重组禽流感疫苗及其用途的制作方法

专利名称：重组禽流感疫苗及其用途的制作方法
重组禽流感疫苗及其用途相关申请的交叉引用本申请要求提交于2008年11月28日的美国临时申请系列No. 61/118，492的权利。
技术领域：
本发明含盖流感疫苗，尤其是禽流感疫苗。疫苗可为重组禽疫苗。背景技术：
禽流感(Avian influenza)、有时禽流感(avian flu)以及通常鸟流感(bird flu) 指由适于鸟的病毒所致的流感。禽流感病毒(AIV)是RNA病毒属于正粘病毒科，且被分类为A型流感病毒，其涉及其核蛋白和膜蛋白。AIV具有特征为2种不同的糖蛋白的脂质包膜血凝素(HA)，其辅助病毒进入宿主细胞；以及神经氨酸酶(NA)，其辅助后代病毒从感染的细胞释放(de Jong et al.，J Clin Virol. 2006Jan ；35(1) :2-13)。已经将 H5m 亚型 (以HA 5和NA 1为特征的病毒)特异性地与最近亚洲、俄罗斯、中东、欧洲和非洲爆发的相关联(Olsen et al.，Science. 2006Apr 21 ；312 (5772) :384-8)。高度病原性流感病毒亚型H5m病毒是新出现的作为潜力流行病威胁导致全球关注的禽流感病毒。H5m已经在贯穿亚洲、欧洲和非洲的越来越多的国家杀死数百万禽。健康专家担心人流感病毒和禽流感病毒(尤其H5m)的共存将提供遗传物质在物种-特异性病毒之间交换的机会，可能产生容易传播且对于人致死的新强毒流感株(Food Safety Research Information Office. " A Focus on Avian Influenza" . Created May 2006, Updated November 2007)。由于首次H5m爆发发生在1997年，有越来越多的HPAI H5N1鸟到人传播导致临床上严重的且致死的人感染。但是，因为鸟和人之间存在显著的物种屏障，病毒不容易跨越到人。尽管自从其发现，百万的鸟被病毒感染，在印度尼西亚、老挝、越南、罗马尼亚、中国、 土耳其和俄罗斯超过200人死于禽流感。最近，研究植物作为产生治疗性试剂(例如疫苗、抗体和生物医药)的来源。但是，从植物的疫苗、抗体、蛋白和生物医药的生产与治疗处理相去甚远，且有通常与所述疫苗产生相关的多种障碍。成功地产生植物疫苗的限制包括生物产品或表达的抗原的低产率(Chargelegue et al. ,Trends in Plant Science 2001，6，495-496)、蛋白不稳定性、产物质量的不一致性(Schillberg et al. ,Vaccine 2005，23，1764-1769)和产生期望的尺寸和免疫原性的病毒样产物的不足的能力(Arntzen et al. ,Vaccine 2005，23，1753-1756)。考虑动物(包括人)对AIV的感受性，防止AIV感染和保护动物的方法是必要的。 因此，有对产生针对流感的有效疫苗的方法的需要。发明概述提供包括流感多肽和其片段和变体的组合物。多肽或抗原在植物中产生，且是高度免疫原性的和保护性的。
多肽和其片段和变体可配制成疫苗和/或药学或免疫学组合物。所述疫苗或组合物可用于免疫接种动物和提供针对同源和异源流感株的保护。本发明的方法包括使用方法，包括给动物施用有效量的抗原性多肽或其片段或变体，以产生保护性免疫原性应答。方法也包括在浮萍植物中制备抗原性多肽的方法。在浮萍中产生后，抗原性多肽可对于用作疫苗或免疫学组合物是部分或基本上纯化的。也提供包括至少一种抗原性多肽或其片段或变体和使用说明的试剂盒。

以下详细的描述，通过实施例方式给予，但不旨在将发明仅限制在描述的特定实施方式的可连同附图被最佳理解，其中图1是显示分配到多核苷酸和蛋白序列的SEQ ID NO的表。图2提供编码A/鸡/印度尼西亚/7/2003H5m血凝素(HA) (SEQ ID NO 1)的合成的(密码子-优化的)和突变的DNA序列。图3提供天然的和合成的/突变的A/鸡/印度尼西亚/7/2003H5m (HA)蛋白序列。图4提供HA基因的A/鸡/印度尼西亚/7/2003 (H5N1)野生型(天然的)cDNA序列(GenBank Accession No. EF473080)(SEQ ID NO :3)。图5显示HA蛋白序列比对和序列同一性表。图 6 显示 MerBOl 载体序列(SEQ ID NO 6)图7显示MerBOl载体图谱。图8显示DNA序列比对和序列同一性表。图9显示阳性转基因植物的HA筛选的平铺实施例和HA测定结果。图10提供表达Η5^ΗΑ的转基因植物的HA测定结果。图11提供显示靶制剂的估计的产率的表。图12 14显示用不同的抗体进行的血凝抑制测定结果。图15显示SDS-PAGE (银染色)和蛋白印迹。图16提供使用不同的血清的蛋白印迹。图17显示使用针对A/越南/1203/04流感病毒的H5血凝素的单克隆抗体的浮萍表达的HA的免疫定位测定。图18是显示免疫原性研究的疫苗接种方案的表。图19提供HPAI H5N1攻击后保护数据的总结。图20显示来自在第35天从用浮萍来源的HA免疫接种的鸡收集的血清的血凝抑制滴度(log2)。图21显示总结在第42天攻击之前和在第56天攻击后收集的样品上的血清学数据的表。发明详述提供在动物中引起免疫原性应答的包括流感抗原和其片段和变体的组合物。抗原性多肽或其片段或变体可在浮萍植物中产生。抗原性多肽或片段或变体可配制成疫苗或药学或免疫学组合物和用于在动物中引起或刺激保护应答。在一个实施方式中，多肽抗原是血凝素多肽或其活性片段或变体。需知，本发明的抗原性多肽或抗原可为全长多肽或其活性片段或变体。说道“活性片段”或“活性变体”期望片段或变体保留多肽的抗原性性质。由此，本发明含盖在动物中引起免疫原性应答的任何流感多肽、抗原、表位或免疫原。流感多肽、抗原、表位或免疫原可为任何流感多肽、抗原、表位或免疫原、例如但不限于在动物中引起、诱导或刺激应答的蛋白、肽或其片段或变体。特定目的抗原性多肽是血凝素(HA)。流感血凝素指见于流感病毒表面的一种类型的血凝素。其为抗原性糖蛋白，且负责病毒与被感染的细胞的结合。有不同的HA抗原，其中任何可在本发明实践中使用。关心的是来自H5N1 (高度病原性禽流感病毒)的HA。更尤其，HA可从分离自A/鸡/印度尼西亚/7/2003株的H5W分离。但是，来自其他流感病毒的HA(即Hl H16)可在本发明的实践中使用的包括出1、!13、!15、!16、!17、!19等。还需知， 可使用HA蛋白之任何的HA前体。HA是有包含球形头和茎区的胞外域的同原三聚体跨膜蛋白。两个区载N-连接的寡糖，其在HA的生物学功能中起重要的作用(Schulze,I.T.，J Infect Dis，1997. 176Suppl 1 :p. S24-8 ；Deshpande, K. L.，et al.，PNAS USA, 1987,84 (1) :ρ· 36-40)在流感 A 病毒的不同的亚型之中，在头区糖基化位点中有显著变异，然而茎寡糖更保守且对于融合活性需要 (0huchi，R.，et al. ,J Virol, 1997, 71 (5) :p. 3719-25) 接近抗原性肽表位的聚糖干扰抗体识别(Skehel，J. J.，et al.，PNAS USA, 1984,81 (6) :ρ· 1779-83)，而接近蛋白水解位点的聚糖调节切割和影响流感病毒的感染性(Deshpande, K. L.，et al.，1987)。62种H5基因的核苷酸序列分析支持如下假说，接近HA球形头之内的受体结合位点的额外的糖基化是从野生鸟(尤其水禽)到家禽的物种间传播后病毒的适应(Banks，J. ,et al. ,Avian Dis, 2003,47 (3Suppl) :ρ·942-50)。就流感病毒HA蛋白鉴定超过150种B细胞表位以及113种⑶4+和35⑶8+Τ细胞表位，但是，仅有限的数的表位报告对于禽流感株/亚类(Bui, H. H. ,et al.，PNAS USA, 2007, 104(1) :p. 246-51)。在天然的和单克隆抗体-选择的抗原性变体中的氨基酸置换的位点的检查表明全部抗原性位点在主要围绕受体-结合位点的膜远端HAl结构域表面上。有2个抗原性位点的明显特征它们中几种的环样结构和碳水化合物侧链的出现(Skehel，J. J.， et al. ,Annu Rev Biochem，2000，69 :p. 531-69)。已描述2个H5抗原性位点的定位和精细结构(Kaverin, N. V.，et al.，J Gen Virol, 2002. 83 (Pt 10) :ρ· 2497-505)。位点 1 是包括HAl残基140 145的暴露的环，其对应于Η3的抗原性位点A和Hl的Ca2、包括2个亚位点的位点2，对应于H3亚型的位点B的一个(HAl残基156和157)和对应于Hl亚型的位点&的一个(HAl残基129 133)。表位定位研究推荐，新近分离的H5W的HA抗原性结构基本上不同于低病原性H5株，且快速进化(Kaverin，N. V.，等人，J Virol, 2007. 81 (23) p. 12911-7)。表位保守性分析推荐显著水平的株间交叉-反应性可能对于T细胞表位，但对于Ab表位少得多。使用重叠肽库，首次鉴定AIV的T细胞表位，其为15聚体肽，HAl结构域之内H5246_26Q，其诱导针对H5HA免疫的鸡中T细胞的作用(Haghighi，H. R.，等人，PLoS ONE, 2009. 4(11) :ρ· e7772)。需知，在本公开和尤其在权利要求和/或段落中，术语例如“包括(comprises) ”、 “包括(comprised) ”、“包括(comprising) ”等可具有美国专利法规定的含义；例如，它们可意旨“包括(includes)”、“包括(included)，，、“包括(including) ”等；且术语例如“基本上由…构成(consisting essentially of)，，禾口“基本上由…构成 consist essentially of ”具有美国专利法规定的含义，例如，它们允许不隐含提及的要素、但排除见于现有技术或影响本发明的基本的或新特征性的要素。除非别有说明，本文中使用的全部技术和科学术语具有与本公开所属的领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。单数术语“a，” “皿，”和“the”包括复数，除非上下文明显表示别的。类似地，字“或”期望包括“及”，除非上下文明显表示别的。说道“动物”期望是哺乳动物、鸟等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自马类(例如、马)、狗类(例如、狗、狼、狐、山狗、豺)、猫类(例如、狮、虎、家养猫、野生猫、其他大猫、及其他猫包括猎豹及山猫)、绵羊类(例如、绵羊)、牛类(例如、牛)、猪类(例如、 猪)、禽类(例如、鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类动物(例如、狐猴、跗猴、猴、长臂猿、人猿)和鱼。术语“动物”也包括全部发育阶段的个体动物、包括胚胎及胚胎阶段。术语“蛋白”、“肽”、“多肽，，和“多肽片段”在本文中使用互换，指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可为线性或分支的、其可包括修饰的氨基酸或氨基酸类似物，及其可被非氨基酸的化学部分打断。术语也含盖天然地或通过干扰修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物反应性成分缀合。本发明的抗原性多肽能保护免于流感。这是说，它们能在动物中刺激免疫应答。 说道“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可包括全生物、杀死的、减弱的或活的抗原；生物的亚单位或部分；重组载体含有免疫原性性质的插入子；DNA片段能在呈递给宿主动物之后诱导免疫应答；多肽、表位、半抗原或其任何组合。另外，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。本文所用的术语“免疫原性或抗原性多肽”包括一旦施用给宿主免疫学活跃的多肽，其能够引发针对蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选蛋白片段与总蛋白有基本上相同的免疫学活性。由此，根据发明的蛋白片段包括至少一种表位或抗原性决定子，或基本上由其构成或由其构成。本文所用的"免疫原性或抗原性"多肽包括蛋白的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。说道"免疫原性或抗原性片段"是指包括一个或多个表位的蛋白片段，且由此引起以上描述的免疫学应答。所述片段可使用本领域熟知的任何数的表位定位技术鉴定。见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed.，1996)。例如、线性表位可如下测定，例如，在固体支持物上同时合成大量的肽，相应于蛋白分子部分的肽，及使肽与抗体反应而肽仍附接于支持物。所述技术本领域中已知及描述于例如，美国专利No. 4，708，871 ；Geysen等人，1984 ； Geysen等人，1986。类似地，构象表位通过确定氨基酸的空间构象轻易鉴定，例如通过，例如，X射线晶体学和2-维核磁性共振。见，例如，上述的表位定位流程。尤其可应用到小泰勒虫(T.parva)的蛋白的方法完全描述于通过引用整体并入本文的PCT/US2004/022605。如所讨论，发明含盖抗原性多肽的活性片段和变体。由此、术语“免疫原性或抗原性多肽”还涵盖对序列的缺失、添加和置换，只要多肽发挥产生本文定义的免疫学应答的功能。术语"保守性变异"是指氨基酸残基被另一生物学类似残基取代，或核酸序列中的核苷酸取代而编码的氨基酸残基不变化或是另一生物学类似残基。对此，尤其优选的置换将通常是性质保守性的，即，那些在氨基酸家族之内发生的置换。例如，氨基酸通常被分为的 4个家族(1)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；( 碱性的一赖氨酸，精氨酸，组氨酸；C3)非极性一丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不带电的极性一甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸被分类为芳族氨基酸。保守性变异之例包括一种疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸用另一疏水残基置换，或一种极性残基用另一极性残基置换，例如精氨酸用赖氨酸置换、谷氨酸用天冬氨酸置换、或谷氨酰胺用天冬酰胺置换等；或氨基酸与结构上相关的氨基酸的将对生物学活性无主要效应的类似保守性取代。因此，与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有少数基本上不影响蛋白免疫原性的氨基酸置换的蛋白在参照多肽的定义之内。通过这些修饰产生的全部多肽包括在本文中。术语"保守性变异"也包括使用取代的氨基酸代替未经取代的亲本氨基酸，只要对于取代的多肽产生的抗体也与未经取代的多肽免疫反应。术语"表位"指特异性B细胞和/或T细胞与之响应的抗原或半抗原上的位点。 术语也与"抗原性决定子"或"抗原性决定子位点"互换使用。识别相同的表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定。对组合物或疫苗的"免疫学应答"是在宿主中细胞和/或抗体-介导的对目的组合物或疫苗的免疫应答的发展。通常，“免疫学应答"包括但不限于下列效应的一种或多种特异性地针对包括在目的组合物或疫苗的抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、和/或细胞毒性T细胞的产生。优选，宿主将显示治疗性或保护免疫学应答，从而对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重性降低。所述保护将被在感染的宿主中通过感染的宿主、更快恢复时间和/或降低的病毒滴度正常显示的症状的降低或缺乏展示。合成的抗原也包括在定义之内，例如，多表位、侧翼表位、及其他重组或合成来源的抗原。见，例如，Bergmann et al. , 1993 ；Bergmann et al. , 1996 ；Suhrbier, 1997 ； Gardner et al.，1998。用于本发明的目的的免疫原性片段将通常包括分子的至少约3个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10 15个氨基酸、或约15 25个氨基酸或更多氨基酸。片段长度无特别上限，其可包括几乎全长蛋白序列或甚至包括蛋白的至少一种表位的融合蛋白。因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包括编码流感多肽的表位或抗原性决定子的核苷酸或基本上由其构成或由其构成。编码流感多肽的片段的多核苷酸可包括编码多肽的序列的最小15个核苷酸、约30 45个核苷酸、约45 75个或至少57、87或 150个连续的核苷酸，或基本上由其构成或由其构成。表位确定过程，例如，产生重叠肽库 (Hemmer 等人，1998), Pepscan (Geysen et al. , 1984 ；Geysen et al. , 1985 ；Van der Zee R. et al. , 1989 ；Geysen, 1990 ；Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot等人，1999 ；PCT/US2004/022605)可在本发明的实践中使用。术语“核酸”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体。术语也含盖RNA/DNA杂交体。以下是多核苷酸的非-限制实施例基因片段、外显子、 内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸、
8例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团，例如氟核糖及硫羟酸盐及核苷酸分支。核苷酸序列可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记成分缀合。本定义中包括的其他类型的修饰是加帽、将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物置换、及将多核苷酸附接到蛋白、金属离子、标记成分、其他多核苷酸或固体支持物的手段的导入。多核苷酸可通过化学合成得到或源于微生物。广泛地使用的术语“基因”指与生物学功能相关的任何多核苷酸段。由此、基因如在基因组序列中一样包括内含子和外显子，或如在cDNA中一样仅包括编码序列和/或对于它们的表达所需的调控序列。例如、基因也指表达mRNA或有功能的RNA、或编码特异性蛋白的核酸片段及其包括调控序列。发明还包括编码流感抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为多聚化体及可为任何长度的，及可含以任何组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。“分离的”生物学成分(例如核酸或蛋白或细胞器)指在成分天然存在的生物细胞中从其他生物学成分(例如、其他染色体和额外的-染色体DNA和RNA、蛋白和细胞器)基本上分离的或纯化的成分。“分离的”核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。术语也包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白。本文所用的术语“纯化的”不要求绝对纯度；而期望是相对术语。由此，例如，纯化的多肽制剂是相比在其天然的环境中的多肽更富含多肽的制剂。这是从细胞成分分离的多肽。说道“基本上纯化的，，期望是去除至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少 95%、或至少98%、或更多细胞成分或物质的。同样，多肽可为部分纯化的。说道“部分纯化的”期望是少于60%的细胞成分或物质的除去。这同样应用于多核苷酸。本文中公开的多肽可通过本领域已知的任何手段纯化。如上所述，抗原性多肽或其片段或变体是在浮萍中产生的流感抗原性多肽。公开的多核苷酸和由此编码的多肽的片段和变体也被本发明含盖。说道“片段”期望是多核苷酸的部分或由此编码的抗原性氨基酸序列的部分。多核苷酸的片段可编码保留天然的蛋白的生物学活性的蛋白片段，且因此如在本文中别处所述具有免疫原性活性。多肽序列片段保留在动物中诱导保护免疫应答的能力。“变体”旨在表示基本上类似的序列。对于多核苷酸而言，变体包括在天然的多核苷酸中的一个或多个位点的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加；和/或在天然的多核苷酸中的一个或多个位点的一个或多个核苷酸的置换。本文所述的“天然的”多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本发明的特定多核苷酸的变体(即，参照多核苷酸)也可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分率来评价。“变体”蛋白旨在表示通过在天然的蛋白中的一个或多个位点的一个或多个氨基酸的缺失或添加；和/或在天然的蛋白中的一个或多个位点的一个或多个氨基酸的置换源于天然的蛋白的蛋白。本发明含盖的变体蛋白是生物学活跃的，即它们有能力引起免疫应答。来自禽、猪、马、猫、狗、鸭、火鸡、鸡、鹌鹑和其他物种(包括野生动物)的流感多肽的同源物旨在本发明的范围之内。本文所用的术语“同源物”包括直系同原物、类似物及旁系同原物。术语“类似物”指具有相同的或类似功能，但在不相关的生物中独立地进化的2 种多核苷酸或多肽。术语“直系同原物”指来自不同的物种，但通过物种形成从共同的祖先基因进化而来的2种多核苷酸或多肽。正常而言，直系同原物编码具有相同的或类似功能的多肽。术语“旁系同原物”指通过在基因组之内复制相关的2种多核苷酸或多肽。旁系同原物通常具有不同的功能，但这些功能可相关。野生型流感多肽的类似物、直系同原物及旁系同原物可与野生型流感多肽不同在翻译后修饰、氨基酸序列差异或二者。尤其是，本发明的同源物将通常与野生型流感多肽或多核苷酸序列的全部或部分呈现至少80 85%、 85 90%、90 95%或95%、96%、97%、98%、99%序列同一性，及将呈现类似功能。变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"指含导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群(例如、病毒物种或变种)中存在的多态性的多核苷酸或多肽。所述天然的等位基因变异可一般导致多核苷酸或多肽内1 5%变异。等位基因变体可通过在许多不同的物种中测序目的核酸序列来鉴定，这可通过使用杂交探针来鉴定那些物种中的相同的基因遗传座位来轻易进行。是天然的等位基因变异的结果且不改变目的基因的功能活性的任何和全部所述核酸变异和得到的氨基酸多态性或变异期望在本发明的范围之内。本文所用的术语"衍生物"或“变体”指具有一个或多个保守性氨基酸变异或其他微小修饰的多肽或编码多肽的核酸，从而(1)相应多肽相比野生型多肽具有基本上相当的功能，或( 针对多肽产生的抗体与野生型多肽具有免疫反应性。这些变体或衍生物包括具有流感多肽一级氨基酸序列的微小修饰(可产生相比未修饰的对应多肽具有基本上相当的活性的肽)的多肽。所述修饰可为故意的(如通过定点诱变)或可为自发的。术语 “变体”还涵盖序列的缺失、添加和置换，只要多肽发挥产生本文定义的免疫学应答的功能。 术语“变体”也包括天然的信号肽用异源信号肽取代以辅助多肽从宿主物种表达或分泌的多肽的修饰。其也包括跨膜结构域和/或细胞质尾用类似异源序列取代以辅助多肽在宿主物种中膜表达的多肽修饰。术语"保守性变异"是指氨基酸残基用另一生物学类似残基取代、或核酸序列中核苷酸取代，从而编码的氨基酸残基不变化或是另一生物学类似残基。对此，尤其优选的置换将通常是性质上保守的，如以上所述。公开的多核苷酸包括遗传密码简并的序列，例如，对于特定宿主的优化的密码子利用。本文所用的“优化的”指经遗传加工来增加其给定物种中的表达的多核苷酸。为提供编码流感多肽的优化的多核苷酸，可修饰流感蛋白基因的DNA序列来(1)包括在特定物种中高表达的基因优选的密码子；( 在核苷酸碱基组成中包括基本上在所述物种中发现的A+T或G+C含量；(3)形成所述物种的起始序列；或⑷消除导致去稳定、不适当的多聚腺苷酸化、RNA的降解和终止、或形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列。流感蛋白在所述物种中增加的表达可通过利用在真核生物及原核生物，或在特定物种中密码子利用的分布频度来实现。术语“优选的密码子利用的频度”指由特定宿主细胞在核苷酸密码子利用中呈现的偏好，以指定给定氨基酸。有20种天然的氨基酸，其中多数由多于一种密码子指定。因此，全部简并核苷酸序列包括在公开中，只要由核苷酸序列编码的流感多肽的氨基酸序列在功能性上未变化。2个氨基酸序列之间的序列同一性可通过NCBI (National Center for Biotechnology Information)配对blast和blosum62矩阵、使用标准参数建立(见、例如，
National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Md.)
服务器可用的BLAST或BLASTX算法，也见Altschul等人；及由此，此文献通过术语“blast ”说道使用算法或BLAST或BLASTX和BL0SUM62矩阵)。有关序列的“同一性”可指相同的核苷酸或氨基酸除以2个序列中较短者的核苷酸或氨基酸数的位置数，其中2个序列的比对可根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和 Lipman)、例如、使用20个核苷酸的窗尺寸、4个核苷酸的字长、及4的空位罚分确定、及包括比对的序列数据的计算机-辅助的分析和解释可使用商业上可用的程序方便地进行(例如，Intelligenetics Suite, Intelligenetics Inc. CA) 当说道 RNA 序列类似、或与 DNA 序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷⑴认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)相等。由此、RNA序列在本发明范围之内及可衍生自DNA序列，通过认为DNA序列中的胸苷⑴与RNA序列中的尿嘧啶⑶相等。2个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或2个核苷酸序列之间的序列同一性可使用 Vector NTI 软件包 Qnvitrogen, 1600Faraday Ave.，Carlsbad, CA)确定。以下文献提供比较序列的相对同一性或同源性的算法，及附加地或代替性地与上述相关，这些参考文献的教导可用于确定百分率同源性或同一性meedleman SB和^msch CD ；Smith TF 禾口 Waterman MS ；Smith TF,Waterman MS 禾口 Sadler JR ；Feng DF 和 Dolittle RF ；Higgins DG 禾口 Sharp PM ；Thompson JD> Higgins DG 禾口 Gibson TJ ；及 Devereux J、 Haeberlie P和Smithies 0.及、无需额外实验、本领域技术人员可借助许多其他程序或参考文献来确定百分率同源性。杂交反应可在不同的“严格度”条件下进行。熟知增加杂交反应的严格度的条件。 见例如，“分子克隆实验室手册”，第二版(Sambrook等人，1989)。“载体”指包括待体外或体内递送到靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可包括预防或治疗目的的目的序列，及可任选以表达盒形式。如本文所用，载体需要在最终的靶细胞或受试者中不能复制。术语包括克隆载体和病毒载体。术语“重组”是指半合成、或合成来源的，自然上不会存在或以不见于自然的排列连接到另一多核苷酸的多核苷酸。“异源”是指相比与之比较的实体，源于遗传上不同的实体。例如，多核苷酸可通过遗传加工技术放入源于不同的来源的质粒或载体，及是异源多核苷酸。从其天然的编码序列移出的及可操作连接到编码非天然的序列的序列的启动子是异源启动子。本发明涉及禽疫苗或药学或免疫学组合物，其可包括有效量的重组禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。本文中所述的主题部分针对与如下惊人的发现相关的组合物和方法在植物蛋白表达系统中制备的禽流感抗原是高度免疫原性的且保护鸡免于来自同源和异源禽流感株的攻击。组合物在一实施方式中，本文中公开的主题针对组合物，其包括流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。在一实施方式中，本文中公开的主题针对组合物，其包括通过浮萍表达系统产生的禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。在一实施方式中，本文中公开的主题针对组合物，其包括通过浮萍表达系统和来自浮萍属的植物材料产生的禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。
在一实施方式中，本文中公开的主题针对通过包括禽流感抗原的浮萍表达系统产生的蛋白。蛋白可为糖基化的。在一实施方式中，本文中公开的主题针对通过包括禽流感抗原的浮萍表达系统和来自浮萍属的植物材料产生的蛋白。在一实施方式中，本文中公开的主题针对表达禽流感抗原的稳定转化的植物或植物培养物，其中植物或植物培养物选自浮萍属。在一实施方式中，其中禽流感免疫学组合物或疫苗是重组免疫学组合物或疫苗、 组合物或疫苗包括重组载体和药学或兽医学可接受的赋形剂、载质或媒质；重组载体是可包括编码流感多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的植物表达载体。流感多肽、抗原、表位或免疫原、可为血凝素、基质蛋白、神经氨酸酶、非结构性蛋白、核蛋白、聚合酶或其任何片段。在另一实施方式中，流感多肽、抗原、表位或免疫原可源于感染流感或禽流感株的禽。在一个实施方式中，禽流感抗原、表位或免疫原是血凝素(HA)(例如、HAO前体、HAl和 /或HA2)、H1、H2、蛋白、矩阵蛋白(例如、矩阵蛋白Ml或M2)、神经氨酸酶、非结构性(NS) 蛋白(例如、NSl或NS^、核蛋白(NP)和聚合酶(例如、PA聚合酶、PBl聚合酶1或PB2聚合酶幻。A型流感病毒可感染人、鸟、猪、马、狗、猫和其他动物，但野生鸟是这些病毒的天然的宿主。在另一实施方式中，禽流感抗原可为来自不同的流感A亚型的血凝素(HA)(实施例H1，H3，H5，H6，H7，H9)。再一实施方式中，禽流感抗原可为来自H5W分离物的HA。在另一实施方式中，H5N1抗原分离自A/鸡/印度尼西亚/7/2003株。本发明涉及禽疫苗或组合物，其可包括有效量的重组禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。在一个实施方式中，禽流感抗原可为血凝素。在另一实施方式中，重组流感抗原在植物中表达。再一实施方式中，植物是浮萍。 再一实施方式中，植物是浮萍植物。在一个实施方式中，重组流感抗原可在专利浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统，Biolex' s LEX systemSM中表达。在另一实施方式中，药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质可为油包水乳液。 再一实施方式中，油包水乳液可为水/油/水(w/0/w)三层乳液。再一实施方式中，药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质可为水包油乳液。发明还含盖含于载体分子或表达载体及可操作连接到启动子元件和任选到增强子的流感多核苷酸。在一方面，本发明提供流感多肽，尤其禽流感多肽。在另一方面，本发明提供具有如SEQ ID N0:2、4、5、8、10、12或14所示的序列的多肽和其变体或片段。在另一方面，本发明提供与本发明的抗原性多肽、尤其与具有如SEQ ID NO :2、4、 5、8、10、12或14所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多肽。再一方面，本发明提供以上鉴定的流感多肽的片段和变体(SEQ ID NO :2、4、5、8、 10、12或14)，其可由本领域技术人员使用熟知的分子生物学技术容易制备。变体是与本发明的抗原性多肽、尤其与如SEQ ID N0:2、4、5、8、10、12或14所示的氨基酸序列具有至少约75 %、80%、85 %、90%、95 %、96 %、97%、98 %或99 %同一性的氨基酸序列的同源多肽。流感多肽的免疫原性片段包括具有如SEQ ID NO :2、4、5、8、10、12或14所示的序列的流感多肽或其变体的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸、或至少30个氨基酸。在另一实施方式中，流感多肽的片段包括见于全长流感多肽的特异性抗原性表位。在另一方面，本发明提供编码流感多肽的多核苷酸，例如编码具有如SEQ ID NO 2、4、5、8、10、12或14所示的序列的多肽的多核苷酸。再一方面，本发明提供编码与具有如 SEQ ID N0:2、4、5、8、10、12或14所示的序列的多肽或包括这些多肽之一或这些多肽的组合的至少8个或至少10个连续氨基酸的保守性变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98% 或99%序列同一性的多肽的多核苷酸。在另一方面，本发明提供具有如SEQ ID NO :1、3、7、9、11或13所示的核苷酸序列的多核苷酸或其变体。再一方面，本发明提供与具有如SEQ ID N0:l、3、7、9、ll或13所示的序列的多核苷酸之一或其变体具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、 至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的多核苷酸。本发明的多核苷酸可包括额外的序列，例如相同的转录单元之内的额外的编码序列、控制元件例如启动子、核糖体结合位点、5’ UTR、3’ UTR、转录终止子、多聚腺苷酸化位点、 在相同的或不同的启动子控制下的额外的转录单元、允许克隆、表达、同源重组、及宿主细胞转化的序列及任何所述构建体，如提供本发明的实施方式可期望的。本发明的载体中有利地存在用于表达流感多肽、抗原、表位或免疫原的元件。以最小方式，此包括起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子、及任选用于某些载体例如质粒和某些病毒载体，例如，除了痘病毒的病毒载体的多聚腺苷酸化序列，或基本上尤其构成或由其构成。当多核苷酸有利地在载体中编码多肽片段、例如流感肽时，ATG位于阅读框的 5'，而终止密码子位于3'。可存在其他用于控制表达的元件，例如增强子序列、稳定序列、 例如允许蛋白分泌的内含子和信号序列。本发明也涉及包括载体，例如表达载体的制剂，例如，治疗性组合物。制剂可包括一个或多个载体，例如、表达载体、例如体内表达载体、包括和表达一种或多种流感多肽、抗原、表位或免疫原。在一个实施方式中，载体含和表达多核苷酸，其在药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质中包括编码(及有利地表达)流感抗原、表位或免疫原的多核苷酸， 或基本上尤其构成或由其构成。由此，根据本发明的实施方式，制剂中的其他载体包括如下多核苷酸，或基本上由其构成或由其构成，所述多核苷酸编码、及在适当的环境下，载体表达一种或多种流感多肽、抗原、表位或免疫原(例如、血凝素、神经氨酸酶、核蛋白)或其片段的其他蛋白。根据另一实施方式，制剂中的载体包括编码流感多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种蛋白或其片段的多核苷酸，表达多核苷酸的载体，或基本上由其构成或由其构成。 在另一实施方式中，制剂包括1、2或更多种包括编码和有利地体内表达流感多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸的载体。发明也针对包括编码和表达来自除了禽物种(包括鸡、鸭、火鸡、鹌鹑及鹅)之外的不同的物种(例如但不限于人、马、猪、狗、猫)的不同的流感多肽、抗原、表位或免疫原、例如、流感多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的载体混合
13物。根据本发明的再一实施方式，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，尤其是体内表达载体。在特定的、非-限制实施例中，可利用PVR1020或1012质粒(VICAL Inc. ；Luke 等人，1997 ；Hartikka 等人，1996，见，例如，U. S.专利 No. 5，846，946 和 6，451，769)作为用于插入多核苷酸序列的载体。PVR1020质粒源于pVR1012和含人tPA信号序列。在一个实施方式中，人tPA信号包括在Genbank中以登录号HUMTPA14的氨基酸M(I) 氨基酸S (23)。 在另一特定的，非-限制实施例中，用作用于插入多核苷酸序列的载体的质粒可含Genbank 中以登录号U28070的氨基酸"24) 氨基酸M48)的马IGFl的信号肽序列。可在实践中咨询或采用的DNA质粒的额外的信息见于，例如，U. S.专利No. 6，852，705 ；6, 818，628 ； 6，586，412 ；6，576，243 ；6，558，674 ；6，464，984 ；6，451，770 ；6，376，473 和 6，221，362。术语质粒覆盖包括根据本发明的多核苷酸和对于其在期望的宿主或靶细胞中体内表达必需的元件的任何DNA转录单元；及、对此、需知，超螺旋的或非-超螺旋的，环状质粒，以及线性形式，期望在本发明范围之内。各质粒包括或含编码流感抗原、表位或免疫原的多核苷酸或基本上由其构成、除了编码流感抗原、表位或免疫原的多核苷酸之外、任选与异源肽序列、变体、类似物或片段融合、可操作连接到启动子或在启动子控制下或依赖于启动子。通常而言，采用在真核细胞中有功能的强启动子有利。强启动子可为但不限于人或鼠来源(或任选具有另一来源 (例如大鼠或豚鼠))的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，超级启动子(Ni,M. et al., Plant J. 7，661-676，1995)。CMV-IE启动子可包括实际启动子部分，其可或可不与增强子部分相联。参考文献见 EP-A-260148, EP-A-323597，U. S。专利 No. 5，168，062、5，385，839 和 4，968，615，也至于 PCT 申请 No W087/03905。CMV-IE 启动子有利地为人 CMV-IE(Boshart 等人，1985)或鼠 CMV-IE。更通常而言，启动子是病毒、植物或细胞来源的。可用于本发明的实践的非CMV-IE 的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可用于本发明的实践的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，例如，结蛋白启动子(Kwissa等人、 2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人，1989)。可使用任何组成性、可调节的或刺激-依赖性启动子。例如，组成性启动子可包括来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶启动子。或者，使用热休克基因启动子、旱-诱导性基因启动子、病原体-诱导性基因启动子、创伤-诱导性基因启动子及光照/暗-诱导性基因启动子是可为有利的。其可对于使用由植物生长调节剂、例如脱落酸、茁长素、细胞分裂素及赤霉酸控制的启动子有用。可也选择给出组织-特异性表达的启动子(例如、根、叶和花-特异性启动子)。质粒可包括其他表达控制元件。其对于合并稳定序列，例如，内含子序列， 例如，玉米醇脱氢酶内含子(玉米ADHI内含子)，hCMV-IE的第一内含子(PCT申请 NO.TO1989/01036)，兔β -珠蛋白基因的内含子II (van Ooyen等人，1979)尤其有利。在另一实施方式中，质粒可包括3’UTR。3’UTR可为但不限于土壤杆菌胆脂碱合酶(Nos)3’UTR。至于用于质粒和非痘病毒的病毒载体的多聚腺苷酸化信号(多聚A)，更可使用牛生长激素(bGH)基因的聚(A)信号(见U. S. 5，122，458)、或兔β-珠蛋白基因的聚(A)信号或SV40病毒的聚(A)信号。
“宿主细胞”表示已通过施用外源多核苷酸、例如重组质粒或载体经遗传改变的、 或能遗传改变的原核生物或真核细胞。当说道遗传改变的细胞时，术语是指原本改变的细胞及其后代。在一个实施方式中，在转基因浮萍植物中表达重组流感抗原。在另一实施方式中， 转基因植物是浮萍植物。再一实施方式中，转基因植物是浮萍(Lemna minor) 0再一实施方式中，重组流感抗原可在浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统，Biolex' s LEX system5" 中表达。浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统的细节可见于例如，U. S专利No6，815，184 ； 7，022，309 ；7，160，717 ；7，176，024,6, 040，498,7, 161，064和 7，326，38 ；将其公开内容通过引用整体并入本文。流感抗原在一实施方式中可为本文中公开的任何多肽，或由本文中公开的任何多核苷酸编码的多肽。在浮萍中表达抗原性流感多肽的方法由此，在本发明的一些实施方式中，流感多肽、或其片段或变体，在浮萍中表达。这些方法包括使用本领域已知的任何适宜转化方法导入浮萍植物的表达盒的使用。这些表达盒之内的多核苷酸可如下修饰用于抗原性流感多肽、或其片段或变体，在浮萍中增强的表达。用于抗原性流感多肽的浮萍表达的盒表达流感多肽、或其片段或变体的转基因浮萍通过用包括编码流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的表达盒转化浮萍得到。以此方式，将编码目的流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸构建入表达盒及通过本领域已知的任何适宜转化方法导入浮萍植物。在一些实施方式中，用包括编码目的流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的表达盒转化的浮萍植物也用提供用于另一目的异源多肽、例如、另一流感多肽、片段或其变体的表达的表达盒转化。提供用于另一目的异源多肽的表达的表达盒可提供于用于在相同的时间或在不同的时间，通过相同的或通过不同的导入方法、例如、通过相同的或不同的转化方法导入浮萍植物的相同的多核苷酸(例如，于相同的转化载体)，或提供于用于在相同的时间或在不同的时间，通过相同的或通过不同的导入方法，例如，通过相同的或不同的转化方法导入浮萍植物的不同的多核苷酸(例如，于不同的转化载体)。用于转化浮萍的表达盒包括可操作连接到目的多核苷酸(即、编码抗原性流感多肽、其片段或变体的多核苷酸)的至少包括转录起始区(例如，启动子)的表达控制元件。 本文参照核苷酸序列所用的“可操作连接的”指以功能关系彼此放置的多种核苷酸序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，且如果需要，在阅读框中接合2个蛋白编码区。所述表达盒提供有多个限制位点用于插入目的多核苷酸(例如、1种目的多核苷酸、2种目的多核苷酸、等)在启动子和其他表达控制元件的转录调节下。在本发明的特别的实施方式中， 待转移的多核苷酸含2或多个表达盒，每各含至少一种目的多核苷酸。说道“表达控制元件”期望是DNA的调控区，通常包括TATA盒，能引导RNA聚合酶 II (或在一些实施方式中是RNA聚合酶III)在用于特定编码序列的适当的转录起始位点起始RNA合成。表达控制元件可附加地包括通常定位在TATA盒的上游或5'的其他识别序列，其影响(例如，增强)转录起始速度。此外，表达控制元件可附加地包括通常定位在 TATA盒的下游或3'的序列，其影响(例如，增强)转录起始速度。转录起始区(例如、启动子)可为天然的或对于浮萍宿主是同源或外源或异源的、或可为天然的序列或合成的序列。说道外源，期望转录起始区不见于待导入转录起始区的野生型浮萍宿主。说道“有功能的启动子”，期望是启动子，当可操作连接到编码目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的序列时，能驱动编码的多肽、片段或变体的表达(即、转录和翻译)。启动子可基于期望的结果选择。由此，本发明的表达盒可包括组成性、诱导性、组织-优选的或其他用于在浮萍中表达的启动子。可在根据本发明的表达盒中采用任何本领域已知的适宜启动子，包括细菌、酵母、 真菌、昆虫、哺乳动物和植物启动子。例如，可使用植物启动子，包括浮萍启动子。例示启动子包括、但不限于花椰菜花叶病毒35S启动子、冠瘿碱合成酶启动子(例如、n0S、maS、0CS、 等)、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸(RubP)羧基化酶小亚基启动子及醇脱氢酶启动子。本领域已知浮萍RubP羧基化酶小亚基启动子(Silverthorne et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15 :49)。其他来自感染植物(优选浮萍)的病毒的启动子，也适宜包括但不限于分离自芋花叶病毒，小球藻病毒(例如，小球藻病毒腺飘零甲基转移酶启动子； Mitra et al. (1994)Plant Mol. Biol. 26 :85)、番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、烟草坏死病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、黄瓜花叶病毒、花生残肢病毒、紫花苜蓿花叶病毒、甘蔗杆状DNA病毒等的启动子。可选择表达控制元件，包括启动子来给出期望的调节水平。例如，在一些实例中， 使用赋予组成性表达的启动子(例如来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶启动子)可有利。或者，在其他情况中，使用响应特异性环境刺激活化的启动子 (例如，热休克基因启动子、旱-诱导性基因启动子、病原体-诱导性基因启动子、创伤-诱导性基因启动子、及光照/暗-诱导性基因启动子)或响应植物生长调节剂活化的启动子 (例如，来自基因诱导的通过脱落酸、茁长素、细胞分裂素及赤霉酸的启动子)可有利。作为替代，可选择给出组织-特异性表达的启动子(例如、根、叶和花-特异性启动子)。给定启动子的总体强度可受到顺式-作用核苷酸序列(例如上游活化序列)的组合和空间组织的影响。例如，源于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)章鱼碱合酶基因的活化核苷酸序列可增强来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶启动子的转录(见U. S.专利5，955，646，Gelvin等人)。在本发明中，表达盒可含插入启动子序列的上游来增强目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的表达的活化核苷酸序列。在一个实施方式中，表达盒包括源于可操作连接到源于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶基因的启动子的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 章鱼碱合酶基因的3个上游活化序列(见U. S专利5，955，646，通过引用并入本文)。表达盒由此以5' -3'转录方向包括包括转录和翻译起始区的表达控制元件、 编码目的抗原性流感多肽(或其片段或变体)的多核苷酸、及在植物中有功能的转录和翻译终止区。可根据本发明使用本领域已知的任何适宜终止序列。终止区可与转录起始区相同来源、可与目的编码序列相同来源或可源于另一来源。方便的终止区从根瘤土壤杆菌(A. tumefaciens)的Ti-质粒可用，例如章鱼碱合成酶及胆脂碱合成酶终止区。也见 Guerineau et al. (1991)Mol. Gen. Genet. 262 141 ；Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5 141 ；Mogen et al. (1990)Plant Cell 2:1261; Munroe et al. (1990)Gene91 :151 ；Ballas et al. (1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891 ；及 Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15 :9627。额外的例示终止序列是豌豆 RubP 羧基化酶小亚基终止序列和花椰菜花叶病毒35S终止序列。通常，表达盒将包括用于选择转化的浮萍细胞或组织的可选择的标记基因。可选择的标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码不敏感于除草剂的修饰的靶蛋白或编码其可发挥作用之前在植物中降解或脱毒除草剂的酶。见 DeBlock et al. (1987)EMBO J. 6 2513 ；DeBlock et al. (1989)Plant Physiol. 91:691 ；Fromm et al. (1990)BioTechnology8 :833 ；Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603。例如，对glyphosphate或磺酰脲除草剂的抗性已使用编码突变体靶酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPQ及乙酰乳酸合酶(ALQ的基因得到。对草铵膦铵、溴苯腈和2，4-二氯苯氧基乙酸Q，4-D)的抗性已通过使用编码脱毒相应除草剂的膦丝菌素乙酰基转移酶、腈水解酶或2，4_ 二氯苯氧基乙酸单氧合酶的细菌基因得到。为本发明的目的，可选择的标记基因包括，但不限于，编码下列的基因新霉素磷酸转移酶 II(Fraley et al. (1986)CRC Critical Reviews in Plant Science 4 :1)；氰酰胺水合酶(Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :4250)；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶(Perl et al. (1993) BioTechnology 11 :715)；条基因(Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100 1503 ；Meagher et al. (1996) Crop Sci. 36 :1367)；色氨酸脱羧酶(Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22 :907)；新霉素磷酸转移酶(NE O ； Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1 :327)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG ;Shimizu et al. (1986)Mol. Cell. Biol. 6 :1074) ；二氢叶酸还原酶(DHFR;Kwok 等人(1986)Proc. natl. acad. sci.美国 83 :4552)；膦丝菌素乙酰基转移酶(DeBlock 等人(1987)EMBO J. 6 2513) ；2，2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D 330)；乙酰羟酸合酶(U. S. pat. No. 4，761，373，Anderson 等人；Haughn 等人(1988)Mol. gen. Genet. 221 :266) ；5-烯醇丙酮酰基-莽草酸-磷酸合酶(aroA ；Comai et al. (1985) Nature 317 :741)；卤芳基腈水解酶(WO 87/04181，Stalker等人)；乙酰基-辅酶A羧基化酶(Parker et al. (1990)Plant Physiol. 92 1220) ；二氢蝶酸合酶(sull ；Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15 127)；及 32kDa 光系统 II 多肽(psbA ;Hirschberg 等人 (1983) Science 222:1346(1983))。也包括编码对下列抗性的基因庆大霉素(例如，aacCl，Wohlleben et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217 :202-208)；氯霉素(Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2 :987)； 甲氨喋呤(Herrera-Estrella et al. (1983)Nature 303:209 ；Meijer et al. (1991)Plant Mol. Biol. 16 807)；潮霉素(ffaldron et al. (1985)Plant Mol. Biol. 5 103 ；Zhijian et al. (1995)Plant Science 108 219 ；Meijer et al. (1991)Plant Mol.Bio. 16 :807)；链霉素(Jones et al. (1987)Mol. Gen. Genet. 210 :86)；大观霉素(Bretagne-Sagnard et al. (1996)Transgenic Res. 5 :131)；博来霉素(Hille et al. (1986)Plant Mol. Biol. 7 171)；磺酰胺(Guerineau et al. (1990)Plant Mol. Bio. 15 :127)；溴苯腈(Stalker et al. (1988)Science 242 419) ；2,4-D (Streber et al. (1989)BioTechnology 7 811)； JH丝胃素(DeBlock et al. (1987)EMBO J. 6 2513) ；大观霉素(Bretagne-Sagnard and Chupeau, Transgenic Research 5:131)。条基因赋予对草铵膦-类型除草剂(例如膦丝菌素(PPT)或双丙氨膦等)的除草剂抗性。如上所述，其他可在载体构建体中使用的可选择的标记物包括，但不限于pat 基因、也用于双丙氨膦及膦丝菌素抗性、用于咪唑啉酮抗性的ALS基因、用于潮霉素抗性的HPH或HYG基因、用于草甘膦抗性的EPSP合酶基因、用于对Hc-毒素的抗性的Hml基因、及本领域技术人员常规使用的和已知的其他选择性试剂。见Yarranton(1992)Curr. Opin. Biotech. 3 :506 ；Chistopherson et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :6314 ； Yao et al. (1992)Cell71 63 ；Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6 2419 ；Barkley et al. (1980)The Operon 177-220 ；Hu et al. (1987)Cell 48 555 ；Brown et al. (1987) Cell 49 603 ；Figge et al. (1988)Cell 52 713 ；Deuschle et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 5400 ；Fuerst et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2549 ； Deuschle et al. (1990)Science 248 480 ；Labow et al. (1990)Mol.Cell.Biol.10 3343 ；Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :3952 ；Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :5072 ；Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19 :4647 ； Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol. And Struc.Biol. 10 143 ；Degenkolb et al. (1991)Antimicrob.Agents Chemother.35 :1591 ；Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27 :1094 ；Gatz et al. (1992)Plant J. 2 397 ；Gossen et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :5547 ；Oliva et al. (1992)Antimicrob. Agents Chemother. 36 913 ；Hlavka etal. (1985)Handbook of Experimental Pharmacology 78 ；and Gill et al. (1988)Nature 334:721。所述公开内容通过引用并入本文。以上可选择的标记基因的列表不是有限的。任何可选择的标记基因可在本发明中使用。用于在植物宿主中增强的表达的核苷酸序列的修饰当抗原性流感多肽或其片段或变体在浮萍中表达时，可修饰表达的编码流感多肽或其片段或变体的多核苷酸序列来增强其在浮萍中的表达。一种所述修饰是使用植物-优选的密码子(尤其浮萍-优选的密码子)的多核苷酸的合成。本领域中可用对于合成有植物-优选的密码子的核苷酸序列的方法。见，例如，U. S. Patent Nos. 5, 380, 831 and 5,436, 391 ；EP O 359 472 ；EP O 385 962 ；WO 91/16432 ；Perlak et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15 3324 ；Iannacome et al. (1997)Plant Mol. Biol. 34 485 ；and Murray et al. (1989)Nucleic Acids. Res. 17 :477，通过引用并入本文。合成可使用任何本领域技术人员已知的方法实现。优选的密码子可由浮萍中表达的蛋白中最高频度的密码子确定。例如，浮萍(Lemna minor)的密码子利用的频度见于下表。浮萍(Lemna minor) [gbpln] :4CDS' s(1597 个密码子)
权利要求
1.组合物，其包括禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。
2.权利要求1的组合物，其中所述禽流感抗原包含包括至少15个氨基酸的禽流感多肽的免疫原性片段。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述禽流感抗原在浮萍中表达。
4.权利要求1 3中任一项的组合物，其中所述禽流感抗原经部分纯化。
5.权利要求1 3中任一项的组合物，其中所述禽流感抗原基本上纯化。
6.权利要求1 5中任一项的组合物，其中所述禽流感抗原是禽H5W多肽。
7.权利要求6的组合物，其中所述H5W多肽是血凝素多肽。
8.权利要求1 7中任一项的组合物，其中所述禽流感抗原与如SEQID NO :2、4、5、8、 10、12或14所示的序列具有至少80%序列同一性。
9.权利要求1 8中任一项的组合物，其中所述禽流感抗原由与如SEQID N0:l、3、6、 7、9、11或13所示的序列具有至少70%序列同一性的多核苷酸编码。
10.权利要求1 9中任一项的组合物，其中所述药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质是油包水乳液或水包油乳液。
11.给易患禽流感的动物疫苗接种的方法，包括施用至少一次权利要求1 10中任一项的组合物。
12.权利要求11的方法，其中所述方法包括始施-加施施用方案。
13.权利要求12的方法，其中所述始施-加施方案包括始施权利要求1 10中任一项的组合物，以及加施在药学或兽医学可接受的媒质或赋形剂中包括含用于体内表达禽流感抗原、其变体、其片段的多核苷酸的重组病毒载体的组合物，以保护受试者免于流感和/或在感染的受试者中阻止疾病进展。
14.权利要求12的方法，其中所述始施-加施方案包括始施在药学或兽医学可接受的媒质、稀释剂或赋形剂中包括含用于体内表达禽流感抗原、禽流感多肽的变体或片段及其混合物的多核苷酸的重组病毒载体的组合物，以及加施权利要求1 10中任一项的组合物，以保护受试者免于流感和/或在感染的受试者中阻止疾病进展。
15.权利要求12的方法，其中所述始施-加施方案包括始施权利要求1 10中任一项的组合物，以及加施包括禽流感抗原的灭活的病毒组合物或疫苗。
16.权利要求12的方法，其中所述始施-加施方案包括始施包括禽流感抗原的灭活的病毒组合物或疫苗，以及加施权利要求1 10中任一项的组合物，以保护受试者免于流感和/或在感染的受试者中阻止疾病进展。
17.权利要求11 16中任一项的方法，其中所述动物是禽、马、狗、猫或猪。
18.在浮萍中表达的基本上纯化的禽流感抗原，其中所述多肽包括与具有如SEQID NO :2、4、5、8、10、12或14所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
19.诊断动物中的流感感染的方法，包括(a)使包括核蛋白(NP)的固体基材与从动物得到的样品接触；(b)使固体基材与针对NP的单克隆抗体(MAb)接触；以及(c)检测固体基材上MAb与被NP捕获的样品的结合。
20.用于始施-加施疫苗接种的试剂盒，包括至少2个瓶，其中第一瓶含权利要求1 10中任一项的组合物，且第二瓶含用于加施-疫苗接种的组合物，其包含 包括重组病毒载体的组合物、或包括灭活的病毒组合物的组合物。
全文摘要
本发明含盖流感疫苗，尤其是禽流感疫苗。疫苗可为基于流感血凝素的亚单位疫苗。血凝素可在包括浮萍的植物中表达。发明也含盖编码和表达可用于保护动物免于流感的流感抗原、表位或免疫原的重组载体。其也含盖与DIVA策略兼容的疫苗接种方案，包括使用载体和亚单位疫苗的始施-加施方案。
文档编号A61K39/00GK102271704SQ200980153444
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月30日 优先权日2008年11月28日
发明者J·A·普里查德, L·F·迪基, M·巴布洛特, 郭璇 申请人:梅里亚有限公司, 比洛克西治疗公司