专利名称：：富含甘草素的提取物或自其衍生的甘草素用于增加胆汁流、利胆作用以及用于预防和治...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及富含甘草素的甘草提取物和自其衍生的甘草素作为用于增加胆汁流、利胆作用以及用于预防和治疗胆汁淤积性肝病的有效成分的用途；通过使用其而增加胆汁流、利胆作用的方法；以及包含其的组合物。
背景技术：
：胆汁含有胆汁酸、磷脂、胆红素、谷胱甘肽(GSH)和电解质，并在涉及脂质的消化和吸收的各种生理功能中起到重要作用，所述生理功能例如增加肠道处正常脂质的吸收、保持人类胆固醇代谢平衡以及充当各种毒性化学物质(如药物、如胆红素的内生碎片和脂质代谢物)的排泄途径(BallatoriN.等人，Am.J.Physiol.，263，ppG617-G624，1992)。两种物质，即半乳糖胺(GalN)和脂多糖(LPS)在实验中广泛用作胆汁淤积性肝病的代表性诱导剂。半乳糖胺消耗肝脏组织中的UTP(尿苷三磷酸)和UDP(尿苷二磷酸)-葡萄糖醛酸而抑制肝脏内的蛋白质产生；消耗GSH(—种保肝物质)；并抑制在废物排泄中涉及的葡萄糖苷酸化而引起肝毒性，从而导致伴随的异常形态，如实质组织的细胞坏死和炎细胞浸润等(JonkerAM等人，Hepatology,11，pp622_627，1990)。LPS快速增加包含LPS的内毒素流入门静脉；增加由炎症肝细胞的活化引起的TNF-α(肿瘤坏死因子-α)，从而导致突发性肝炎；抑制肝转移蛋白的表达而引发胆汁排泄的紊乱；并增加胆汁淤积性肝病的血液指标(例如ALP(碱性磷酸酶)、Y-GTP(γ-谷氨酰转肽酶)等)的表达(GrimM等人，ActaHepatogastroentero1.(Stuttg)24，pp64_81，1977)。数种转运蛋白，如细胞膜转运蛋白，即在胆汁流入肝细胞中涉及的存在于细胞膜中的NTCP(Na+-依赖性牛磺胆酸共转运多肽)和0ATP-1(有机阴离子转运多肽-1)；肝细胞膜转运蛋白，如在胆汁从肝输出至胆管中涉及的MRP2(多药耐药蛋白2、和BSEP(胆盐输出泵)等(KepplerD等人，FASEBJ.，11，pp509_516,1997)。甘草根(乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFISCH)、洋甘草(GlycyrrhizaglabraL.)等的根)属于豆科，并报导其含有如甘草皂苷的三萜皂甙和如甘草素、甘草苷、新甘草苷、新异甘草苷等的数种类黄酮，其已用于治疗咳嗽、胃溃疡、高血压等。通常，迄今为止，在韩国已报导UDCA(熊脱氧胆酸)为治疗胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的唯一药物。因此，至今仍然需要治疗胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的新型药物的开发。本发明人证实了甘草素显示了对由重金属中毒引起的肝病和由肝毒素物质引发的急性和慢性肝脏疾病的潜在治疗和预防作用(Kim等人，Toxicology,197,pp239-251，2004；Kim等人，Chem.Biol.Interact,161,ppl25_138，2006)。然而，在任何上述引文(其公开以引用方式并入本文)中未报导或公开甘草提取物或甘草素对胆汁淤积性肝病的治疗作用。因此，本发明人力图寻找用于治疗胆汁淤积性肝病和提高胆汁流的有效试剂，并通过各种体外试验和动物模型试验来研究甘草提取物和自其分离的甘草素的药理作用，例如，对血液指标(如ALT、ALP、y-GTP等)和组织病理指标(如肝细胞坏死、GSH的消耗)、通过半乳糖胺/LPS诱导的胆汁淤积性肝病动物模型中的保肝指标的抑制作用。最后，本发明人已发现富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素在治疗和预防胆汁淤积性肝病和增加胆汁流中是有效的。
发明内容技术问题根据一个方面，本发明也提供了富含甘草素的提取物或自其分离的化合物用于制造用于治疗或预防人类或哺乳动物中胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的药物中的用途。本发明也提供了治疗人类或哺乳动物中胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的方法，其包括给予所述哺乳动物有效量的上述提取物或自其分离的化合物及其药物可接受的载体。本发明提供了包含作为用于治疗或预防胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的活性成分的甘草提取物或自其分离的甘草素的药物组合物。本发明也提供了一种健康功能食品，其包含作为活性成分的有效量的用于预防或改善胆汁淤积性肝病和用于增加胆汁流的上述提取物或自其分离的化合物以及营养学可接受的添加剂，以预防和改进胆汁淤积性肝病。技术方案因此，本发明的一个目的是提供一种药物组合物，其包含富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素作为用于治疗或预防胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的活性成分以及药物可接受的载体。本发明的另一目的是提供富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素用于制造用于治疗或预防人类或哺乳动物中胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的药物中的用途。本发明的另一目的是提供治疗人类或哺乳动物中胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的方法，其包括给予所述哺乳动物有效量的富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素及其药物可接受的载体。本文公开的术语“富含甘草素的甘草提取物”包括乌拉尔甘草、洋甘草等的提取物，优选乌拉尔甘草，以及可通过包括如下步骤的程序制得的富含甘草素的甘草提取物洗涤、干燥甘草；在第1步骤中进行使用非极性溶剂的分馏以去除非极性溶剂可溶性物质；在第2步骤中将强酸加入馏分并进行酸解反应以获得水解的富含甘草素的馏分；在第3步骤中用强碱中和所述溶液；用水分离包含糖组分的水溶性馏分以获得本发明意图的富含甘草素的提取物。根据本发明的一个方面，提供了一种健康功能食品，其包含有效量的作为活性成分的用于预防或改善胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素以及营养学可接受的添加剂，以预防和改善胆汁淤积性肝病。本文公开的术语“胆汁淤积性肝病”包括肝胆汁郁积性黄疸、胆汁郁积性肝炎、原发性胆汁郁积性肝硬化、急性或慢性胆汁淤积性肝病、原发性硬化性胆管炎、胆石病、转运蛋白抑制病、胆汁性纤维化，或胆管癌，优选地，包括胆汁郁积性肝炎、原发性胆汁郁积性肝硬化、急性或慢性胆汁淤积性肝病和胆石病。可用于本发明但不旨在限制本发明的药草包括对于本领域技术人员而言显而易见，用于相同或类似目的，并可被替代用于预防和治疗胆汁淤积性肝病的同属植物。用于治疗肝病的药物组合物可含有以组合物总重量计约0.01至95W/W%，优选0.5至的本发明的提取物或本发明的化合物。本发明的提取物和化合物可根据如下优选实施方案制得。对于本发明，上述甘草提取物或自其分离的甘草素可通过如下程序制得例如，将甘草(例如乌拉尔甘草)洗涤、干燥，并与5至20倍，优选10至15倍体积的蒸馏水、醇(如甲醇、乙醇等)或其混合物，优选甲醇混合；将溶液在0至室温范围的温度，优选室温冷吸12小时至1星期，优选48至72小时范围的时间，或者在80至120°C范围的温度，优选105°C以上加热回流提取1至M小时，优选2至5小时范围的时间2至5次，或者通过超声、回流或常规提取进行提取；过滤溶液以获得本发明的粗甘草提取物。为了获得更优选的本发明的富含甘草素的提取物，使由如上步骤制得的粗甘草提取物进行使用混合溶剂体系洗脱的重复柱色谱法以获得富含甘草苷的甘草提取物；使用如HCl的强酸使经纯化的提取物进行酸解以去除甘草苷的糖部分；反应物用如NaOH的碱溶液中和；将该溶液进行使用混合物溶剂体系(CHCl3和丙酮)洗脱的硅胶柱色谱法以获得本发明的富含甘草素的提取物。为了获得本发明的纯的甘草素，使所述富含甘草素的提取物进一步经受如硅胶柱色谱法的纯化过程或重结晶法以获得本发明的甘草素。本发明的另一目的是提供用于制备治疗或预防胆汁淤积性肝病有效的组合物的上述甘草提取物和自其分离的甘草素的制备方法。本发明的另一目的是提供一种从甘草的提取物制备富含甘草素的提取物的方法，其包括如下步骤洗涤、干燥甘草；与10至15倍体积的蒸馏水、醇(如甲醇、乙醇等)或其混合物混合；在0至室温范围的温度冷吸溶液48至72小时；过滤残余物以获得粗甘草提取物；使该提取物进行使用混合溶剂体系洗脱的重复柱色谱法以获得富含甘草苷的甘草提取物；使用强酸将该提取物酸解以去除甘草苷的糖部分；用碱溶液中和溶液；将该溶液进行使用混合溶剂体系(CHCl3和丙酮)洗脱的硅胶柱色谱法以获得本发明的富含甘草素的提取物。在本发明的可选择的实施方案中，本发明提供了一种制备本发明的富含甘草素的提取物的方法，其包括如下步骤洗涤、干燥甘草；在10至100°C范围的温度用10至15倍体积的如正己烷、氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯，优选二氯甲烷或其混合物的非极性溶剂提取1小时至7天，优选M至72小时范围的时间，提取方法选自冷吸提取、热水提取、超声提取、SFE(超临界液体萃取法)提取法等，优选超声提取；过滤残余物以去除非极性溶剂可溶性物质；将残余物与10至15倍体积的蒸馏水、如甲醇、乙醇等的醇或其混合物，优选甲醇混合；在10至100°C范围的温度冷吸溶液1小时至7天，优选48至72小时范围的时间，提取方法选自冷吸提取、热水提取、超声提取、SFE提取法等，优选超声提取，以在第1步骤中得到去除非极性溶剂可溶性物质的极性溶剂可溶性馏分；将5至40倍，优选15至20倍体积的强酸(如1-3NHCl、硫酸等，优选INHCl)加入馏分并在10至200°C，优选80至100°C范围的温度进行酸解反应2小时至10小时，优选4至8小时范围的时间，以在第2步骤中获得水解的富含甘草素的馏分；在第3步骤中用如氢氧化钠、氢氧化钾等的强碱中和溶液；用5水分离包含糖组分的水溶性馏分以获得本发明所需的富含甘草素的提取物。本发明的化合物可通过本领域公知的常规方法而转化为它们的药学可接受的盐和溶剂化物。对于盐，由其药学可接受的游离酸形成的其酸-加成盐是可用的，并可通过常规方法制得。例如，在将化合物溶于过量酸溶液中之后，通过水可混溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈)将得到的盐沉淀以制备其酸加成盐，进一步，将等当量的化合物与用水或醇(如二醇单甲醚)稀释的酸的混合物加热并随后通过减压下蒸发或过滤干燥以获得其干燥盐形式。可使用有机酸或无机酸作为上述方法的游离酸。例如，可在本文使用有机酸，如甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、琥珀酸、草酸、苯甲酸、乳酸、乙醇酸、葡糖酸、半乳糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、葡萄糖醛酸、天冬氨酸、抗坏血酸、甲酸(carbonylicacid)、香草酸、氢碘酸等，和无机酸，如盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、酒石酸等。进一步，本发明的化合物的药学可接受金属盐的形式可通过使用碱制得。可通过常规方法制得其碱金属或碱土金属盐，例如，在将化合物溶于过量碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液之后，过滤不可溶的盐，蒸发剩余滤液并干燥以获得其金属盐。钠、钾或钙盐为药物合适的作为本发明的金属盐，相应的银盐可通过使碱金属盐或碱土金属盐与如硝酸银的合适的银盐反应而制得。若未在本文特别指出，化合物的药学可接受的盐包括可存在于化合物中的所有酸性或碱性盐。例如，本发明的药学可接受的盐包括羟基的盐，如其钠、钙和钾盐；氨基的盐，如溴化氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸(甲磺酸)盐和对甲苯磺酸(甲苯磺酸)盐等，其可通过本领域公知的常规方法制得。本发明的又一目的是提供一种药物组合物，其包含粉末形式、提取形式或干浸膏形式的通过上述方法获得的如上粗药物提取物作为用于预防和治疗胆汁淤积性肝病的活性成分。当本发明的提取物或本发明的化合物口服给药和静脉内给药时，本发明的组合物显著增加了胆汁酸排泄中涉及的转运蛋白的基因表达，并抑制了如ALT、ALP、γ-GTP等的血液指标和如肝细胞坏死、GSH消耗的组织病理指标、半乳糖胺/LPS诱导的胆汁淤积性肝病动物模型中的保肝指标的增加。当测试提取物的口服急性毒性时，提取物对死亡率、临床症状、体重变化和验尸的总的结果(grossfindings)无明显影响。用于治疗胆汁淤积性肝病的药物组合物可含有以组合物总重量计约0.01至99.，优选0.1至的本发明的如上粗药物组合物。本发明的组合物可根据所用方法另外包含常规的载体、佐剂或稀释剂。优选的是根据用途和应用方法使用所述载体作为适当的物质，但不限制。适当的稀释剂列于Remington’sPharmaceuticalScience(MackPublishingco，EastonPA)的文禾高中。在下文中，如下配制方法和赋形剂仅是示例性的，且不限制本发明。根据本发明的组合物可作为药物组合物提供，所述药物组合物含有药物可接受的载体、佐剂或稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。配方可另外包含填料、抗凝集齐IJ、润滑剂、润湿剂、增味剂、乳化剂、防腐剂等。可配制本发明的组合物以在通过利用本领域公知的任何程序向患者给药之后提供活性成分的快速、持续或延缓释放。例如，可将本发明的组合物溶于油、丙二醇或通常用于制备注射剂的其他溶剂中。载体的合适的例子包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、肉豆蔻酸异丙酯等，但不限于它们。对于局部给药，本发明的化合物可配制为软膏和乳膏的形式。包含本发明组合物的制药配方可以任何形式制得，如口服剂型(粉末、片剂、胶囊、软胶囊、水性药物、糖浆、酏剂丸剂、粉末、小袋、颗粒)或局部制剂(乳膏、软膏、洗液、凝胶、香脂、贴剂、糊剂、喷雾溶液、气溶胶等)、栓剂或无菌可注射制剂(溶液、悬浮液、乳液)。药物剂型的本发明的组合物可以它们的药学可接受的盐的形式使用，也可单独或适当的联合使用，以及与其他药物活性化合物组合使用。本发明组合物的合意的剂量根据条件和受试者重量、严重性、药物形式、给药途径和时间而变化，并可由本领域技术人员进行选择。然而，为了获得合意的效果，通常推荐给药者0.01-10g/kg，优选1至5g/kg(以重量/天计)的剂量范围的本发明组合物。剂量可每天单剂量或多剂量给药。就组合物而言，粗药物组合物应以组合物总重量计0.01至80重量％之间，优选0.5至50重量％之间的量存在。本发明的药物组合物可经由各种途径给药至受试动物，如哺乳动物(大鼠、小鼠、家畜或人类)。预期多种给药模式，例如，可口服、经直肠或通过静脉内、肌内、皮下、皮内、鞘内、硬膜外或脑室内注射进行给药。根据本发明的一个方面，提供了一种健康功能食品，其包含作为活性成分的有效量的用于预防或改善胆汁淤积性肝病的上述提取物或化合物以及营养学可接受的添加剂，以预防和改善胆汁淤积性肝病。本发明的健康功能食品的粗药物组合物以其粉末形式、其提取形式或其干浸膏形式使用。用于预防和改善胆汁淤积性肝病的健康功能食品组合物可含有以组合物总重量计约0.01至，优选0.5至的本发明的如上组合物。可将上述组合物加入食品、添加剂或饮料以用于预防和改善胆汁淤积性肝病。为了预防和改善胆汁淤积性肝病的目的，其中，上述粗药物组合物在食品或饮料中的量通常为用于健康食品组合物的食品的总重量的约0.1至15w/w%，优选1至10w/w%，以及相比于IOOmL健康饮料组合物的1至30g，优选3至10g。假设本发明的健康饮料组合物含有所指比例的上述粗药物组合物作为基本组分，则对其他液体组分无特别限制，其中其他组分可为各种除臭剂或天然碳水化合物等，如常规饮料。上述天然碳水化合物的例子为单糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖等；常规糖，如糊精、环糊精；和糖醇，如木糖醇和赤藓醇等。作为除了上述除臭剂之外的其他除臭剂，可有利地使用如索马甜(taumatin)的天然除臭剂，如莱包迪苷A(levaudiosideA)、甘草皂苷等的甜叶菊提取物，和如糖精、阿斯巴甜等的合成除臭剂。上述天然碳水化合物的量相比于IOOmL本发明的饮料组合物通常为约1至20g，优选5至12g的范围。除了上述组合物之外的其他组分为各种营养物、维生素、矿物质或电解质、合成增味剂、着色剂和改进剂(在奶酪巧克力等的情况中)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体粘合剂、PH控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料中的碳化剂等。除了上述组分之外的其他组分可为用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果汁，其中组分可单独使用或结合使用。组分的比例不重要，但通常为每100W/W%本发明的组合物约0至20/%的范围。其中包含上述粗药物组合物的可添加食品的例子为各种食品、饮料、口香糖、维生素复合物、营养改善食品等。对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的精神和范围下可对本发明的组合物、用途和制剂进行各种改变和变化。有益效果如上所述，本发明的包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的组合物显著增加胆汁流速率和胆汁酸、GSH和胆红素的胆汁排泄。与这些结果相符，当本发明的提取物或本发明的化合物口服给药或静脉内给药时，所述组合物减少了包括作为保肝标志的ALT和作为胆汁淤积标志的ALP和g-GTP的血化学标志，以及包括半乳糖胺/脂多糖-诱导的肝中毒动物模型中的中心坏死和炎症的组织化学标志。因此，本发明的组合物可用于预防和治疗胆汁淤积性肝病，并可用作安全有效的保肝剂。本发明的如上和其他目的、特征和其他优点将由如下详细描述结合附图而更清楚地理解，其中图I-A显示了Ml(4-0-葡萄糖苷酸)和M2(7-0-葡萄糖苷酸)的化学结构；图I-B显示了在甘草素(LQ)静脉内给药至大鼠(50mg/kg)的情况下试验中LQ血清水平随时间的变化；图I-C显示了在甘草素(LQ)静脉内给药至大鼠(50mg/kg)的情况下试验中LQ代谢物，即Ml和M2随时间的变化；图2-A表示当50mg/kgLQ静脉内给药至动物模型时甘草素治疗与对照组对胆汁酸排泄的比较作用；图2-B表示当50mg/kgLQ静脉内给药至动物模型时甘草素的利胆作用引起胆汁中胆汁酸排泄的增加；图2-C表示当50mg/kgLQ静脉内给药至动物模型时甘草素的利胆作用引起胆汁中GSH排泄的增加；图2-D表示当50mg/kgLQ静脉内给药至动物模型时甘草素的利胆作用引起胆汁中胆红素排泄的增加；图3-A表示15mg/kgLQ静脉内给药3天增加了在肝脏组织内的胆汁酸排泄中涉及的转运蛋白水平(mRNA定量分析结果验证了转运蛋白的增加，所述转运蛋白即NTCP(Na+-依赖性牛磺胆酸共转运多肽)和在胆汁流入肝细胞中涉及的细胞膜中存在的0ATP-1(有机阴离子转运多肽-1)；在胆汁从肝脏输出至胆管中涉及的如MRP2(多药耐药蛋白2)和BSEP(胆盐输出泵)的肝细胞膜转运蛋白)；图3-B表示反映MRP2的增加的蛋白质印迹分析(Westernblotanalysis)结果，MRP2为在胆汁酸的输出中涉及的主要转运蛋白；图3-C表示反映MRP2的增加的免疫化学染色分析结果，MRP2为在胆汁酸的输出8中涉及的主要转运蛋白；图4-A表示如ALT(丙氨酸转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶)和-GTP(谷氨酰转移酶)的血液生物化学指标分析，其证明了当静脉内给药15mg/kg的LQ或口服给药50mg/kg的LQ3天时对由半乳糖胺(GalN)/脂多糖(LPS)诱导的肝损伤的保肝作用；图4-B表示组织化学H&E染色分析，其证明了当静脉内给药15mg/kg的LQ或口服给药50mg/kg的LQ3天时对由氨基半乳糖/脂多糖诱导的肝损伤的保肝作用；图4-C表示组织化学TUNEL染色分析，其证明了当静脉内给药15mg/kg的LQ或口服给药50mg/kg的LQ3天时对由氨基半乳糖/脂多糖诱导的肝损伤的保肝作用；图5-A表示减少的代表性指数GSH水平的恢复，其证明了当静脉内给药15mg/kg的LQ或口服给药50mg/kg的LQ3天时对由氨基半乳糖/脂多糖诱导的肝损伤的保肝作用；图5-B表示增加的代表性免疫指数TNF-水平的恢复，其证明了当静脉内给药15mg/kg的LQ或口服给药50mg/kg的LQ3天时对由氨基半乳糖/脂多糖诱导的肝损伤的保肝作用。具体实施例方式最佳模式如下实施例和实验实施例旨在进一步说明本发明而不限制本发明的范围。本发明的模式实施例1本发明的甘草提取物(GE-I)的制备将购自位于首尔的Kyimg-dong市场的3kg乌拉尔甘草洗涤、干燥，并向其中加入15升100%甲醇。在室温静置该溶液72小时，提取物用过滤纸过滤。滤液用真空浓缩器(N-21NS,ELYA)浓缩以获得120g棕色凝胶型粗甘草提取物(下文指定为GE-1)。实施例2水解的甘草提取物(GE-2)的制备将2升INHCl加入120g实施例1中制得的提取物(GE-1)中，并在100°C下进行酸解6小时。溶液用2升INNaOH溶液中和以获得约90g水解的甘草提取物(下文指定为GE-2)。实施例3甘草素(LQ)的制备使实施例2中制得的水解产物经过硅胶柱色谱法(60cm，230-400目)，洗脱溶液起始自CHCl3至混合物溶剂(CHCl3-MeOH=501—151)，获得43g纯化的馏分。该馏分进一步经过硅胶柱色谱法(50cm，230-400目)，洗脱溶液为混合物溶剂(CHCl3-丙酮=201—11)，获得17g淡黄色富含甘草苷的馏分，即馏分22-45[Rf=0.7，展开溶剂CHCl3-MeOH=41]。将在实施例2中制得的水解产物经过硅胶柱色谱法(60cm，230-400目)，洗脱溶液起始自CHCl3至混合物。将收集的包含丰富甘草苷的馏分进一步经过硅胶柱色谱法(50cm，230-400目)，洗脱溶液为混合物溶剂(CHCl3-MeOH=501—151)，并进行使用二氯甲烷的重结晶，获得12g白色粉末状甘草素提取物(下文指定为LQ)。实施例4本发明的富含甘草素的甘草提取物(GEF-I)的制备将2000mlINHCl加入Ikg实施例1中制得的甘草提取物，并在100°C下反应6小时以水解甘草苷的糖部分。反应物用2000mlINNaOH中和。水解产物用蒸馏水反复洗涤以去除糖组分和盐组分以获得800g富含甘草素的甘草提取物(下文指定为GEF-1)。对比实施例实验制备试剂和实验动物半乳糖胺(SigmaChemicalCo.)和脂多糖(SigmaChemicalCo.)购自商业公司以在实验中使用。聚乙二醇#400(YakuriCo.)用生理溶液稀释。重量为140_160g的雄性斯普拉-道来大鼠(SamtakoCo.Korea)在实验中使用并允许提供饲料(Harlan，teklan,USA)和饮水。在使用之前，将所有动物保持在温度为22士2°C且湿度为55士5%，具有12小时的明暗周期的受控环境中至少1个星期。统计所有结果通过使用药理学计算进行分析。测试组之间的显著性通过ANOVA(单向方差分析法)评估并通过Newmann-Keuls测试方法(*p<0.5，**p<0.01)确定。实验实施例1静脉内给药的本发明的提取物和化合物对大鼠模型中的胆汁排泄的作用为了研究实施例中获得的本发明的提取物和化合物对胆汁排泄的抑制作用，在程序中进行如下实验。将蒸馏水中的溶于在对比实施例中制得的40%PEG溶液中的甘草素(50mg/kg)静脉内给药至大鼠，一天一次，在处理结束之后每隔1小时收集胆汁以分析胆汁组分。在结果中，静脉内给药至大鼠(50mg/kg)的甘草素转化为其代谢物，即Ml(4，-0-葡萄糖苷酸)和M2(7-0-葡萄糖苷酸)。Ml和M2的血液水平在530分钟内达到最大值，并保持直到36小时(参见图1)。在研究胆汁排泄和甘草素代谢的变化之后，胆汁排泄在02小时内显著增加，且胆汁成分(即胆液、谷胱甘肽(GSH)和胆红素)的排泄水平也在甘草素(50mg/kg)静脉内给药之后增加(参见图2)。实验实施例2静脉内给药的本发明的提取物和化合物对大鼠模型中的转运蛋白表达的增加的作用为了研究实施例中获得的本发明的提取物和化合物对转运蛋白表达的增加的抑制作用(其紧密涉及胆汁增加作用)，在程序中进行如下实验。将甘草素静脉内给药至大鼠(15mg/kg)，每天一次达3天，然后在处理之后1小时，将肝脏从大鼠分离。在结果中，使用mRNA对在胆汁酸流入肝细胞中涉及的两个细胞膜蛋白(即0ATP-1和NTCP)以及在胆汁酸从肝脏排泄至胆管中涉及的胆小管膜蛋白(即MRP2和BSEP)的血清水平的增加进行分析，在用甘草素处理的组中mRNA的表达急剧增加(参见图3-A)。MRP2(在胆排泄中相关的主要蛋白)的水平不仅在mRNA分析中，还在蛋白质和免疫化学染色分析中显著增加(参见图3-B和3-C)。实验实施例3静脉内给药的本发明的提取物和化合物对大鼠模型中半乳糖胺/LPS诱导的胆汁淤积性肝病的抑制作用为了研究实施例中获得的本发明的提取物和化合物对大鼠模型中半乳糖胺/LPS诱导的胆汁淤积性肝病的抑制作用，在程序中进行如下实验。将甘草素静脉内给药至大鼠，一天三次达3天(15mg/kg)，或口服给药，一天三次达3天(50mg/kg)。为了引起胆汁淤积性肝病，将半乳糖胺(600mg/kg)和LPS(lyg/kg)—次性腹腔内给药，然后在处理之后M小时，将血液和肝脏从大鼠腹腔分离。在结果中，在两个不同的处理实验组中，血液指标(即肝损伤指标ALT和胆汁淤积指标-GTP和ALP)的增加得以显著抑制(参见图4)，这验证了甘草素对胆汁淤积性肝病的发生和发展的抑制作用。此外，使用H&E染色法和TUNEL染色法确定甘草素对胆汁淤积性肝中毒的抑制作用。已证实甘草素显著降低由半乳糖胺/LPS诱导的肝细胞的中心坏死和细胞凋亡，其结果与血液分析中的结果一致，并直接验证了甘草素对肝损伤的发生和发展的抑制作用(参见图4)。而且，确定了TNF-α(炎症指标以及致病细胞凋亡)的量和显示保肝活性的GSH的量。在结果中，确定在实验中甘草素有效抑制了TNF-α的增加和GSH的减少(参见图5)。在下文将描述配制方法和赋形剂类型，但本发明不限于它们。代表性的制备实施例如下描述。粉末的制备GEF-I25mg玉米淀粉20mg乳糖30mg硬脂酸Mg最佳含量粉末制剂通过混合如上组分并填充密封包装而制得。片剂的制备GEF-IIOOmg玉米淀粉IOmg乳糖50mg硬脂酸镁最佳含量片剂制剂通过混合如上组分并压片(entabletting)而制得。胶囊的制备GEF-IIOmg结晶纤维素！Bmg乳糖14.ang硬脂酸镁OJmg片剂制剂通过混合如上组分并通过常规明胶制备方法填充明胶胶囊而制得。注射液的制备GEF-IIOmg甘露醇180mgNa2HPO4-12H2026mg注射用蒸馏水197%ig注射液制剂通过溶解活性组分、控制PH至约7.5，然后将所有组分填充至2mL安瓶(ample)中，通过常规注射液制备方法进行灭菌而制得。液体的制备GEF-I20mg糖20g甘露醇5g蒸馏水最佳含量液体制剂通过溶解活性组分，然后将所有组分填充至IOOOmL安瓶中，并通过常规液体制备方法进行灭菌而制得。健康食品的制备GEF-I1000mg维生素混合物最佳含i维生素A乙酸盐70mg维生素El.Omg维生素B10.13mg维生素B20.15mg维生素B60.5mg维生素B120.2mg维生素C10mg生物素IOmg酰胺烟酸1.7mg叶酸50mg泛酸钙0.5mg矿物质混合物最佳含i硫酸亚铁1.75mg氧化锌0.82mg碳酸镁25.3mg磷酸一钾15mg磷酸二钙55mg柠檬酸钾90mg碳酸钙100mg氯化镁24.8mg上述维生素和矿物质混合物可以多种方式变化。这种变化不应看作是对本发明的精神和范围的偏离。12健康饮料的制备GEF-I维生素C维生素E(粉末)15gIOOg0.2g0.25g0.3g3.5g3.5g19.75g1000mg维生素A维生素B1维生素B2酰胺烟酸氧化锌乳酸亚铁蒸馏水最佳含量健康饮料制剂通过溶解活性组分，混合，在85°C下搅拌1小时，过滤，然后将所有组分填充至IOOOml安瓶，并通过常规健康饮料制备方法进行灭菌而制得。由此描述了本发明，显而易见的是本发明可以许多方式变化。这种变化不应看作是对本发明的精神和范围的偏离，且对于本领域技术人员而言显而易见的所有这种改变旨在包括于如下权利要求书的范围内。工业实用性本发明涉及包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的组合物，其显著增加胆汁流速率和胆汁酸、GSH和胆红素的胆汁排泄。与这些结果相符，当本发明的提取物或本发明的化合物口服给药或静脉注射给药时，包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的本发明的组合物减少了包括作为保肝指标的ALT和作为胆汁淤积指标的ALP和γ-GTP的血化学指标，以及包括半乳糖胺/脂多糖-诱导的肝中毒动物模型中的中心坏死和炎症的组织化学指标。因此，本发明的组合物可用于预防和治疗胆汁淤积性肝病，并可用作安全有效的保肝剂。权利要求1.一种药物组合物，其包含富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素作为用于治疗或预防胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的活性成分以及药学可接受的载体。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述富含甘草素的提取物通过包括如下步骤的程序制得洗涤、干燥甘草；在第1步骤中进行使用非极性溶剂的分馏以去除非极性溶剂可溶性物质；在第2步骤中将强酸加入馏分并进行酸解反应以获得水解的富含甘草素的馏分；在第3步骤中用强碱中和所述溶液；用水分离包含糖组分的水溶性馏分以获得所需的本发明的富含甘草素的提取物。3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述富含甘草素的提取物为富含甘草素的甘草提取物，其通过包括如下步骤的程序制得用重复柱色谱法纯化甘草提取物以获得纯化的甘草苷馏分；处理以酸解并用碱中和溶液的PH；进行柱色谱法以获得所需的富含甘草素的提取物。4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述胆汁淤积性肝病为胆汁郁积性黄疸、胆汁郁积性肝炎、原发性胆汁郁积性肝硬化、急性或慢性胆汁淤积性肝病、原发性硬化性胆管炎、胆石病、转运蛋白抑制病、胆汁性纤维化或胆管癌。5.富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素用于制造用于治疗或预防人类或哺乳动物中胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的药物中的用途。6.一种治疗人类或哺乳动物中胆汁淤积性肝病和增加胆汁流的方法，其包括向所述哺乳动物给予有效量的富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素及其药学可接受载体。7.一种健康功能食品，其包含有效量的用于预防或改善胆汁淤积性肝病和用于增加胆汁流的富含甘草素的甘草提取物或自其分离的甘草素作为活性成分以及营养学可接受的添加剂，以预防和改善胆汁淤积性肝病。8.一种制备本发明的富含甘草素的提取物的方法，其包括如下步骤洗涤、干燥甘草；在10至100°C范围的温度用10至15倍体积的如正己烷、氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯的非极性溶剂提取1小时至7天的时间，提取方法选自冷吸提取法、热水提取法、超声提取法、SFE提取法等；过滤残余物以去除非极性溶剂可溶性物质；将残余物与10至15倍体积的蒸馏水、如甲醇、乙醇等的醇或其混合物混合；在10至100°C范围的温度冷吸溶液1小时至7天的时间，提取方法选自冷吸提取法、热水提取法、超声提取法、SFE提取法等，以在第1步骤中获得去除非极性溶剂可溶性物质的极性溶剂可溶性馏分；将5至40倍体积的强酸加入馏分并在10至200°C范围的温度进行酸解反应2小时至10小时的时间以在第2步骤中获得水解的富含甘草素的馏分；在第3步骤中用如氢氧化钠、氢氧化钾等的强碱中和溶液；用水分离包含糖组分的水溶性馏分以获得所需的本发明的富含甘草素的提取物。全文摘要本发明涉及包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的组合物，其显著增加胆汁流速率和胆汁酸、GSH和胆红素的胆汁排泄。与这些结果相符，当本发明的提取物或本发明的化合物口服给药和静脉内给药时，包含甘草提取物或自其衍生的甘草素的本发明的组合物减少了包括作为保肝标志的ALT和作为胆汁淤积标志的ALP和γ-GTP的血化学标志，以及包括半乳糖胺/脂多糖-诱导的肝中毒动物模型中的中心坏死和炎症的组织化学标志。文档编号A61K36/484GK102223888SQ200980147241公开日2011年10月19日申请日期2009年9月24日优先权日2008年10月8日发明者金盈佑,金相建,金相赞申请人:首尔大学校产学协力团