专利名称：促进无血管组织修复的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明提供用于促进受损的无血管部位，例如椎间盘修复的组合物和方法；更具体地说，本发明提供在有需要的患者中的无血管部位内或邻近无血管部位的优化位置上施用环境调节的自体同源的干细胞。
背景技术：
无血管过渡区和其它难以修复部位存在于身体的多种关键组织中。存在这些区， 此处通向组织，例如椎间盘的血供受限或缺乏，或此处对组织的损伤已经引起阻碍修复过程的苛刻环境。例如，当无血管组织受损时，通向组织的血供缺乏或限制对修复过程造成的明显的障碍。此在椎间盘、膝盖和髋部尤其是如此，那里正常的负荷组织使得难以促进修复和愈合。身体中一个特别重要的无血管过渡区存在于椎间盘中，此处无直接血供。通向椎间盘的营养物典型地经由软骨下骨的小毛细血管床到达，随着时间过去扩散至整个盘。此外，椎间盘经由浸渗接受营养物，换言之，在轴向荷载活动，诸如行走、跑步等过程中通过从周围组织吸收营养物。椎间盘是使脊椎的任何两节椎骨彼此分离的防振垫(shock absorbing pads)。这些盘基本上向脊椎提供三种功能，首先它们在处于直立体位时对携带身体的轴向负荷起冲撞吸收器的作用，第二它们起韧带的作用而使任何两节相邻的椎骨保持在一起，和第三它们起促进脊椎弯曲和旋转的枢轴点的作用。人类在他们的脊椎中有23块盘，即6块在颈区、12块在胸区和5块在腰区。每一块盘均由髓核、纤维环和椎体终板组成。髓核是富含水和凝胶状的且构成盘的中央区域。纤维环在性质上为纤维的，由胶原质形成并包括少量的水(与髓核比较)且环绕在髓核周围。 一系列薄片排列在纤维环中以包含受压的髓核。此外，椎体终板起使每块盘贴近椎体的作用。如以上讨论的，已经证明由于盘的苛刻环境方面(无血管、高压、不利的PH等)和修复过程中置于盘上的艰难的机械需求(与双足(bipedal)行动关联的应力和应变)，在受损盘中，组织修复和再生是困难的。利用干细胞技术的常规修复方法已经集中于典型地在存在载体材料下直接将干细胞(典型地获自预先存在的非-自体同源的细胞系)植入髓核。虽然这些方法在动物模型中已经提供某些有希望的结果，然而这些修复在患有椎间盘变性疾病(DDD)或其它相似的病症的人中已经得到证明。由于用于动物研究的椎间盘变性模型的急性性质，在这些动物模型中的有希望的结果是可能的。例如，在这些动物模型中的椎间盘是新近退变的，具有比在人中长期站立的退行性盘较好的血供。此外，用于这些模型中的动物一般是四足站立的(quadrapedal)，而人类是双足站立的，并且这样负荷盘有差异。最后，用于这些DDD模型中的动物趋于年轻和健康，等同于比通常临床所见的DDD群体 (cohort)轻得多的患者的年龄。因此，一般来说，常规的方法基于在受损盘环境中的修复和再生可能非常不同于在需要干细胞疗法的病人中发现的那些。在椎间盘中的组织修复和再生相关的问题在髋、膝和肩部(包括肩回旋肌群(rotator cuff))中也是很普遍的。在这些组织中的每一个中，苛刻的环境方面常常因损伤或老化确定，在那里无血管过渡区和艰难的机械需求合并以确立低干细胞修复成功的方案。本发明旨在克服以上讨论的一个或多个问题。实施方案的简述本发明提供用于修复具有一个或多个不良营养区或恶劣的环境，即无血管区的受损组织的组合物和方法。不良营养区或恶劣的环境典型地位于血管血供受限或缺乏的组织，即本文称为的无血管过渡区或无血管区。就此而论，区或环境包括椎间盘、髋关节(臼盂缘(Iabrum))、肩关节(包括肩回旋肌群)和其它相似的部位。本文的实施方案包括干细胞的获取，例如从需要修复的患者的无血管区获取间充质干细胞。然后在体外，在使得用于修复患者的无血管区的细胞能力最优化的环境中调理获取的细胞。当存在足够量的优化的、经调理的细胞时，将细胞放置于需要修复的无血管区的靶部位。在某些实施方案中，联合放置血小板或血小板溶解产物(典型地自体同源的)和/或补充治疗剂与调理细胞，以提高通向所述部位的血流/营养物流。使血小板和/或补充治疗剂典型地仅定时于放置调理细胞之前不久、期间或之后即刻，尽管也期望采用其它定时方案。可重复这些程序以确保部位的修复，包括重复仅调理的细胞放置或血小板/血小板溶解产物/补充治疗剂。在一个实施方案中，提供用于在有需要的患者中修复受损椎间盘的组合物和方法。在一个方面，提供用于在使细胞能力优化以用于修复和/或再生受损盘的条件下获取和培养干细胞的方法。在另一个方面，提供用于在受损盘的靶向部位放置这些调理的干细胞以优化受损盘组织的生长和再生的方法。在还有的另一个方面，提供用于在患者中的靶向部位放置调理的干细胞和采用硬膜外补充治疗以提高通向受损盘的血流和通过受损盘的联合治疗患者的方法。此外，本发明提供用于专注于选择能修复和/或再生受损盘的的细胞的干细胞培养的改良的组合物。本发明的方法和组合物，单独和/或联合使用，提供在盘修复和再生领域中令人惊讶的和意想不到的优点(如与其它常规技术相比)。在另一个实施方案中，自需要盘修复的患者中收获干细胞(例如，间充质干细胞)，和在基于选择和扩增细胞的条件下培养细胞，以使其能够抵抗不良营养环境、其它恶劣环境(例如PH值不在正常地与促进健康细胞生长协调的范围的环境)、低氧环境和 /或表现提高受损盘内二氧化碳水平的环境。然后将这些调理的细胞植入纤维盘后环面 (posterior disc annulus)(如与典型地要求植入髓核的常规的方法比较)。在某些情况下，则用硬膜外补充剂(生长因子、细胞因子、整联蛋白、钙粘着蛋白等)治疗患者以促进血流至盘后环面。该实施方案的每一方面增加和选择干细胞在受损盘环境中的生存能力和扩增能力以及改善盘环境以给植入的细胞提供提高的营养和氧。此外，可单独或与选择的干细胞联合给予自体同源的血小板或血小板溶解产物组合物，以促进受损盘中的干细胞生存能力和扩增能力。单个或联合本文的方法改善修复过程和自体同源的干细胞基盘修复的结果。在某些情况下，在1-10%氧气下且更典型地在3至7%氧气下体外培养自需要盘修复的患者收获的干细胞1至观天。此可表现大约1/3至全部时间，在植入患者内之前培养细胞。选择幸存/生存的细胞，即可在低氧条件下生长的细胞用于在这些低氧条件下生存和扩增以获取足够的细胞来植入受损盘。选择的细胞已经提高受损盘在氧缺乏环境中幸存、扩增和最终修复的能力。在其它的情况下，在升高的二氧化碳且更典型地在2至10%二氧化碳下体外培养自需要盘修复的患者收获的干细胞为期从1至观天。此可表现大约1/3至全部时间，在植入患者之前培养细胞。选择幸存/生存细胞，即能够在升高的二氧化碳条件下生长的细胞， 用于在这些条件下生存和扩增以获取足够细胞来植入受损盘内。选择的细胞已经提高在受损盘的环境的更高的二氧化碳条件中幸存、扩增和修复的能力。可将该相同的方法用于选择用于修复/再生受损(通过损伤或老化)的髋和/或肩部无血管部位的干细胞。在其它的情况下，在低氧性和升高的二氧化碳两者皆有的条件下体外培养自需要盘修复的患者收获的干细胞。可维持体外培养条件为期最多至1/3至细胞的全部培养时间。选择的细胞已经提高在典型地在受损椎间盘中发现的较低的氧和较高的二氧化碳条件下幸存、扩增和修复的能力。可将该相同的方法用于选择用于修复/再生受损(通过损伤或老化)的髋和/或肩部无血管部位的干细胞。在另外的其它情况下，在营养差的条件下培养自需要盘修复的患者收获的干细胞，以选择生存能力并在这些差营养环境下扩增。培养条件包括使用由补充了糖、氨基酸、脂质、矿物质、蛋白质或旨在促进干细胞生长的其它物质Dulbecco’ s改良基本培养基 (Dulbecco's Modified Essential Medium) (DMEM)(或其它相似的基础培养基)制备的基础细胞培养基。生长培养基可或可不含血清，诸如胎牛血清、人全血清、富含血小板血浆、血小板溶解产物等。然而，这些制备物明确设计为以模拟人退变盘的局部环境，诸如缺氧、改变的PH或某些有限的营养可用性。可将该相同的方法用于选择用于修复/再生受损(通过损伤或老化)的髋(例如在白盂缘中)和/或肩部无血管部位的干细胞。可将其它选择条件用于扩增收获的干细胞，所述条件包括pH、用后培养基(spent media)的应用、与髓核细胞的共同-培养，其中靶部位在受损盘中(因此提供自接近用于递送培养的细胞的最终靶部位呈现的环境因子)等。还须注意的是，在某些情况下，可将本文描述的两个或更多个选择条件用于鉴别和扩增干细胞以用于无血管部位修复。所以，例如，可将不良营养培养基和低氧条件用于选择用于第一个患者的干细胞，而可将PH和二氧化碳条件用于在第二个患者中选择。此可基于实际检测任何给定的患者中的局部微环境而定。在另外的其它情况下，获取(收获)自具有损伤部位的相同患者的血小板，并用凝血酶和氯化钙(CaCl2)处理。将处理后的血小板与培养的和选择的干细胞合并，用于植入受损部位中。注意到，血小板的处理可在植入受损部位前从一天扩展至七天且特别地从5至 7天。再有，可在植入选择的干细胞之前不久、期间或之后即刻植入血小板。这样的预调理的血小板能够释放靶向生长因子至无血管区环境，该环境在受损部位中促进干细胞幸存和扩增是有用的。作为备选，或联合生长因子、细胞因子、整联蛋白等一起，可将选择的干细胞直接给予受损部位。在一个实施方案中，在例如，受损盘的外周，诸如置入硬膜外间隙中给予这些生长因子。本发明的这些和多种其它特征和优点将通过阅读下列详细的说明书和检阅所附的权利要求书而变得显而易见。图的简述
图1是轴向腰椎视图，具有采用本文描述的实施方案将干细胞针刺放置进盘后环面的血管和过渡血管区的叠加通路。图2显示依据本文提供的技术生长在单层培养基中的MSCs。图3是注射MSCs和血小板衍生的VEGF上清液进入L5-S1盘(受试者ML)的盘后环面的局部示例性荧光镜透视图像。注意盘后环面中的造影剂的浓度(用蓝色加强的造影流(contrast flow))。图4证明在干细胞移植后实施的、采用血小板衍生的VEGF上清液注射达到的示例性硬膜外流(epidural flow)。图5提供在操作前不到1个月拍摄的ML短Tau反转恢复(Short Tau Inversion Recovery(STIR))图像。选择该矢状切片(sagittal slice)，因为其表示内含性L5-S1盘挤出的最大程度。ET = 6，TR = 4816. 7，TE = 48. 1，该天的成像时间为l:01p.m。该图像证明在L5-S1有0. 7cm的盘挤出。在中心盘检测的L5-S1盘的高度为0. 5cm,而L4-L5检测为 0. 7cm。图6提供采用相同的SIlR参数操作后1个月的ML匹配矢状切片。ET = 6, TR = 4816.7，TE = 48.1。该天的成像时间是11:01a. m。该图像证明在L5-S1有0. 3cm的盘挤出。注意在L5-S1的盘高度为0. 5cm和在L4-L5为0. 7cm。图7提供采用相同的SIlR参数操作后5个月的ML匹配矢状切片。ET = 6, TR = 4816.7，TE = 48.3。该天的成像时间是10 23a. m。该图像证明在L5-S1有0. 3cm的盘挤出。注意盘高度在L5-S1为0. 5cm和在L4-L5为0. 7cm。图8提供在操作前通过内含性L4-L5盘挤出的最大程度的MJM矢状切片。在 12:15pm 拍摄图像。ET = 6，TR = 4816. 7，TE = 48. 1。在 6mm 检测到 L4-L5 盘挤出。在该切片上的盘的中间部分检测的盘高度是L4-L5 = 8mm, L5-S1 = 7mm, S1-S2 = 5mm。图9提供用相同的成像参数在操作后2个月的MJM匹配矢状SIlR切片。ET = 6， TR = 4816. 7，TE = 48. 1。在12:35pm拍摄图像。在3mm检测到L4-L5盘挤出。检测到的盘高度与操作前相同L4-L5 = 8mm, L5-S1 = 7mm, S1-S2 = 5mm。图10提供在操作后4. 5个月的MJM。此为用相同的成像参数的匹配的矢状SIlR 切片。ET = 6，TR = 4833. 3，TE = 48. 2。在 12:27pm 取得图像。在 3mm 检测到 L4-L5 盘挤出。检测到的盘高度与进行方法前相同:L4-L5 = 8mm, L5-S1 = 7mm, S1-S2 = 5mm。图11提供在操作前通过L5-S1盘突出的最大程度的HO矢状SIlR切片。ET = 6， TR = 4816. 7，TE = 48. 3。该天的成像时间是11 ^a. m。在9mm检测到L5-S1盘突出。检测到的盘高度L4-L5 = 6謹，L5-S1 = 8謹。图12提供在操作后6周HO的矢状匹配的SIlR切片。成像参数在ET = 6，TR = 4816. 7，TE = 48. 3保持常数。该天的成像时间是11:25a. m。在8mm检测到L5-S1盘突出。 检测到的盘高度:L4-L5 = 6mm, L5-S1 = 8mm。图13提供在操作后3. 5个月HO的匹配矢状SIlR切片。成像参数在ET = 6，TR =4816. 7，TE = 48. 3保持常数。该天的成像时间是1 IOp. m。在9mm检测到L5-S1盘突出。检测到的盘高度:L4-L5 = 6mm, L5-S1 = 8mm。图14显示在HO中的造影流(用蓝色加强的)，为比盘后环面的预定目标更典型的 nucleogram0发明详述
本发明提供用于修复具有一个或多个不良营养区或恶劣的环境，即无血管区的受损组织的组合物和方法。不良营养区或恶劣的环境典型地位于血管供血受限或缺乏的组织，即本文称为无血管过渡区的部位。就此而论，所述区或环境包括椎间盘、髋、肩(包括肩回旋肌群)和其它相似的部位。本文的实施方案包括干细胞的获取，例如从需要修复的患者的无血管区间获取间充质干细胞。然后在体外，在使得用于患者的无血管区的修复的细胞能力最优化的环境中调理获取的细胞。当存在足够量的优化的、经调理的细胞时，将细胞放置于需要修复的无血管区的靶部位。在某些实施方案中，将联合放置补充治疗剂与调理细胞，以提高通向所述部位的血流/营养物流。使补充治疗剂典型地仅定时于放置调理细胞之前不仅、期间或之后即刻，尽管也预期采用其它定时方案。可重复该方法以确保部位的修复，包括重复仅调理的细胞放置或补充治疗剂。用于干细胞选择的无血管区条件在本文一般包括1-10%氧、2-10%二氧化碳、改变的PH、改变的营养物和类似条件的组合。可与补充剂，如生长因子、细胞因子、整联蛋白、 钙粘着蛋白等联合，和/或与经处理的自体同源血小板联合，将选择的细胞放置于修复部位。定义提供以下定义以促进理解本文频繁使用的某些术语而并不意味着限制本公开的范围。本文使用的“干细胞”指的是具有自我更新和潜力特性的细胞。就间充质干细胞而言，这些细胞是多能的并且具有分化为造骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和其它相似的细胞的能力。如本文使用的盘凸出(Disc Bulge)指的是髓核突出进入盘的纤维环。如本文使用的椎间盘突出症(Disc Hernation)指的是髓核的挤出超出纤维环的边界。如本文使用的内含性椎间盘脱出(Contained disc herniation)指的是髓核的挤出超出纤维环的边界并且仍然被后纵韧带所限制。如本文使用的“患者”指的是具有一个或多个受损的或老化的无血管部位，例如受损椎间盘的哺乳动物，且更典型地是指人。就受损盘而言，损伤可包括脱出的盘 (herniated disc)、凸出的盘(bulging disc)、断裂的盘、盘突出、盘挤出、盘隔离(disc sequestration)和其它类似的椎间盘疾病。“血小板和血小板溶解产物”在本文可交替使用且包括包含在血小板内的、通过血小板的裂解已经释放的天然生长因子的组合。此可通过化学手段(即CaCl2)、渗透手段(采用蒸馏水)或通过冻/融过程实现。本发明的血小板溶解产物也可来源于全血并可如在美国专利号5，198，357 (其通过引用结合于本文)中描述那样制备。“修复”或“再生”在本文可交替使用且指部分或完全替换在靶标无血管区或邻近无血管区的区中受损的区域。例如，椎间盘的修复包括部分或完全修复或替换盘中的组织。 修复或再生也可指在正常老年患者中的无血管区的修复或再生，即修复由老化诱导的区的损伤。如本文使用的“环境”指的是在体外或体内作用或影响细胞的全部调整条件 (entire set of conditions)0
如本文使用的“缺氧(Hypoxia)或低氧性(pypoxic) ”指的是环境中具有10%或更少的氧的体外或体内条件。“补充剂”或补充治疗剂包括生长因子、细胞因子、整联蛋白，包括VEGF_A、PIGF, VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D, FGF、Angl、Ang2、MCP-I 内皮糖蛋白、TGF- β、CCL2、VE-钙粘着蛋白等。依据本发明的实施方案包括用于受损的无血管区，如椎间盘的修复和再生的方法和组合物。本文的实施方案的根据是基于意想不到的发现在不良营养和低氧条件下，自体同源干细胞的收获和扩增提供了用于修复无血管区的更有能力的细胞。再有，与自体同源的血小板一起植入调理细胞，以及促进血流至受损部位，获得引人注目的改善的修复。植入也可包括一个或多个补充治疗剂(与或不与血小板一起)。最后，本文的实施方案包括在受损部位中的优化部位给予这些调理细胞和辅助材料，以进一步促进修复和/或再生。干细胞间充质干细胞(MSCs)有极大希望成为再生性药物中的治疗剂。Alhadlaq，Α.和 J. J.Mao，间充质干细胞分离和治疗。Stem Cells Dev,2004. 13(4) :p. 436-48。Barry, F. P.，关节疾病中的间充质干细胞疗法。Novartis Found Symp, 2003. 249 :ρ· 86-96 ；讨论 96-102、170-4、239-41。Bruder, S. P.，D. J. Fink 和 A. I. Caplan，骨发育、骨修复和骨骼再生疗法中的间充质干细胞。J Cell Biochem，1994. 56(3) :p. 283-94。Cha, J.和 V. Falanga， 皮肤伤口愈合中的干细胞。Clin Dermatol, 2007. 25(1) :ρ· 73-8。Gangji，V.，Μ· !"oungouz 和J. P. Hauzeur，用于股骨头坏死的干细胞疗法。Expert Opin Biol Ther, 2005. 5 (4) p. 437-42。这些成熟的干细胞可易于从身体内的许多来源分离。Alhadlaq，A.和J. J.Mao， 间充质干细胞分离和治疗。Stem Cells Dev，2004. 13(4) :p. 436-48。此外，他们还在许多动物研究中已经证明分化成肌肉、骨、软骨、神经、肌腱和各自内脏器官细胞的能力。腰椎盘退变和病理变化是明显失能和医疗花费的主要原因。Dagenais，S.，J. Caro和S. Haldeman, 美国及国际疾病研究的下腰疼花费的系统回顾。Spine J, 2008. 8(1) :p. 8_20。手术治疗，诸如椎间盘切除(discectomy)、融合和盘替换已经用于临床实践中，对于显著的发病率具有强效。de Kleuver, M.，F. C. Oner和W. C. Jacobs，用于慢性下腰疼的全部盘替换文献背景和系统回顾。Eur Spine J,2003. 12(2) :ρ· 108-16。Gotfryd, Α.和 0. Avanzi，采用盘后部切除以治疗腰椎盘脱出的随机的临床试验的系统回顾。ht Orthop, 2008. Katonis,P.等， 胸椎和腰椎手术后感染18例回顾。Clin Orthop Relat Res，2007. 454 :ρ· 114-9。作为结果，修复椎间盘(IVD)而不是手术改变或切除的能力是吸引人的治疗选项。粗尾猿(Saki) 和其它动物已经显示，MSC' s在动物研究中采用模拟盘退变的针刺模型能够修复腰椎盘。 Sakai,D.等，将包埋在去端肽胶原质(atelocollagen)中的间充质干细胞移植至退变的椎间盘的再生作用。Biomaterials，2006. 27(3) :ρ· 335-345。Sakai,D.等，移植至兔退行性盘模型的间充质干细胞的分化干细胞疗法在盘再生中的潜力和局限。Spine，2005.3(K21) p. 2379-87。Sakai,D.等，将包埋在去端肽胶原凝胶中的间充质干细胞移植至椎间盘一种潜在的治疗盘退变的模型。Biomaterials, 2003. 24(20) :p. 3531-41。发明人承认，动物和人IVD模型间存在许多生理上的差异。这些差异包括由四足动物(绵羊、猪和鼠科动物) 对比人类的双足构造而产生的不同的力。此外，流行的椎间盘退变疾病(DDD)的针刺模型， 为许多动物研究人员所采用，造成急性损伤的盘的科学上的等价物。人DDD常常在患者就医或接受手术治疗前已存在数十年。本文的实施方案(参见实施例)显示，MSC的经皮将富含VEGF的、血小板衍生的上清液布置入受试人员的盘后环面，提供显著的盘修复。将细胞放置进入盘后环面的决定是部分基于该区域高度血管化作出的，相比之下髓核内已被适当定义为无血管、低密度营养物环境。本发明的实施方案包括从需要无血管部位修复的患者收获干细胞。依据本发明的干细胞如以上在定义章节中所描述。在某些实施方案中，干细胞为间充质干细胞，即能够分化为，除了别的细胞类型之外的造骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和胰岛细胞的多能细胞。注意到，对于本发明的目的，许多实施方案进行了间充质干细胞的相关描述，尽管其它干细胞类型也可使用，并且纳入本发明范畴之内。依据本发明的方面的干细胞收获包括那些在美国专利申请序号S/N PCT/ us08/68202中所描述的，所述文献通过全文引用结合于本文。再有，在美国专利号 5，486，359,6, 387，367和5，197，985中描述的方法和组合物通过全文引用结合于本文。更详细地，间充质干细胞是位于骨髓、外周血、脂肪组织和其它相似的来源中的多能干细胞。MSCs具有分化成多种细胞类型，包括造骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和 β-胰岛细胞的能力。本发明的MSCs来源典型地从需要该补药/替换疗法(或适宜的供体)的患者的髂嵴(或其它来源，诸如IVD、骨膜、滑液或椎体或椎弓根(pedicle))收获，这样的患者在本文指的是“有需要的患者或需要其的患者”(注意到，其它来源，诸如脂肪组织、滑膜组织和结缔组织近期已经被确定并且也被认为是纳入本发明范畴的MSC源)。在一个实施方案中，收获大约lO-lOOcc的骨髓并采用在Centeno的美国专利申请序号60/761，441中描述方法或通过如Caplan等的美国专利号5，486，359中所描述的粘附于塑料“分离”。这些文献的每一篇通过所有目的的全文引用结合于本文。如在下文详细描述的，本发明的实施方案也可需要某种水平或量的血小板。如此， 本发明结合标准骨髓抽取操作的改变，以使适当的有核细胞数产出，以使用血小板或血小板溶解产物技术。此外，可自全血获取这些血小板。因为绝大多数发表的研究再次在健康人类或动物中实施，该项针对患有多种疾病状态的人的技术申请从未被试验。注意，使用改变的技术每侧抽取三支小的2-3cc骨髓等分量(aliquots)(总共6等分量)，生产所需的有核细胞产量，其足以在20%血小板溶解产物中扩增。从采用Doucet(Doucet，Ernou 等，2005 J. Cell Physiol 205 (2) :288-36)(其通过全文引用结合于本文)的方法收获的骨髓制备用于本文的血小板和血小板溶解产物。典型的溶解产物包括从约数以千万计至数以亿计的血小板。如由Martineau等， Biomaterials, 2004 25 (18)p4489_503 (其通过全文引用结合于本文)所显示的，血小板溶解产物固有地包括需要促进MSC—致性生长的生长因子。在典型的实施方案中，血小板溶解产物和MSC为自体同源的，并且呈现的量有用于MSCs的有效和一致性扩增(以下更充分地描述)。尤其是，应该注意的是，当在血小板溶解产物中的生长因子，诸如TGF-β的水平大大低于通常用于扩增MSC的水平时，相信在将包含在血小板溶解产物中的所有低水平生长因子一起使用时有显著的增效作用。干细胞选择(选择压力(Selective Pressure))培养收获的干细胞以选择干细胞(典型地间充质干细胞)和最终选择用于在类似于在需要修复的部位，例如需要修复的椎间盘中发现的那些条件的环境条件下生存和扩增的干细胞。其与椎间盘修复相关的选择压力在以下更详细讨论，但存在对于髋、肩部等所需的类似的条件和可确定的条件。如在toban等，椎间盘的营养。Spine，2004.四03) :p2700_9，(通过全文引用结合于本文)中讨论的，已经遭受损伤和患有退行性病变的椎间盘提供差的营养以及氧环境。 该环境不同于健康椎间盘的环境。实际上，确定在受损椎间盘中的移植的间充质干细胞的生存能力所实施的研究显示差的细胞生存结果，很少细胞能够扩增以提供所需的提高盘修复所必需数量细胞(Wuertz等，在椎间盘的化学微环境中的间充质干细胞的行为。Spine， 2008. 33(17) :p 1843-9，通过全文引用结合于本文)。更详细地，在培养条件下，放置从需要盘修复或复原的患者收获的干细胞。在一个实施方案中，培养基是从DMEM或其它相似的介质制备的基础细胞培养基。培养基可补充糖、氨基酸、脂质、矿物质、蛋白质或预定促进干细胞扩增的其它类似物质。此外，本文的实施方案可包括在刺激受损盘的环境的各种大气条件下培养收获的和正在扩增的间充质干细胞。在一个实施方案中，在1-15%氧下在体外培养收获的干细胞。 在某些情况下，在3至10%氧下培养收获的干细胞，和在其它情况下，在3至7%氧下培养收获的干细胞。这些较低的氧条件复制存在于典型的受损盘环境的低氧条件。低氧条件可存在于部分或全部干细胞扩增期间，但典型地存在在体外细胞培养的至少1/3的时间。在细胞培养时，发生选择，能够幸存和最终扩增的生存细胞在植入具有低氧环境的盘中时具有优势。在其它的实施方案中，在升高的二氧化碳条件，典型地2-10%二氧化碳下，在体外培养收获的干细胞。可在升高的二氧化碳和低氧环境组合下再培养收获的细胞，该条件包括2-10%二氧化碳和3-10%氧。如上所述，当细胞培养时，发生选择，能够幸存和最终扩增的生存细胞在植入具有升高的二氧化碳环境或升高的二氧化碳环境与低氧环境组合的盘中时具有优势。在其它的实施方案中，与收获的和培养的髓核(nucleas pulposis)细胞(NP细胞)或纤维环(armulus fibrosis)细胞(AF细胞)联合培养和扩增收获的干细胞。可从需要盘修复的患者经由针吸或其它相似的技术收获用于与干细胞共同培养的髓核(NP)细胞。这些NP细胞或AF细胞可或者为自体同源的或者为非-自体同源的。在典型的实施方案中，大约IO3至IO9NP或AF细胞与收获的干细胞共同培养，并且使其提供有用于选择应答 NP细胞和/或AF细胞释放因子和废物产物的干细胞的环境。共同培养条件可包括不良营养环境、缺氧、升高的二氧化碳和本文描述的其它公开的实施方案。在某些实施方案中，在烧瓶(或其它相似的容器)中体外分开培养NP细胞与干细胞。然后可将NP细胞培养用完的培养基与在以上干细胞培养期间的培养基条件结合，或可专门用于扩增和选择能够维持在这样的条件下生存和最终扩增的干细胞。在其它的实施方案中，在类似于在受损椎间盘中发现的那些条件的修改的pH条件下培养和扩增收获的干细胞。例如，可修改体外培养基(如本文描述的)以使其PH为 6. 6-7. 0，且更典型地为6. 7-6. 9。可将修改的pH与本文讨论的任何培养条件组合以促进用于盘修复和再生的干细胞的选择。在其它的实施方案中，在类似于在受损椎间盘中发现的那些条件的修改的摩尔渗透压浓度条件下培养和扩增收获的干细胞。例如，可修改体外培养基(如本文描述的)以使其摩尔渗透压浓度为350-600m0sm，且更典型地为450-500M0sm。可将修改的摩尔渗透压浓度与本文讨论的任何培养条件组合以促进用于盘修复和再生的干细胞的选择。在其它的实施方案中，可通过纳入一个或多个生长因子，修改在一个或多个选择条件下的干细胞的生存和扩增。在这些案例中，在TGF-β FGF、PDGF, IGF和/或HIF-I α， 包括其混合物和其它相似的因子的存在下培养在选择下的细胞。注意到，对于每一个上述基于干细胞培养的实施方案而言，可将条件逐渐结合到细胞标准培养环境中。例如，可将收获的干细胞最初在10%氧下培养一至二个传代期 (passages)，然后移至9%氧条件下培养一至二个传代期，和在减低水平的氧下培养直至得到目标低氧条件。在该方法中，使细胞逐渐适应存在于受损盘中的环境。描述与受损盘的治疗相关的以下治疗方法，尽管其它无血管区的治疗也预想纳入本发明的范畴中。受损椎间盘的治疗对于修饰者而言，使通过至少一种以上讨论的受损盘正在选择的干细胞扩增，直至存在足量的细胞用于植入患者的受损盘。在典型的实施方案中，必需有从约IO5-IO9经选择的间充质干细胞用于植入受损盘。用PBS或其它相似的缓冲液清洗经培养的细胞，以获得不包括不意欲植入患者身体的材料，即介质成分、废物产物等的细胞群。洗后的干细胞可包括NP细胞，尽管可预期的是，与NP细胞共同培养干细胞，可经由细胞分选技术或亲和色谱去除NP细胞群。现在干细胞已准备好用于植入有需要的患者中。在一个实施方案中，将洗后的干细胞直接植入受损盘的后环面(posterior armulus)。这是意想不到的干细胞植入部位，因为常规的方法显示细胞植入髓核。经由本领域已知技术，包括经皮χ-线引导或外科IVD路径，将细胞植入受损盘的后环面。一次或更多次反复的细胞植入可用于受损盘的修复操作中，尽管典型的治疗间期是14至180天。在另一个实施方案中，用凝血酶和CaCl2预处理来自需要疗法的患者的自体同源血小板大约一至七天。该处理预调理这些血小板，以优先表达血管内皮生长因子(VEGF)。 在某些实施方案中，用大约28. 56U/ml凝血酶和大约2. 86mg/ml CaCl2预处理收获的血小板。在另外的实施方案中，用凝血酶、钙或其盐、血栓烷A2、三磷酸腺苷和arichidonate的组合预处理来自有需要的患者的自体同源血小板。如上，预处理可在植入有需要的患者之前一至七天。然后在以前讨论的本发明经选择调理的干细胞植入之前、期间或以后，植入预调理的自体同源的血小板。一般在与植入干细胞相同的部位植入血小板。在另一个实施方案中，与一个或多个补充剂或补充治疗剂一起，植入本发明的收获的和选择的干细胞，所述补充剂或补充治疗剂包括生长因子、细胞因子、整联蛋白、钙粘着蛋白或已知促进血管发生、血管生成或动脉生成(aerteriogenesis)的分子或药物，包括VEGF-A、PIGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、TGF- β、Ang-1、Ang_2、IGF、HGF、FGF、T i e 2、PDGF、 CCL2, α -V β-5、α-5 β-1、VE-钙粘着蛋白、PECAM-I、纤溶酶原激活剂和氧化氮合酶。在备选的实施方案中，将用于植入有需要的患者中的干细胞联合生长因子共同植入，所述生长因子包括TGF-β、FGF、PDGF、IGF或意欲促进干细胞和/或间充质干细胞干性(sternness) 或增殖的其它相似的生长因子。在某些实施方案中，可联合以前提到的补充剂植入自体同源的血小板或血小板溶解产物。图1阐述本发明的一个实施方案的效用，显示具有叠加针状放置(needle placement)的轴向腰椎图。将采用本文描述的实施方案调理的干细胞放置在盘后环面的血管和过渡血管区。
实施例实施例1 经皮植入的自体同源的间充质干细胞方法受试者基于自愿选择三名受试患者参加IRB (Spinal Injury Foundation (脊髓损伤基金会)Westminster，CO)核准的MSC植入方案。每位受试者签署IRB核准的同意表(consent form)。基于下列纳入/排除标准选择受试者纳入标准1. 18-65 岁2.保守治疗失败3.盘突出或内含性盘挤出(后纵韧带下挤出型)的腰椎椎间盘退变疾病4.选择性神经根阻滞，其证实盘突出/需要治疗的作为疼痛源(pain generator) 的神经(> 75%减轻疼痛主诉)或证实盘为P2疼痛源的椎间盘造影术5.在T2加权MRI图像上显示正常盘高度的至少75%有或没有脱水6.不情愿进行手术选项排除标准1.活动性炎症或结缔组织疾病(即狼疮、纤维肌痛、RA)2.与症状潜在关联的活动性非-校正的内分泌障碍(即甲状腺机能减退、糖尿病)3.与症状潜在关联的活动性神经障碍(即外周神经病、多发性硬化症)4.严重心脏病5.需要用药的肺病6.对输入自体同源血液制品具呼吸困难或其它反应的病史操作前数据收集
1.在MSC植入3个月内获得CBC和血液化学数据，以排除未知医学病症。2.操作前 MRI3.操作前结果检测间充质干细胞(MSCs)的分离和扩增在骨髓收获操作前一周，限制患者不得使用皮质类留醇类或NSAIDs。与骨髓收获操作同步，抽取肝素化的(Abraxis !Pharmaceuticals) IV静脉血用于血小板溶解产物 (PL)。经由在200g离心，从红血细胞(RBCs)分离富含血小板的血浆(PRP)，制备血小板溶解产物。PRP体积分成等份和存储于-20°C以产生PL。将血小板溶解产物以10-20%补充
在细胞培养基中。也基于 Martineau. (Martineau, I.，E. Lacoste 禾口 G. Gagnon, 丐禾口 疑血醇对从血小板浓缩物中释放生长因子的作用内皮细胞增殖的动力学和调节.Biomaterials， 2004. 25(18) :p. 4489-502)描述的方法，制备富含血小板衍生的VEGF的上清液。使用如上的相同的PRP分离步骤，吸出PRP并于37°C和5% CO2下，用28. 56U/mL的人凝血酶(Johnson 和 Johnson)和 2. 85mg/mL 的氯化钙(CaCl2, American Regent)使一等份 PRP 活化 6 天。于 3，OOOrpm使活化的PRP样品离心6分钟，吸出上清液并存储于_80°C。之后将此用作与培养扩增MSC’ s混合的注射剂(injectate)以及经由硬膜外注射传递的补充注射剂。与抽取全IV血同步，然后让患者俯卧在手术室(OR)台上并用利多卡因使将要收获的部位麻醉，并用消毒的用后即弃的套管针从右PSIS区域抽取IOcc的骨髓血和从左PSIS区域抽取IOcc的骨髓血置于肝素化的注射器中。如果患者在抽骨髓过程中报告疼痛，而该疼痛不易通过局部麻醉控制，只能加用脊尾骶管硬膜外麻醉剂。于200g离心全骨髓4-6分钟以从RBCs分离有核细胞。将有核细胞移开并置入分离管中。于IOOOg离心样品6分钟至小球形成。在磷酸盐缓冲盐水(PBS，GibCo)中洗涤有核细胞一次，计数，然后将其再悬浮于含有10-20% PL、5ug/mL多西环素(Bedford Labs) 禾口 2IU/mL 月干素(Abraxis Pharmaceuticals)的 Dulbecco，s 改良的 eagle 培养基(DMEM, GibCo)中。将有核细胞以IxlO6个细胞/cm2接种于组织培养烧瓶中。使培养物在潮湿环境、37°C /5% CO2/5% O2下孵育。48-72小时后改变培养基，去除大多数未-粘附的细胞群。 在6-12天中使MSC克隆孵育，然后被用无动物源胰蛋白酶样酶(TrypLE Select,GibCo)收获，这样仅分离集落形成的MSCs。为了扩增MSCs，将它们以6-12，000个细胞/cm2密度平铺于含有10-20% PL、5ug/mL多西环素和2IU/mL的肝素的、α -改良的eagle培养基(AMEM， GibCo)中，并于371:/5^(^/51% O2下生长至接近汇合。将源于骨髓的初生细胞指定为0 传代，而将每一次后续的MSCs的次培养认为是一个更远的传代(further passage) 0参见图2，采用该单层细胞培养技术生长的MSC形态学的实例。在MSC’s已经次培养至第2-第 5代后，将它们收获、洗涤，和悬浮于活化的PRP中用于注射。经皮植入程序让患者俯卧在X-射线台上和用无菌手套和消毒盖布(drapes)、以聚维酮碘 (betadine)药签使患者准备接受手术。得到身体同侧的倾斜方向的AP荧光透视观 (Siemens Iso-C)。要注射的目标水平的在上终板(superior endplate)通过调节头尾倾斜 (cephalic-caudal tilt)为可见的“直立的(on end)”。使用无菌技术，在双平面荧光透视下引导22号7英寸奎英克(quinke)针至待治疗的该水平的腰椎关节小平面(lumbar facet joint)的上关节突并推进越过小关节面(facet)进入盘后。一旦获得进入盘的通路，在侧视图下，定位针以使最多的造影剂(用PBS稀释50%的欧乃派克流(Omnipaque) 300mg/ ml-NDC 0407-1413-51)进入尽可能地靠近盘突出的解剖部位的后环面，使用治疗前MRI成像作为近似值(参见图3)。然后注射在血小板衍生的VEGF上清液中的培养物扩增的自体同源MSC’ s并抽出针。在植入MSC后，在第1周和第2周，受试者返回用在目标水平的VEGF衍生的上清液实施另外的经椎间孔(transformainal)硬脑膜外操作。用相同的制剂实施硬脑膜外操作。在双平面荧光透视下操作使用25号3. 5英寸奎英克针获得硬膜外路径，并导向要注射的目标水平的椎弓根下隐窝(subpedicular recess)。一旦显现在椎弓根下的良好的硬膜外染料流向上扩展，即注射VEGF衍生的上清液加上4%利多卡因并抽出针(参见图4)。术后治疗方案由或在家里进行每周3次持续四周的物理疗法中的腰椎牵引组成。成像和患者随访使用GE 3.0 Tesla Excite HD处理腰椎脊椎图像。成像序列包括矢状短Tau反转恢复成像(STIR)、矢状快速梯度回波(Fast Gradient Recall Echo (FGRE))和梯度回波快速旋转(Gradient Recall Echo Fast Spin(GRE-FS))。用E-Film Workstation Version 1.5. 3 (Merge Healthcare)观察和测量图像。使用与TR/TE匹配的和成像平面匹配的矢状短Ta反转恢复成像(STIR)和梯度回波(GRE)快速旋转图像。实施此操作以减少在相同的患者中的连续图像的解读误差的可能性。为了减少日间效应(diurnal effects)，指示成像中心尽可能接近当天相同时间完成连续胶片(serial film)。经由电话启动随访问卷并从患者获得关于功能和症状的信息。获得就下腰痛而言的修改的VAS计分并且也获得“功能性等级指数(Functional Rating Index) ” (FRI) 0 该问卷聚焦于患者的功能。(Feise, R. J.和J. Michael Menke，功能性等级指数一种新的有效的和可靠的测量脊椎病症中临床变化的量级的工具(Functional rating index :a new valid 禾口reliable instrument to measure the magnitude of clinical change in spinal conditions)。Spine, 2001. 26(1) :p. 78-86 ；讨论 87)。也采用办公室访问用于术后检查。这些工作在以下间期开始1.在操作后6周。2.在操作后12周。结果以下描述三名参与的受试者的病历和结果患者1:HO是一名19岁白人女性大学生运动员，有7年的下腰痛史，考虑继发于举重外伤和她的选定运动。她在介绍之前已经经历大量的保守护理长达四年，包括用介入疼痛管理医师评估和治疗。排除腰椎小关节面(lumbar facets)作为疼痛源，对关节内注射呈阴性反应，MRI显示L5-S1盘突出，邻近两侧Sl神经根，右侧更厉害。椎间盘造影术显示有症状的后纤维环撕裂(posterior annular tear)，伴在L5-S1盘的相一致的疼痛再现。在操作前，受试者描述严重程度不等的持续疼痛，伴有在进行任何身体活动时右侧神经根的Sl分区麻木和麻刺感，导致显著的功能限制。受试者报告通过12周，获得最高至75%的改善。在操作后6个月，受试者显示在其报告的修改的VAS疼痛计分和功能性等级指数的少许改变。在治疗后MRI成像结果中观察到变化的相应的缺少。在6周时观察到最大突出尺寸减少1mm，但是在3. 5个月时又回到操作前的尺寸。越过所有成像部分，所有盘高度检测值保持相同，且对于所有摄取的图像的时间间隔当天最多时间是1小时和45分钟。HO的结果在图11、12和13中显示。患者2:MJM是一名35岁白人男性，在介绍之前有15年的下腰痛史。他报告保守护理失败并且由于活动使得严重疼痛事件频率增加。MRI显示腰椎的S1-S2段，有基底较宽的 (broad-based)盘凸出，伴有在L5-S1中等小关节面侵蚀和中等椎间孔狭窄(foraminal narrowing)。再有，在L4-L5存在较左侧更甚的右后侧内含性突出。体格检查显示无活动性神经根病，但患者报告与病情恶化相关的间歇性神经根症状。在保守治疗失败后推荐手术，但被拒绝。L4-L5盘是该治疗的病灶，而脱水的L5-S1盘留作对照。操作后六个月，患者改善改良的VAS，从3至0，疼痛频率下降大于80% (参见表 1)。该患者的FRI计分增加大于60%，并且他报告总体症状改善50%。L4-L5盘凸出矢状 STIR图像检查到在手术前MR图像中其最大程度为6mm (参见图8)。在2个月和4. 5个月随访胶片中(与图像序列和切片匹配-参见图9和10)，发现L4-L5凸出减少为3mm而盘高度在任何L4-S2盘的检测中没有变化。获得图像的当天时间变化不超过20分钟。患者3:ML为一名M岁白人女性，患有与军事训练操练相关的创伤性下腰部损伤。在介绍时她已经有症状三年了。她主诉包括向下一条腿和有时是两条腿均有的电击样闪痛 (electric shooting pain)、延长时间的坐或站立时下腰痛和弯腰或曲身时疼痛。对她的保守治疗包括物理疗法已失败。在进行操作前MRI证明盘高度减少，但在L5-S1盘有时有保留的T2信号(参见图5)。该盘也有由后纵韧带包含的0.7cm的挤出。后环面断裂并且从髓核至后纵韧带有高强度区。L4-L5盘具有减少的T2信号并且脱水，但保留盘高度。在该水平检测到0.4cm的突出，在盘的内下方(inferomedial)部分观察到高强度区。基于病史、检查和MRI发现，猜想在L4-L5和L5-S1盘水平均有在L5和Sl神经根的间歇性横穿神经根刺激(traversing nerve root irritation)。实施椎间盘造影(discogram),显示在 L4-L5和L5-S1均有的低压一致性疼痛(low pressure concordant pain) (P》，两者均伴有后纤维环撕裂。作出该项决定以用MSC注射仅治疗L5-S1盘，留下L4-L5当作未治疗的对照组。在进行操作后6个月(参见表1)，ML报告下腰部修改的VAS (1-10级)改善大约 40%，疼痛的频率的减少大于60%。由FRI检测的功能改善大于70%。她自我报告症状改善60%。在进行操作后她的腰椎MRI成像证明，L5-S1盘突出的尺寸从操作前的0.7cm减少至操作后1个月的0. 3cm和至操作后5个月的0. km (参见图6和7)。再有，盘后环面中的HIZ面积尺寸在两次随访胶片中均减少。获得图像的时间差异不超过1. 5小时。表1 在进行操作前和操作后6个月报告的下腰部修改的VAS和频率的结果。1. 0
的频率等于持续疼痛。功能性等级指数检测值以及病情的百分率变化的自我报告。
权利要求
1.一种用于在有需要的患者中治疗退行性椎间盘的方法，该方法包括 从有需要的患者收获干细胞；在相应于受损椎间盘的环境的选择压力下培养收获的干细胞；和在退行性椎间盘的盘后环面中植入选择的干细胞。
2.权利要求1的方法，其中的选择压力包括在从约3至约10%氧气中培养收获的干细胞。
3.权利要求2的方法，其中的选择压力包括在从约3至约7%氧气中培养收获的干细胞。
4.权利要求1的方法，其中的选择压力包括在从约2至约10%二氧化碳中培养收获的干细胞。
5.权利要求2的方法，其还包括选择压力，包括在从约2至约10%二氧化碳中培养收获的干细胞。
6.权利要求1的方法，其还包括 从有需要的患者中收获NP细胞；和在选择压力下与收获的干细胞一起共同培养NP细胞。
7.权利要求1的方法，其中的干细胞是间充质干细胞。
8.权利要求1的方法，其还包括 从有需要的患者中收获血小板；和在植入选择的干细胞之前、期间或之后植入血小板； 其中血小板和干细胞二者的植入均在盘后环面。
9.权利要求8的方法，其中在植入盘后环面之前，用凝血酶和氯化钙处理血小板1-7天。
10.权利要求9的方法，其中凝血酶的量是28.56U/ml和氯化钙的量是2. 86mg/ml。
11.权利要求8的方法，其中用凝血酶、氯化钙或其盐、血栓烷A2、三磷酸腺苷和 arichidonate处理血小板。
12.权利要求1的方法，其还包括给予一个或多个化合物，所述化合物选自生长因子、 细胞因子、整联蛋白、钙粘着蛋白、促进血管发生的分子或药物、促进血管生成的分子或药物和促进动脉生成的分子或药物。
13.权利要求12的方法，其中的化合物是VEGF-A、PIGF,VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, TGF—β、Ang_l、Ang_2、IGF、HGF、FGF、Tie2、PDGF、CCL2、α -V β _5、α _5 β _1、VE_ 丐粘着蛋白、PECAM-I、纤溶酶原激活剂或氧化氮合酶。
14.权利要求1的方法，其还包括在盘后环面植入选择的干细胞之前、期间或之后给予一种或多种生长因子。
15.权利要求14的方法，其中的一种或多种生长因子选自TGF-i3、FGF、PDGF和IGF。
16.权利要求1的方法，其中收获的干细胞的培养在由D-MEM基底制备的基础培养基中进行。
17.一种药用组合物，其包含干细胞、血小板、一个或多个生长因子和药用载体或稀释剂。
18.权利要求17的组合物，其中的干细胞是间充质干细胞。
19.权利要求17的组合物，其中已根据干细胞在低氧条件下生存和扩增的能力，对干细胞进行了选择。
20.权利要求17的组合物，其中已根据干细胞在类似于受损椎间盘的培养条件下生存和扩增的能力，对干细胞进行了选择。
21.一种在有需要的患者中治疗无血管区的方法，该方法包括 从有需要的患者中收获干细胞；在相应于受损的或老化的无血管区的环境的选择压力下培养收获的干细胞；和在无血管区植入选择的干细胞。
22.权利要求21的方法，其中的无血管区在患者的肩部。
23.权利要求21的方法，其中的无血管区在患者的髋部。
全文摘要
本申请提供用于在有需要的患者中修复受损的包括椎间盘的无血管区的组合物和方法。
文档编号A61K35/00GK102325536SQ200980156403
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月4日 优先权日2008年12月5日
发明者C·J·岑特诺 申请人:再生科学有限责任公司