菌培养物一样，转化的酵母至少短时寄居在消化道中，并经消化道腔将肽提供给宿主。
实施例4将肽定位到特定的区域下文提供了一种选择性地将本发明的肽递送到特定区室、器官、细胞类型或体内特定区域的典型方法。在这一例子中，通过将YSV定位到个体的肾脏内组织来治疗肾炎。YSV经由本领域所公知的化学反应通过共价键与低分子量(loW molecular weight，简称LMW)溶菌酶(lysozyme)——一种特异地集中在肾脏组织的可通过商业途径获得的蛋白部分——相连。实现分子与LMW溶菌酶结合的技术已有文献公开(Folgertet al.，Br.J.Pharmcology，1361107，2002)。将蛋白或肽与另一个相连的常用技术在所属领域的文献中也已公开(Fischer et al.，Bioconj.Chem.，12825，2001)。然后，新构建的结合肽样品通过气相色谱(chromotography)方法，例如阳离子交换FPLC和/或梯度离心法从连接过程中所使用的化学试剂中被纯化。一旦被纯化，该结合肽给予需要治疗肾炎的个体。对于抗肾炎活性，依靠YSV与LMW溶菌酶之间的连接，其会被肾的近端小管(proximaltubule)细胞选择性吸收和代谢，YSV被优先定位到肾脏组织。与相同摩尔数量的YSV自身相比较，这种优先递送形成更强的抗肾炎作用。相反地，这能减少为达到抗肾炎活性的某一水平的肽药物的量。
实施例5增强肽到其活性位点的递送下文提供了一种增强神经活性肽(neuroactive peptide)递送到脑的典型的方法。通过本领域技术人员所熟知的化学方法合成本发明的一种的肽，其由脑的神经细胞所表达并在受体上发挥作用。或者，它也可由工程微生物表达并从这些生物体的培养物中回收得到，如上文实施例中所描述的那样。一旦以纯化的形式获得，这种肽被用于一系列的有机化学反应，来构建一个甘油三酸酯(triglyceride ester)结合部分，连接到该肽。该结合部分包括一个四位取代的碳中心，其通过一个胺键连接到肽的末端羧基碳而与本发明的肽相连接。附着在四位碳中心的另外三个基团包括与16碳脂肪酸链的碳酯联接。脂肪酸链自身末端带有被认为是肽修饰的二肽基团，其增加了链的亲水性并将它们特异性地定位于血脑屏障的内皮细胞膜。这一合成过程在Patel etal.，Bioconjugate Chem.，8(3)434，1997中进行了详细说明，并利用了本领域技术人员所熟悉的常用试剂与设备。
一旦导入到个体外围区域，该化合物经由循环系统在全身转运，与血脑屏障的内皮细胞膜相互作用。在分子跨越血脑屏障的上皮层的运输过程中，二肽修饰及脂链的逐步降解导致本发明的肽释放到脑区室中。在那儿，肽可与神经细胞表面的受体相互作用来发挥其对脑功能的影响作用。药物到达血脑屏障以及被运输到脑所需的时间，以及携带部分(carrier moiety)伴随的降解，改变了药物活力的动力学，与游离肽的脑室注射相比较，形成一个更稳定更长时间释放的效果。
实施例6构建抗酶降解的肽配方下文提供了一种构建用于口服给药的生物活性肽的配方的典型方法，其可抗在消化道表面内部以及沿着消化道表面所发现的蛋白酶及肽酶活性。在这个例子中，YSV被用于制备对病人进行口服形式给药的药物配方。如Larionova等人所描述的那样(Iht.J.Pharma.，189171，1999)，肽被用于与可溶性淀粉以及蛋白酶抑制剂----抑酶肽(aprotinin)，一起制备微粒，抑酶肽是一种由细胞腔分泌以及刷状缘(brush border)膜结合的多种蛋白酶的强烈的抑制剂。简单地说，可溶性淀粉，蛋白酶抑制剂抑酶肽以及本发明的肽溶解在一缓冲液中。可溶性淀粉，aprotinin肽的比例可根据本领域技术人员所熟悉的实验方法确定，例如，Larionova等人利用体外模拟消化试验来决定对他们研究中所用的肽最有效的比例以及预备条件。水溶液在含有5％Span-80(一种非离子表面活性剂)的环已烷中(比例1∶3，v/v)，在机械振动的条件下被乳化。对苯二酰氯(terephthaloyl chloride)的氯仿溶液被加入到乳化液中，继续搅拌30分钟，在这期间淀粉分子与aprotinin以及肽发生交联。在那个过程中所制备的微粒用环已烷，95％乙醇溶液与2％v/vTween85去污剂，95％乙醇及水依次洗涤。微粒在水中重悬浮并冻干。冻干的化合物可被置于明胶胶囊中，用于需要治疗的个体的口服给药。
一旦被消化吸收后，化合物随着明胶胶囊的溶解被释放。微粒在小肠中通过α淀粉酶对淀粉分子的活性而被分解，导致aprotinin以及本发明的肽的逐步释放。有效的蛋白酶抑制剂aprotinin在与肽相同的时间和位置协同释放，减少了肽的酶降解，并增加了从肠膜吸收获得的完整肽的比例虽然本发明用上述的方法和数据以及YSV的特定的实施例来描述，但可以理解的是，这仅仅是举例而不能作为对本发明的限制。同样可被理解的是YSV代表了本发明的一种实施方式，本发明的相同的原则也可应用于YSV的被修饰但未影响生物学功能的其它功能等同的肽。例如，YSV的等同肽包括那些具有保守的氨基酸取代基(即，Y、S或V中的一个被具有处于同样的生化类型，例如疏水性、亲水性，正电或负电基团的残基的另一个氨基酸所取代)。YSV等同肽的另一个例子是一个更长一些的肽，比如长一个或两个氨基酸，能保持同样的生物学活性。
权利要求
1.一种分离或纯化的肽，所述肽包含酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸。
2.如权利要求1所述的分离或纯化的肽，所述肽由酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽组成。
3.如权利要求2所述的分离或纯化的肽，所述肽由L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-缬氨酸三肽组成。
4.如权利要求2所述的分离或纯化的肽在制备调节免疫活性药物中的应用。
5.如权利要求2所述的分离或纯化的肽在制备刺激T淋巴细胞转化药物中的应用
6.如权利要求2所述的分离或纯化的肽在制备调节细胞增殖紊乱药物中的应用。
7.如权利要求所述6所述的应用，其中所述细胞增殖紊乱是癌症。
8.如权利要求所述7所述的应用，其中所述癌症选自肝癌、白血病、肺癌、黑素瘤或宫颈癌。
9.如权利要求2或3所述的分离或纯化的肽在制备营养增补剂中的应用。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含由酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽组成的三肽。
11.一种制备权利要求10所述的药物组合物的方法，包括将所述三肽与药物学可接受载体混合。
12.一种包含酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽的增效的衍生物，所述增效的衍生物包括连接在酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽上的增效的分子，所述增效的分子限于增强所述三肽在免疫响应的调节作用、T淋巴细胞转化的刺激作用、细胞增殖紊乱的调节作用、癌症生长的调节作用、肝癌生长的调节作用、白血病细胞生长的调节作用、宫颈癌生长的调节作用、肺癌生长的调节作用以及黑素瘤生长的调节作用中的疗效。
13.一种包含酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽的增效的衍生物，所述增效的衍生物包括连接在酪氨酰-丝氨酰-缬氨酸三肽上的增效的分子，所述增效的分子限于增强所述三肽作为营养增补剂的效果。
全文摘要
本发明公开了包含酪氨酰－丝氨酰－缬氨酸的生物活性肽及其用途。同时还公开了制备药物组合物的方法，所述方法包括提供酪氨酰－丝氨酰－缬氨酸三肽并将其与药学上可接受的载体混合。
文档编号C07K5/087GK1982329SQ20061012626
公开日2007年6月20日 申请日期2004年6月22日 优先权日2003年6月26日
发明者王伟明, 林刚 申请人:一泰医药研究(深圳)有限公司