专利名称：血管生成性酪氨酰tRNA合成酶组合物和方法
血管生成性酪氨酰tRNA合成酶组合物和方法相关申请的交叉援引本申请要求2005年12月2日提交的专利系列号为60/741,580的美 国临时申请的利益，该临时申请通过援31并入本文。政府利益申述在此描述的工作的 一部分由国家卫生研究院基金号CA92577资助。 美国政府在本发明中享有一定的权利。发明领域本发明涉及血管生成性酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)组合物。更具体 的说本发明涉及血管生成性TyrRS蛋白变体和其血管生成片段，以及由 此刺激血管生成的方法。发明背景氨基酰基-tRNA合成酶是催化作为蛋白质合成第 一 步的氨基酸加载 到关联tRNA上的必需酶。这些必需酶根据独特序列基序的存在以及催 化结构域的整体结构分为两种类型。I类合成酶在其十个成员的催化结 构域中具有两个高度保守的氨基酸基序，即序列HIGH(SEQ ID NO: l)和 KMSKS(SEQIDNO:2)。相反，II类合成酶具有三个高度简并的序列基 序，称为基序1-3。在过去的二十年中，tRNA合成酶的一些附加功能被 发现，包括RNA剪接、核输出以及调控基因转录。在这些古老的酶的 长期进化中获得了这些附加功能。许多这些附加功能是附加结构域的结 果，这些结构域已经和核心的合成酶序列融合。在高等真核生物中，两 种合成酶的附加结构域已经证明具有与核心酶功能无关的生物学功能。 例如，两种人类tRNA合成酶，即酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)和色氨酰 基-tRNA合成酶(TrpRS),的片段已经证明具有细胞因子样活性。人类 TrpRS的两个相关片段，称为微型-TrpRS ( mmi-TrpRS )和T2-TrpRS, 是血管生成的负调节物。人类TyrRS(SEQ ID NO: 3)可被容易地分成两 个活性片段。C末端附加结构域片段具有类似于促炎细胞因子内皮-单核细胞-活化多肽II(EMAPII)的活性，而N末端片段(微型-TyrRS, SEQ ID NO: 3残基l-364)诱导血管生成。血管生成是严密调节的过程，其中必须维持促血管生成和抗血管生 成的因子之间的缜密平衡。该平衡破坏导致过度或不足的血管生长，与 诸如老年性黄斑变性、类风湿性关节炎、伤口愈合迟緩及许多其它状况 的疾病有关。调控通过各种过程包括转录和翻译控制、翻译后修饰以及 配体加工来得以控制。其它的促血管生长细胞因子，包括肿瘤坏死因子 -a和肝细胞生长因子，是由前体蛋白的蛋白水解切割而产生的。类似的， 蛋白酶切割由人类TrpRS和TyrRS释放出活性细胞因子片段。高等真核生物的TrpRS和TyrRS酶由核心催化区域组成，包括具有 许多a巻曲和散布的卩片层节段的Rossmann折叠。人类TyrRS的 Rossmann折叠催化结构域(SEQ ID NO: 3的残基1至230)包括在 Rossmann折叠区域的a5巻曲和反密码子识别结构域的a14巻曲之间的 氲键连接(tether)(见图3底部和图4顶部)。该连接部分地阻止了在该 蛋白活性位点结构域a5巻曲中的Glu-Leu-Arg (ELR)基序。人类TyrRS和TrpRS的催化结构域均与它们各自相应的细菌和低等 真核生物酶的催化结构域同源，各自附加C末端或N末端延伸。人类 TyrRS的C末端延伸与促炎细胞因子EMAP II有大约51%的序列同一 性。在每种情况中，全长的酶虽有合成酶功能，但无细胞因子活性。当 高等真核生物特有的延伸被移除时，酶变成能够控制血管生成的活性细 胞因子。现已发现，相对于天然人类TyrRS的以下巻曲的间隔，打开 Rossmann折叠结构域的a5巻曲和反密码子(anticodon)识别结构域的a14 巻曲之间的间隔使该蛋白具有血管生成作用。本发明提供TyrRS蛋白变 体和其片段，它们可用于在哺乳动物组织中刺激血管生成。发明概述本发明提供一种生物活性的TyrRS多肽变体，和其血管生成片段 (angiogenic fragments)(在此统称为"TyrRS多肽变体")，它们适用于在 哺乳动物组织中刺激血管生成(angiogenesis)。本发明的分离的酪氨酰 tRNA合成酶(TyrRS)多肽变体包含Rossmann折叠结构域或其部分；反 密码子(anticodon)识别结构域或其部分；以及包括相对于人类TyrRS氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少一个非保守氨基酸残基取代。该变 体显示的血管生成活性大于天然的人类TyrRS的血管生成活性。优选 地，本发明的TyrRS多肽变体具有相对于人类TyrRS的氨基酸残基序列 (SEQ ID NO: 3)的至少50%的氨基酸残基序列同 一性，更优选地至少 80%的序列同一性，最优选地，与SEQIDNO: 3相比至少大约95%的序 列同一性。优选地，该TyrRS多肽变体包括在对应于SEQ ID NO: 3的 位置46、 340、以及341的一个或多个位置上的氨基酸残基的非保守氨 基酸残基取代。在优选实施方案中，本发明的TyrRS多肽变体包含Rossmann折叠 区域或其部分，其包括a5巻曲，以及反密码子识别结构域或其部分， 包括a14巻曲。TyrRS多肽变体具有相对于人类TyrRS的氨基酸残基序 列(SEQIDNO:3，图l)的至少大约50%的氨基酸残基序列同一性。相对 于人类TyrRS的氨基酸残基序列，该变体包括至少一个非保守的氨基酸 残基取代，其打开了(open up)在a5巻曲和a14巻曲之间的分隔 (separation),相对于天然的人类TyrRS的a5巻曲和a 14巻曲之间的分 隔而言。优选地，在该变体的三级结构中该a14巻曲与a5巻曲至少有 大约6埃的间隔，这是由a14巻曲的任一氨基酸残基的a碳和a5巻曲 中的任一氨基酸残基的a碳之间的空间间隔决定的。该变体优选在a5 巻曲和al4巻曲之间没有氢键。在本发明的TyrRS多肽变体的另 一个优选实施方案中，a5巻曲包 括ELR基序，在该变体的三级结构中a14巻曲与a5巻曲的ELR基序至 少有大约6埃的距离，这是由a14巻曲的任一氨基酸残基的a碳和a5 巻曲的ELR基序的Y壬一氨基酸残基的a -l之间的空间间隔(spatml separation)决定的。在该多肽三级结构的外面部分存在暴露的ELR基序。 该TyrRS多肽变体具有与人类TyrRS氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3, 图l)相比至少大约50%的氨基酸残基序列同一性，并包括相对于人类 TyrRS的氨基酸残基序列的至少一个非保守的氨基酸残基取代，消除了 该TyrRS多肽变体中a5巻曲的ELR基序和a14巻曲的氨基酸残基之间 的氢键的形成，或者以其它方式使该变体三级结构中的ELR基序得以暴洛。在另 一个优选实施方案中，该TyrRS多肽变体包括在相当于SEQ ID NO: 3的位置46、 340和341的一个或多个位置上的氨基酸残基的非保守氨基酸残基取代。 一种特别优选的取代是在相当于SEQ ID NO: 3的 341位的酪氨酸上使用具有脂肪族侧链的氨基酸残基，优选非极性脂肪 族侧链，如丙氨酸残基进行的氨基酸替代。本发明的TyrRS变体适用于在哺乳动物(例如，人类)组织中刺激血 管生成。本发明还提供了通过使本发明的TyrRS多肽变体接触组织而在哺 乳动物的组织中刺激血管生成和内皮细月包迁移的方法，如本文所述。附图简述
图1显示了人类TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)。 图2显示了本发明优选的人类TyrRS变体的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 4)。图3(顶部)显示了野生型人类TyrRS序列的示意图，由3个结构域 组成Rossmann折叠催化结构域(黄色，残基1-230)，反密码子识别结 构域(绿色，残基231-364)和C末端结构域(紫色，残基364-528)。头两 个结构域形成具有活性的核心酶，被称作微型TyrRS(mmi TyrRS)(残基 1-364)。底部显示了人类TyrRS的二聚物才莫型，该才莫型基于微型TyrRS 和C-结构域的晶体结构，是由实验确定的。图4(顶部)显示ELR区域与其它的残基相互作用的细节，包括 Y341。底部则显示了来自于多种生物TyrRS的部分序列比对，其中相当 于人类TyrRS三个结构域的残基被比对，即残基39-55(区域1),残基 87-97(区域2)，残基337-346(区域3)。参与结构域接触(contacts)的保守 残基被突出显示。第1行包括人类TyrRS的氨基酸残基，其中区域1对应 SEQ ID NO: 5,区域2对应SEQ ID NO: 6,区域3对应SEQ ID NO: 7。第 2行显示了鼠TyrRS的比对，其中如人类TyrRS —样，区域1对应SEQ ID NO: 5,区域2对应SEQIDNO: 6,区域3对应SEQ ID ID NO: 7。第 3行显示牛TyrRS的比对，其中区域1对应SEQ ID NO: 5,区域2对应 SEQ ID NO: 8,区域3对应SEQ ID NO: 9。第4行显示果蝇(Dmyo/7/n7a we/朋og仏"e。TyrRS的比对，其中区域1对应SEQ ID NO: 5,区域2对 应SEQIDNO: 10，区域3对应SEQIDNO: 11。第5行显示了秀丽线虫 (C廳o,/m論m e/eg—的TyrRS的比对，其中区域1对应SEQ ID NO: 12，区域2对应SEQ ID NO: 13,区域3对应SEQ ID ID NO: 14。第64亍显示了酿酒酵母(5"acc/z"ra附j/c^ ce^ ww"^的TyrRS的比7于，其中区 域1对应SEQ ID NO: i5,区域2对应SEQ ID NO: 16,区域3对应SEQ ID ID NO: 17。第7行显示了裂殖酵母(^acc/zaTO/^c^ / ow6ej TyrRS的 比对，其中区域1对应SEQIDNO: 18,区域2对应SEQ ID NO: 19,区 域3对应SEQ ID ID NO: 20。第8行显示大肠杆菌(&c/zehc/na co//) TyrRS的比对，其中区域1对应SEQ ID NO: 21 ，区域2对应SEQ ID NO: 22,区域3对应SEQ ID NO: 23 。第9行显示枯草芽孢杆菌fB""〃w w&z7^ TyrRS的比对，其中区域1对应SEQ ID NO: 24,区域2对应SEQ ID NO: 25,区域3对应SEQIDNO:26。图5显示了对人类TyrRS和TyrRS-Y341A的X射线散射分布。对 人类TyrRS和TyrRS的Y341A突变，采用它们测量出的小角度X射线 散射(SAXS)曲线来计算电子对距离分布函数。对两个分子，旋转半径 (Radius of Gyration)(Rg)和最大距离(D咖x)被计算出。Y341A具有的Rg 比野生型TyrRS的要大大约4埃，Dm^比野生型TyrRS的要大大约20 埃(angstrom)。图6图解说明Y341A突变在整个人类TyrRS三级结构上的开口效 果(openmg effect),它暴露了ELR基序。通过SAXS分析和蛋白酶消化 研究确证了 Y341A突变，以开放TyrRS结构，如图所示。图7说明了 TyrRS-Y341A在小鼠基质胶(Matrigel)血管生成模型中 的活性。小鼠接受400(iL生长因子减少的基质胶的单独皮下注射，或与 250nM TyrRS蛋白混合注射。人类VEGF^(20nM)作为阳性对照。五天 培养之后，小鼠被静脉内注射荧光素标记的内皮结合凝集素 (fluorescein-labeled endothelial binding lectin) G",m力(Bandeiraea) 5"w^"c'〖/b/w I、同工凝集素(isolectin)B4。栓(plugs)一皮切下、溶解并通过 光谱测定法评定荧光素含量。打开的TyrRS-Y341A变体被观察到具有相 对于野生型TyrRS的增加的血管生成活性。图8显示了人类TyrRS和TyrRS-Y341A在鸡尿嚢绒膜试-验(chick chorioallantoic membrane assay)中的活性。使用鸡尿嚢绒月莫试-验测定 TyrRS蛋白在体内的血管生成活性。TyrRS变体(l(iM)、由VEGF和bFGF 的组合组成的阳性对照以及由单独的緩沖液组成的阴性对照^皮用于尼 龙网lt嵌的月交原氺反(nylon mesh-imbedded collagen onplant)中的CAM。图9显示了使用本发明TyrRS变体和对照处理的受损内皮细胞培养物中剩余无细月包区域(remaining cells-free area)相对于初始损伤区域 (area of the initial wound)的百分比面积(area)(纵轴)图。优选实施方案的详细描述蛋白质中的氨基酸残基已经按不同的方法进行了分类，主要基于氨 基酸侧链所赋予的物理化学特征。例如， 一种通常的分类包括三类氨基 酸(l)疏水(非极性)氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、 脯氨酸、曱硫氨酸、异亮氨酸基和亮氨基酸；(2)带电氨基酸，包括天冬 氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸；以及(3)极性氨基酸，包括丝氨酸、苏 氨酸、酪氨酸、组氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸；甘 氨酸有时被包括入第四类，只有它自己(见Chapter 1 of Branden and Tooze, to /Voto'w 5V^w"w/^, Second Edition, GarlandPublishing, Inc. 1998, pages 3-12，其通过援引并入本文)。氨基酸残基还可以根据它们的侧链是脂肪族还是芳香族、小或大、 极性的或非极性的、带电或不带电、其组合等等进一步地分类。如在此 使用的，非极性脂肪族氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨基酸、 异亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸；不带电的大的(bulky)氨基酸包括酪氨酸、 色氨酸、苯丙氨酸、亮氨基酸、异亮氨酸基和曱硫氨酸；小的(small)非 极性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸。如在此和附加的权利要求中使用的术语"非保守的"，当用于氨基 酸残基取代时，表示在野生型或天然蛋白中的氨基酸残基被明显不同的 结构类别的氨基酸残基取代，例如具有明显不同的极性分类(即非极性对 极性)、大小分类、带电性分类、其组合等等。例如，对于非保守性替 换，极性氨基酸比如酪氨酸可被非极性氨基酸、相对小的非极性氨基酸 等等取代；而小的非极性氨基酸比如甘氨酸或丙氨酸可被大的氨基酸、 带电氨基酸等等取代。体现本发明的优选的分离的TyrRS多肽变体适用于在哺乳动物组 织中刺激血管生成，其包含Rossmann折叠区域或其部分(a portion thereof),它包括a5巻曲以及包括a14巻曲的反密码子识别结构域或其 部分。该变体在a5巻曲和a14巻曲之间具有间隔，该间隔大于在天然 的人类TyrRS中的a5巻曲和a14巻曲之间的间隔。优选地，在该变体 的三级结构中，al4巻曲与a5巻曲至少间隔大约6埃，这是通过a14巻曲的任一氨基酸残基的a碳和a5巻曲的任一氨基酸残基的a碳之间的 空间间隔决定的。该变体优选在(x5巻曲和a14巻曲之间无氩4建存在。 该TyrRS多肽变体具有相对于天然人类TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3,图l)的至少大约50%的氨基酸残基序列同一性，更优选的至 少大约80% ,最优选的至少大约95%的序列同一性。相对于人类TyrRS 的氨基酸残基序列，该变体包括至少一个非保守的氨基酸残基取代，相 对于天然的人类TyrRS的a5巻曲和a14巻曲的间隔，它打开了 a5巻曲 和a14巻曲之间的间隔，并赋予该变体血管生成活性。在另 一个优选实施方案中，本发明的TyrRS变体包含Rossmann折 叠区域或其部分，其在多肽三级结构外面部分(external portion)提供暴露 的ELR基序，并且该变体具有相对于人类TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少大约50%的氨基酸残基序列同一性，优选的至少大约 80% ,最优选的大约95%的序列同一性。该TyrRS多肽变体相对于人 类TyrRS的氨基酸残基序列包括至少一个非保守氨基酸残基取代，其暴 露了催化性Rossmann折叠结构域的a5巻曲的ELR基序，从而赋予该 多肽血管生成活性。本发明的变体中，变体三级结构中a5巻曲的ELR 残基与al4巻曲的每个残基优选地至少距离大约6埃，这由al4巻曲的 任一氨基酸残基a碳和a5巻曲ELR基序的任一氨基酸残基a碳之间的 空间间隔决定。优选地，所述至少一个非保守氨基酸残基取代是在相当于SEQ ID NO: 3的氨基酸残基46、 340和341的一个或多个位置上的氨基酸残基 的取代。例如，SEQIDNO: 3中341位的酪氨酸优选被具有非极性侧链 的氨基酸残基(例如，非极性的脂肪族氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬 氨酸、亮氨基酸、异亮氨酸、曱硫氨酸和脯氨酸)取代。相当于SEQ ID NO: 3的46位甘氨酸和/或340位丙氨酸的氨基酸残基优选地:故具有大的 (bulky)非极性侧链的氨基酸残基(例如，较大的不带电的疏水性氨基酸， 例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨基酸、异亮氨酸基或曱硫氨酸) 取代。如在此使用的，提到TyrRS多肽变体中"相当于，，(corresponding to)给定序列比如SEQ ID NO: 3中的氨基酸残基的氨基酸，表示在TyrRS 多肽变体的同源序列中某个位置的氨基酸，当该同源序列与该给定序列 相比较时，与SEQ ID NO: 3中的给定位置对准(即对应)。蛋白质领域 普通技术人员可以理解，同源序列中氨基酸残基的编号可能与给定序列的编号不同(例如,SEQ ID NO:3)。在另一实施方案中，本发明的分离的TyrRS多肽变体包含Rossmann 折叠区域或其部分，其在该蛋白或片段的外面部分提供暴露的ELR基 序，并且它具有相对于人类TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的 至少大约50%的氨基酸残基序列同一性。优选地，该变体的氨基酸残基 序列具有相对于SEQ ID NO: 3的至少大约80%的序列同一性，更优选 地大约95%,并且包括在相当于SEQ ID NO: 3的341位的位置上的具 有非极性侧链的氨基酸残基。优选地，该氨基酸残基具有非极性的脂肪 族侧链。例如，该变体相当于人类TyrRS的第341位酪氨酸残基的氨基 酸残基可以是甘氨酸残基、丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、缬氨酸残基、 亮氨基酸残基、异亮氨酸残基、曱硫氨酸残基或脯氨酸残基。在某些实 施方案中，相当于人类TyrRS的341位酪氨酸的氨基酸残基是甘氨酸残 基、丙氨酸残基或脯氨酸残基，优选丙氨酸残基。在另 一个优选实施方案中，分离的TyrRS多肽变体包含SEQ ID NO: 4(图2)的氨基酸残基序列或其片段，其中SEQ ID NO: 4的341位的残基 X是甘氨酸残基、丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨基酸 残基、异亮氨酸残基、曱硫氨酸残基或脯氨酸残基，优选甘氨酸、丙氨 酸或脯氨酸残基，更优选丙氨酸残基。优选地，该TyrRS多肽变体包含 SEQ ID NO: 4的整个N末段区域(即残基1-364)。优选地，片段至少包 括Rossmann折叠区域a5链的残基，即相当于SEQ ID NO: 4的87至104 位的残基。更优选地，该片段包括整个Rossmann折叠区域(SEQ ID NO: 4的1-230残基)。本发明的特别优选的血管生成TyrRS多肽变体由SEQ ID NO: 4的 氨基酸残基序列组成，其中SEQ ID NO: 4的位置341上的残基X乂人由 甘氨酸残基、丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨基酸残基、 异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基和脯氨酸残基构成的组中选择。更优选地， SEQ ID NO: 4的341位的残基X从由甘氨酸残基、丙氨酸残基、脯氨酸 残基构成的组中选出，最优选丙氨酸残基。本发明也提供 一 种在哺乳动物的组织中刺激血管生成的方法。该方 法包括让组织接触血管生成量(angiogenic amount)的在此详细描写的 本发明的TyrRS多肽变体。另 一 方面，本发明提供 一 种在哺乳动物的组织中刺激内皮细胞迁移的方法。该方法包括让组织接触内皮细胞迁移刺激量(endothelial cells migration stimulating amount)的在此详细描写的本发明的TyrRS多月太变体。TyrRS-Y341A和微型-TyrRS-Y341A质粒是通过使用 QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)构建的。模板分别 是包含野生型TyrRS和微型-TyrRS的pET 20b(+)(Novagen, Masdison, WI)载体。所有的蛋白质连同C末端His标签表达以利于多肽的分离。 合成寡核苷酸从Invitrogen公司(Carlsbad, CA)购买。蛋冷者W i Z和力^ # ^去,.重组多肽用大肠杆菌 B121-CodonPlus (DE 3)-RIL细l包(Stratagene， La Jolla, CA)表达。当细胞 生长至OD6QQ为0.8时，使用ImM异丙基P-D-硫代半乳糖吡喃糖苦 (Roche, Basel, Switzerland)诱导3小时。然后细胞被沉淀出来并在緩冲 液A(20mM Tris-HCl, pH 7.9, 30mM咪唑，500mM NaCl)中重悬。超声裂 解后，通过74,000g离心30分钟分离细胞石,片。有His标签的多肽通过 Ni-NTA亲和色语纯化。上清液加样至Ni-NTA亲和柱(Qiagen， Valencia, CA)上，用lOOml緩冲液B(緩冲液A加上0.1% Triton-Xl 14(Sigma, St. Loms， MO))和150mL緩冲液A洗涤。多肽通过緩冲液A和緩冲液 C(20mM Tris-HCl, pH 7.9, 250mM咪唑，500mM NaCl)的线性梯度洗脱。 含有〉95%纯度多肽的级份被收集、浓缩并透析至储存缓沖液(50%磷酸 盐緩冲盐水，PBS, pH 7.4, 50%甘油，2mM 二石克苏糖醇，DTT )。蛋白浓度 通过使用Bio-Rad Protem Assay试剂(Bio-Rad， Hercules, CA)以牛血清清 蛋白(BSA, Sigma， St. Louis, MO)作为标准进行Bradford试验来确定。内 毒素浓度通过使用Limulus Amebocyte Lysate (LAL)试-验(BioWhittaker, Walkersville, MD )确定。V、^^ Z身錄炎身在斯坦福同步辐射实验室(SSRL)对野生型 TyrRS和本发明的TyrRS-Y341A变体于beamlme 4-2实施小角度X射线 散射(SAXS)测定。对不同浓度(2-20g/L)的样品测量X射线散射曲线。X 射线波长(X)为1.38A,检测器通道数被转变为动量传递Q=47T*sme/X,其 中2 *e是散射角。两个不同的样本-检测器距离用于覆盖极小至中等的散 射角，即2.5米覆盖大约0.01-0.25 A-]的Q范围，而0.5米覆盖大约0.03-0.93 A"的Q范围。用等分样本装满带有云母窗的聚碳酸酯池(polycarbonate cell)并在 测量过程中保持20°C 。在整个数据采集过程中使用MarCCD165检测器。 一套典型的数据采集由每个10秒钟依次记录的24个二维散射影像组 成。 一系列数据与匹配的緩沖散射数据一起处理，该緩冲散射数据典型 地在蛋白溶液测量之后或之前立即记录。数据针对整合的光束强度标定 (scaled for integrated beam intensity)、按方位平均(azimuthally averaged)、 观察时间-依赖性变化，其通常由辐射损伤所引起，并进行统计学分析。 平均水平上，大约为匹配緩冲数据的波动(variation)的大约1.5倍高的统 计波动是允许的。相对于超过该水平的第一个蛋白散射数据帧(data frame),任何显示更高水平偏差的数据帧都被淘汰。在上述数据处理之 后，处理的緩沖散射曲线(buffer scattering curves)从相应的蛋白散射曲线 中扣除。小角度和高角度数据的标定通过PRIMUS软件程序(Konarev W 2003. "PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis" , /. J/ / /. Cr，to〃ogr 36:1277-1282)进4亍，该软件程序也应 用于通过Q*Rg 0.45-1.3的范围内进行Guimer绘图来计算Rg和I(Q=0)。 通过使用Svergun等的GNOM小角度散射数据处理程序(可以从 embl-hamburg (dot)de网站获得)进行实验数据的间接Fourier变换获得 电子对距离分布函数TYrj,最初仅用小角度数据来获得最大距离(LUx) 的准确估算。然后再次计算/Yr,包括具有以上给定D皿值的高角度数 据用于模型构造。蛋^渗游7A. 将野生型TyrRS和TyrRS-Y341A与血浆素或白细胞 弹性蛋白酶按蛋白对蛋白酶大约32昭比1(ig血浆素和2S00(ig每单位弹 性蛋白酶的比率混合。混合物在20。C孵育大约2小时，然后加入甲酸至 0.1%的终浓度以终止反应。混合物中的切割片段通过MALDI TOF质谱 和使用Edman降解法的N末端测序进4亍分析。C4M if^成试-發.鸡尿嚢绒膜(CAM)血管生成试验通过以下步 骤进行。将受精的补体固定禽白血病病毒(COFAL)-阴性卵(Charles River 实验室，Storrs， CT)在38。C/60。/o湿度下孵育3.5天。然后卵被打开，胚 胎被转移至无菌的塑料称量盒中。胚胎被覆盖并在37.5。C/90。/。湿度下孵 育。五天之后，将含有大约30pL的PBS, VEGF和bFGF(各自大约0.15和0.5pg)或TyrRS多肽(lpM)的月交原/网板(collagen/mesh onplant)i丈至 胚胎的CAM膜上，再孵育66小时。植入物的上网层(upper mesh layers) 在立体显微镜下检查并对"方框"(即，被网纤维限定的三维区域)的比 例评分，其含有相对于方框总数的血管。^i^^辰i^i成试绘。在Athymic wehi小鼠皮下才直入400pL的生 长因子耗尽的基质胶(Matrigel)(Becton Dickinson),基质胶中补充有 PBS、 20nMVEGF或250nMTyrRS、微型-TyrRS、 TyrRS-Y341A或微型 -TyrRS-Y341A。五天后，将小鼠静脉内注射入荧光素标记的内皮结合凝 集素 0#簡'<2 (Bandeiraea) Wmp/hyb/z" I , 同工凝集素 B4 (GSL-B4)(Vector实验室，Burlmgame， CA)。切下基质月交栓并在it射免 疫-沉淀(RIPA)緩冲液(10mM磷酸钠，pH 7.4, 150mM氯化钠，1% Nomdet P-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠)中匀浆。匀浆之 后，使用分光光度分析定量每个栓(plug)的荧光素含量。移试-發。人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)(Cambrex)在含 有10。/。胎牛血清(FBS)的EGM培养基(Cambrex)中按大约3乂105每孔的 密度接种于6孔培养板，并生长至汇合单层。将细胞在不含有FBS的培 养基中饥饿16小时并用移液管尖头沿着孔损伤细胞。损伤层用无血清 培养基洗涤两次以除去细胞碎片，并让细胞在存在和缺少TyrRS变体和 对照因子(control factors)的条件下迁移。在损伤后0和6小时，无细胞 创伤区域被照像，并用图像分析软件(NIH ImageJ 1.33)分析。按剩余无 细胞区与初始的创伤区的百分比计算内皮细胞迁移率，从中确定每种条 件下的闭合区域百分比。我差^承必斧^。通过ATP-焦磷酸酯(PPi)交换反应测定氨基酸活 化作用。反应在37。C于含有Tris-HCl (100mM, pH 7.8)、 KF (10mM)、 MgCl2(2mM)、 ATP(lmM)、 BSA (O.lmg /mL) 、 NaPPi(2mM, 130cpm /nmole)、 p-巯基乙醇(5mM)、酪氨酸(2mM)和200nM的该多肽的緩冲液 中进行。7>ri^ ^戏^ K^/犮7「Mcwre」厲资￡XW j# #潜种。人们知道 微型-TyrRS(即人类TyrRS的1-364氨基酸残基)而不是全长TyrRS可作 为促血管生成细胞因子起作用。促血管生成活性依赖于ELR基序的存在，而ELR基序也存在于CXC趋化因子比如IL-8中，并为其活性所必 需。在图3顶端展示了 TyrRS的氨基酸序列简图，它由3个结构域组成: Rossmann折叠催化结构域(黄色，残基1-230)，反密码子识别结构域(绿 色，残基231-364)以及C末端结构域(紫色，残基364_528)。前两个结构 域形成了活性的核心酶，被称作微型TyrRS(残基1-364)。最近解析的微 型-TyrRS的三级结构显示出围绕ELR基序的氢键网络，该网络连接了 该蛋白的反密码子识别以及活性部位结构域(参见图3，底部)。在ELR 基序的R93的侧链和反密码子识别结构域的主链A340之间有两个氲键 相互作用，其将a5巻曲连接(tether)至al4巻曲。另夕卜，Y341的芳环和 主链G46之间的叠加相互作用(stacking interactions),创建了这些的结构 域之间的接触。这四个残基中，R93、 G46和Y341在迄今鉴定的所有真 核生物TyrRS蛋白中是保守的。如图3(底部)所示，每个片段表面静电 势的互补性提供了在a5巻曲和otl4巻曲之间的连接的证据。ELR基序(在 螺旋a5上)被C-结构域所屏蔽，当C-结构域被移除后暴露出来。因为这 个原因，对于血管生成，微型TyrRS是有活性的，而全长TyrRS无活性。 Tyr341残基(来自反密码子识别结构域螺旋a14 )与ELR互相作用，并 在连接C-结构域来阻挡ELR中发挥重要作用。A340也是高度保守的， 在&cereww"e中只由另一种小氨基酸，甘氨酸，所取代。两种独立的方法用来展示Y341A突变对TyrRS产生的三维结构打 开。第一种方法是小角度X射线散射(SAXS)。当电磁辐射的波长与样本 微粒在相同长度尺度上时，该微粒将对辐射产生散射。探测并分析该散 射图样可以得到关于微粒大小、形状以及内部结构的有价值的信息。 SAXS技术是一种探测在溶液中的大分子(如蛋白质)的整体构象变化的 有力技术。从测量的野生型人类TyrRS和Y341A突变的散射曲线，计 算出各样本的电子对距离分布函数(图5)。随后从该分布函数/Yd中导出 旋转半径ORg)和最大距离(Z^。》的值。图4显示了 R93和Y341之间的氬键连接。该氢4建连4妻的破坏打开 三级结构并暴露ELR基序。在野生型人类TyrRS和Y341 ;故丙氨酸取代 的变体(TyrRS-Y341A)的小角度X射线散射研究提供这种开口的直接证 据(参见图5)。X射线散射研究显示相对于野生型蛋白该变体的电子对距 离分布变宽。TyrRS Y341A具有的Ag比野生型TyrRS的大大约4埃， D腦x比野生型TyrRS的大大约20埃。这证明了 TyrRS Y341A具有相对于野生型TyrRS更开放和更伸展的构象。支持相对于野生型人类TyrRS而言TyrRS-Y341A中有开放结构的 其他证据是从使用血浆素(plasmm)和弹性蛋白酶的酶切消化研究中获得 的。蛋白酶通常在柔性的环区切割蛋白质，这里没有确定的二级结构如 a螺旋或卩链。与Y341A突变相关的暴露ELR基序的结构上的开口的 存在被额外的切割片段证实，观察到的这些额外的切割片段是由于在更 松弛、开放的结构上存在额外切割位点所造成的。^使用血浆素和白细胞 弹性蛋白酶，在Y341A突变体上》见察到相对于野生型TyrRS的额外的 切割位点。7见察到的这些额外切割位点是L333、 K334和A337,它们全 部位于反密码子识别结构域的螺旋a14,接近于突变位点341。这证实 了在Y341A突变中，a14是松弛的并本身呈柔性环状，不再被连接于 ELR区域。图6图解了 Y341A突变对人类TyrRS整体三级结构的开口 效果。F34L4《赏/4'f全# 7>W^ A资iA^Vi。 Y341是一个理想的突变三级结构稳定性。在全长TyrRS和微型-TyrRS中将该残基突变为丙氨酸 来确定所述连接的破坏改变细胞因子和酶活性的程度。细胞因子活性在 鸡尿嚢绒膜(CAM)中测定，基质胶试验用于血管生成测定。微型-TyrRS中包括入Y341A突变在CAM试验中未对它的活性产生 可观察到的影响-正常多肽和变体都促进了血管生成。全长野生型人类 TyrRS在该试验中无活性。但是人类TyrRS的Y341突变为丙氨酸(即 TyrRS-Y341 A)则将该酶转变成为促血管生成的细胞因子。为了证实在 CAM试验中观察到的结果，又将该多肽在小鼠基质胶栓模型中进行测 定。在这个试验中，含有PBS或其它蛋白的胶原栓^皮皮下注射。当在栓 内有促血管生成因子时，血管会散布进入栓中。在注射荧光内皮细胞结 合凝集素后，每个栓中的血管密度可以通过分光光度分析定量。在这个 模型中，VEGF和微型-TyrRS都呈现血管生成活性阳性。野生型TyrRS 则无活性，与PBS的血管生成水平相似。相反，TyrRS-Y341A则诱导 血管生成。这些数据独立地证实了 CAM试验的结果。管新生显著增加，而野生型多肽或PBS均没有诱导应答(多肽在7^龙网-镶嵌的胶原植入物中按lpM的浓度施用)。图7进一步表征了在小鼠基质胶栓试验中该TyrRS多肽的体内活 性。小鼠按400pL量皮下注射单独的生长因子减少的基质胶或与250nM 蛋白混合。5天培养后，移除栓并评定血管的存在。VEGF^(20nM)用作 阳性对照。按先前的报道，微型-TyrRS在这个试验中促进血管生成。在 微型-TyrRS中Y341突变为丙氨酸(即，微型-TyrRS-Y341A)不影响该应 答。但是当在全长TyrRS中制造Y341A突变时，则相对于野生型TyrRS 有2倍的血管生成应答提升。K 4L4焚茺炎7>*/ 话必潜^^^處力豸关。通过测定酪氨酸依赖 的ATP-PPi交换反应来评定氨基酸的活化作用。如图8所示，Y341A点 突变敲除了全长TyrRS以及微型-TyrRS形成酪氨酰腺苷酸的能力。因此 参与tRNA氨基酰化的结构元件与那些参与细胞因子功能的不同。内皮细胞迁移试验用来评价本发明的TyrRS变体刺激与伤口愈合 有关的内皮细胞迁移的能力。人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)接种于含 有10%FBS的EGM培养基中并生长至汇合单层。将细胞在不含有FBS 的培养基中饥饿处理，然后用移液管尖头沿孔划伤细胞。损伤层用无血 清培养基洗涤以除去细胞碎片，允许细胞在存在和不存在TyrRS变体以 及对照因子的条件下迁移。无细胞创伤区域的影像在损伤后0和6小时 拍摄，并使用图像分析软件(NIHImageJ, 1.33版)进行分析。按剩余的 无细月包区i或(remaining cell-free area)才目^f 一刀始的创伤区^戈(area of the initial wound)的百分比计算内皮细胞迁移，从中确定在各种条件下闭合 区域(areaclosed)的百分比。图9显示在用本发明的TyrRS变体和对照处 理的损伤细胞培养物中，剩余无细胞区域与初始创伤区域的百分比图(纵轴)。无细胞区域相对更小的百分比显示内皮细胞迁移和伤口愈合的提 高。如图9所示，本发明的TyrRS变体刺激内皮细胞迁移的程度与微型 TyrRS的程度相当，而比野生型TyrRS的程度更大。在不脱离本发明新颖特征的精神和范围的情况下，可以对上述实施 方案进行许多变化和修改。对于在此阐述的特定实施方案并无意图进行 限制，也不应当推断为进行限制。
权利要求
1.一种分离的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽变体，它包括(a)Rossmann折叠区域或其部分；以及(b)反密码子识别结构域或其部分；其中该变体包括相对于人类TyrRS氨基酸残基序列(SEQ ID NO3)的至少一个非保守的氨基酸残基取代，并且显示大于天然人类TyrRS血管生成活性的血管生成活性。
2. 权利要求1的TyrRS多肽变体，其中该变体具有相对于人类 TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少50%的氨基酸残基序列 同一性。
3. 权利要求1的TyrRS多肽变体，其中该变体具有相对于人类 TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少80%的氨基酸残基序列 同一性。
4. 权利要求1的TyrRS多肽变体，其中该变体具有相对于人类 TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少95%的氨基酸残基序列 同一性。
5. 权利要求1的TyrRS多肽变体，包括在相当于SEQ ID NO: 3的 位置46、 340和341的一个或多个位置上的氨基酸残基的非保守氨基酸 残基取代。
6. 权利要求1的TyrRS多肽变体，包括在相当于SEQ ID NO: 3的 残基341的位置上的非极性氨基酸残基。
7. —种分离的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽变体，包括(a) 包括a5巻曲的Rossmann折叠区域或其部分；和(b) 包括al4巻曲的反密码子识别结构域或其部分； 其中该变体具有相对于人类TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO:3)的至少50%的氨基酸残基序列同一性，包括相对于人类TyrRS氨基酸 残基序列的至少 一 个非保守的氨基酸残基取代，并在该变体三级结构中 的a5巻曲和cd4巻曲之间具有间隔，该间隔大于天然人类TyrRS的a5 巻曲和a14巻曲间的间隔。
8. 权利要求7的TyrRS多肽变体，其中该变体具有相对于人类 TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少80%的氨基酸残基序列 同一性。
9. 权利要求7的TyrRS多肽变体，其中该变体具有相对于人类 TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少95%的氨基酸残基序列 同一性。
10. 权利要求7的TyrRS多肽变体，包括在相当于SEQ ID NO: 3的 位置46、 340和341的一个或多个位置上的氨基酸残基的非保守氨基酸 残基取代。
11. 权利要求7的TyrRS多肽变体，包括在相当于SEQ ID NO: 3的 残基341的位置上的非极性氨基酸残基。
12. 权利要求7的TyrRS多肽变体，包括在相当于SEQ ID NO: 3的 位置46的位置上的具有大的非极性侧链的氨基酸残基。
13. 权利要求7的TyrRS多肽变体，包括在相当于SEQ ID NO: 3的 位置340的位置上的具有大的非极性侧链的氨基酸残基。
14. 一种分离的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽变体，包括(a) Rossmann折叠区域或其部分，其中包括含有ELR基序的a5巻 曲^ 和(b) 包括a14巻曲的反密码子识别结构域或其部分，其中在该变体 的三级结构中，tx5巻曲的ELR基序与a14巻曲至少间隔大约6埃，这 是由a14巻曲的任一氨基酸残基的a碳和a5巻曲ELR基序的任一氨基 酸残基的a石友之间的空间间隔确定的；其中该变体具有的氨基酸残基序列与人类TyrRS的氨基酸残基序 列(SEQ ID NO: 3)相比至少有50%的相同，包括代替相当于SEQ ID NO: 3的341位的酪氨酸的非极性氨基酸残基，和存在位于该多肽三级结构 外面部分的暴露的ELR基序。
15. 权利要求14的TyrRS多肽变体，其中所述非极性氨基酸残基 具有脂肪族侧链。
16. 权利要求14的TyrRS多肽变体，其中所述非极性氨基酸残基 选自由甘氨酸残基、丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨基 酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基和脯氨酸残基构成的组。
17. 权利要求14的TyrRS多肽变体，其中所述非极性氨基酸残基 选自由甘氨酸残基、丙氨酸残基和脯氨酸残基构成的组。
18. 权利要求14的TyrRS多肽变体，其中所述非极性氨基酸残基 是丙氨酸残基。
19. 权利要求14的TyrRS多肽变体，其中该变体具有相对于人类 TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少80%的氨基酸残基序列 同一性。
20. 权利要求14的TyrRS多肽变体，其中该变体具有相对于人类 TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO: 3)的至少95%的氨基酸残基序列 同一性。
21. —种分离的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽变体，包括SEQ ID NO: 4的氨基酸残基序列或它的包括至少SEQ ID NO: 4的残基1至364 的片段，其中SEQ ID NO: 4的位置341上的残基X选自甘氨酸残基、 丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨基酸残基、异亮氨酸残基、曱硫氨酸残 基和脯氨酸残基构成的组。
22. 权利要求21的TyrRS多肽变体，其中SEQ ID NO: 4的位置341 上的残基X是选自由甘氨酸残基、丙氨酸残基和脯氨酸残基构成的组的 氨基酸残基。
23. 权利要求21的TyrRS多肽变体，其中SEQ ID NO: 4的位置341 上的残基X是丙氨酸残基。
24. —种纯化的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽变体，由SEQ ID NO: 4的氨基酸残基序列组成，其中SEQIDNO: 4的位置341上的残基 X选自甘氨酸残基、丙氨酸残基、苯丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨基 酸残基、异亮氨酸残基、曱硫氨酸残基和脯氨酸残基构成的组。
25. 权利要求24的TyrRS多肽变体，其中SEQ ID NO: 4的位置341 上的残基X选自由甘氨酸残基、丙氨酸残基和脯氨酸残基构成的组。
26. 权利要求24的TyrRS多肽变体，其中SEQ ID NO: 4的位置341 上的残基X是丙氨酸残基。
27. —种在哺乳动物的组织中刺激血管生成的方法，包4舌以血管生 成量的权利要求1的TyrRS多肽变体接触该组织。
28. —种在哺乳动物的组织中刺激血管生成的方法，包括以血管生 成量的权利要求7的TyrRS多肽变体接触该组织。
29. —种在哺乳动物的组织中刺激血管生成的方法，包括以血管生 成量的权利要求14的TyrRS多肽变体接触该组织。
30. —种在哺乳动物的组织中刺激血管生成的方法，包括以血管生 成量的权利要求21的TyrRS多肽变体接触该组织。
31. —种在哺乳动物的组织中刺激血管生成的方法，包括以血管生成量的权利要求24的TyrRS多肽变体接触该组织。
32. —种在哺乳动物的组织中促进内皮细胞迁移的方法，包括以内 皮细胞迁移刺激量的权利要求1的TyrRS多肽变体接触该组织。
33. —种在哺乳动物的组织中促进内皮细胞迁移的方法，包括以内 皮细胞迁移刺激量的权利要求7的TyrRS多肽变体接触该组织。
34. —种在哺乳动物的组织中促进内皮细月包迁移的方法，包>^以内 皮细l包迁移刺激量的—又利要求14的TyrRS多肽变体4妻触该组织。
35. —种在哺乳动物的组织中促进内皮细l包迁移的方法，包括以内 皮细胞迁移刺激量的权利要求21的TyrRS多肽变体接触该组织。
36. —种在哺乳动物的组织中促进内皮细月包迁移的方法，包括以内 皮细l包迁移刺激量的;k利要求24的TyrRS多肽变体接触该组织。
全文摘要
本发明提供了一种分离的酪氨酰tRNA合成酶(TyrRS)多肽变体，该变体包括(a)Rossmann折叠区域或其部分，优选地包括α5卷曲；和(b)反密码子识别结构域或其部分，优选地包括α14卷曲。优选地，相对于天然人类TyrRS中的相应空间间隔，在该变体的三级结构中α5卷曲和α14卷曲具有更大的空间间隔。该变体优选具有相对于人类TyrRS的氨基酸残基序列(SEQ ID NO3)的至少大约50％的氨基酸残基序列同一性，相对于人类TyrRS氨基酸残基序列包括至少一个非保守的氨基酸残基取代，并且优选地在该多肽三级结构外面部分的α5卷曲中提供暴露的ELR基序。优选的TyrRS蛋白变体包含SEQ ID NO4的氨基酸残基序列或其部分。本发明的蛋白质和蛋白片段有血管生成活性，可用于在哺乳动物组织中刺激血管生成。
文档编号C12Q1/68GK101336299SQ200680052307
公开日2008年12月31日 申请日期2006年12月1日 优先权日2005年12月2日
发明者X·-L·杨 申请人:斯克里普斯研究学院