专利名称：针对组织因子的人抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对组织因子，特别是人组织因子的抗体，和这类抗体的用途，特别是它们在治疗癌症、炎症和血管疾病中的用途。
背景技术：
组织因子(TF)，也称作促凝血酶原激酶(thromboplastin)、因子III或 CD142，是一种存在于内皮下组织、血小板和白细胞中的蛋白质，是引发从酶原凝血酶原 (prothrombin)形成凝血酶所必需的。凝血酶形成最终导致血液凝固。组织因子使细胞能够触发凝血级联，并且发挥凝血因子VII高亲和力受体的功能。所得到的复合体提供一种催化事件，该事件负责通过特异的限制性蛋白水解(limited proteolysis)引发凝血蛋白酶级联。与这些蛋白酶级联中其它作为无功能前体形式进行循环的辅助因子不同，这种因子是一种强力的引发剂(initiator)，其表达在细胞表面上时即具有完全的功能。组织因子是丝氨酸蛋白酶因子Vlla(FVIIa)的细胞表面受体。FVIIa与组织因子的结合已经被发现可以在细胞内开始信号传递过程，所述信号传递功能在血管发生中发挥作用。尽管血管发生在生长和发育以及伤口愈合中是一种正常的过程，但是它也是肿瘤从休眠状态转变成恶性状态过程中的一个基本步骤当癌细胞获得可以产生参与血管发生的蛋白质，即所谓的血管发生生长因子，的能力时，这些蛋白质被肿瘤释放到附近组织内，并刺激现有的健康血管朝着肿瘤萌生出(sprout)新血管并进入肿瘤内部。一旦新血管进入肿瘤内，它就能够快速增大其尺寸，并侵袭局部的组织和器官。通过这些新血管，癌细胞可以进一步逃逸进入循环中，并栖息于其它器官内形成新的肿瘤(转移)。此外，TF在炎症中发挥作用。TF的作用被认为是通过血液凝固介导的(A. J. Chu "Tissue factor mediates inflammation，，in Archives of biochemistry and biophysics, 2005, vol. 440，No. 2，pp. 123-132)。因此，通过例如单克隆抗-TF 抗体抑制 TF， 在干扰凝固-炎症循环中具有重要意义，不仅有助于抗炎而且有助于抗血管疾病。TF表达在许多类型的癌症中均被观察到，并且与侵袭性较高的疾病有关。而且， 人TF还以一种可变剪接形式存在，即asHTF。最近发现，asHTF促进肿瘤生长(Hobbs et al.2007 Thrombosis Res. 120(2)S13-S21)。在先前技术中已经公开了与TF结合的抗体W098/40408公开了能够结合天然(native)人TF的抗体，单独存在或者存在于 TFiVIIa复合体中，可有效阻止因子X结合到TF或该复合体，借此降低凝血。该文献公开了该抗体可用于减轻侵入性医疗程序(invasive medical procedure)，例如动脉或心脏手术，后的血栓形成，或者消除由于使用医疗措施(medical implementation)引发的凝血。其他抗体被公开用于体内诊断方法，包括天然人TF的体内诊断成像。W004/094475提供了能够与人组织因子结合的抗体，其与正常血浆对照相比，不抑制因子介导的凝血。没有描述人抗体。据称，该抗体可用于治疗癌症。W003/093422涉及与TF VIIa复合体的结合亲和力大于与TF本身的结合亲和力的抗体。并提出了这些抗体作为抗凝剂在某些疾病治疗中的用途，例如败血症、弥散性血管内凝血、缺血性脑卒中、血栓形成、急性冠状动脉综合症和晚期癌症中的凝血病。W001/27079公开了组合物和方法，用于抑制异常细胞增殖，特别是内皮细胞增殖， 例如癌症，胚胎异常发育，免疫应答机能失常，以及与新生血管化和肿瘤生长有关的血管发生。提供了许多活性物质，包括抗体，但没有公开具体的抗体。W003/037361涉及TF激动剂或拮抗剂用于细胞凋亡相关的治疗的用途。W003/029295涉及分离的人抗体，其与人TF免疫反应，抑制凝血因子VIIa的结合。 然而，该申请没有公开具有这些性质的抗体的任何实例。已经有若干单克隆抗体疗法被批准用于治疗不同类型的肿瘤，包括例如贝伐单抗(bevacizumab) (Avastin ),西妥昔单抗(cetuximab) (Erbitux ),帕尼单抗 (panitumumab) (Vectibix )禾口曲妥单抗(trastuzumab) (Herceptin )。
发明概要尽管已经取得了很多进展，但是仍然需要有基于治疗性抗体的改进方法用于治疗严重的疾病，例如改进的癌症治疗。本发明的一个目的是提供用于医疗用途的新的高特异性、有效的人抗-TF抗体。 本发明抗体显示与本领域中已有描述的抗体不同的TF结合特性。在优选实施方案中，本发明的抗体对人组织因子具有高亲和力，介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，抑制FVIIa结合 TF,抑制FVIIa诱导的ERK磷酸化和IL-8释放，不抑制或者较弱地抑制凝血。附图简述
图1 本发明抗体的序列比对。根据IMGT的⑶R1、⑶R2和⑶R3被高亮显示斜体的序列代表⑶Rl区，加下划线的序列代表CDR2区，粗体的序列代表CDR3区。图 2 :IgG4 序歹Ij (SEQ ID NO :113-114)SEQ ID NO 113 野生型人IgG4CH区的氨基酸序列。斜体的序列代表CHl区，高亮的序列代表铰链区，规则序列代表CH2区，加下划线的序列代表CH3区。SEQ ID NO :114 人IgG4的无铰链CH区的氨基酸序列。图3 抗-TF人单抗与TF胞外域的结合。图4 抗-TF人单抗与膜结合的TF的结合。图5 抑制FVIIa与TF结合。图6 抑制FVIIa诱发的ERK磷酸化。图6a 抑制 FVIIa 诱发的 ERK 磷酸化(phosphylation)。图7 抑制FVIIa诱发的IL-8释放。图8:抑制FXa产生。图9:抑制血液凝固。图10 =TF-人单抗通过ADCC诱导Bx_PC3细胞溶解。图11 补体组分C3c和Ck沉积在靶细胞上。图12 =TF人单抗与肾小球结合的免疫组化分析。图13 =TF-人单抗与胰腺肿瘤结合的免疫组化分析。图14 =TF-人单抗在已建立的MDA-MB-231肿瘤异种移植物中的体内效力。
图15 食蟹猴(cynomolgus monkeys)中通过静脉内注射TF特异性人单抗011在后确定的出血时间。抗体在第1 (Omg/kg), 8 (lmg/kg), 15 (10mg/kg)和22 (100mg/kg)天施用。图16 =TF-人单抗在预防性的已建立的BX-PC3肿瘤异种移植物中的体内效力。图17 改组改组构建体和TF域。图18 抗-TF抗体与TF改组改组构建体的结合。图19 人单抗-TF Fab片段与TF胞外域的结合，ELISA。图20 人单抗-TF Fab片段与TF胞外域的结合，FACS。图21 依赖于所表达的TF分子的数目的抗-TF人单抗的结合谱。发明详细说明定义术语“组织因子”、“TF”、“⑶142”、“组织因子抗原”、“TF抗原”和“⑶142抗原”在
这里可互换使用，并且除非明确指出，包括由细胞天然表达的或在用组织因子基因转染的细胞上表达的人组织因子的任何变体、同种型和物种同源物。术语“免疫球蛋白”是指一类结构上相关的糖蛋白，由两对多肽链构成，一对轻(L) 低分子量链和一对重(H)链，所有四条链可以通过二硫键内部连接。免疫球蛋白的结构已经得至IJ充分表征。见例如 Fundamental Immunology 第 7 章(Paul, W.，ed.，2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))。简而言之，每条重链典型地由重链可变区(这里缩写为Vh或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区典型地由三个结构域构成CH1，Ch2*Ch3。每条轻链典型地由轻链可变区(这里缩写为八或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区典型地由一个结构域构成:CLO V1^Pt区可以进一步再分成超可变性区(或超变区，其在结构限定环的序列和/或形式方面可有极高的可变性)，也称作补体决定区(CDRs)，它们之间间散布着更保守的、称作框架区(FR)的区域。每个V1^Pt典型地由三个CDR和4个FR构成，从氨基端向羧基端按照如下的次序排列FR1，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4 (SlChothia and Lesk J. Mol. Biol. 196,901-917 (1987))。典型地，该区域中氨基酸残基的编号是根据IMGT.，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD. (1991)( “与如 Kabat 中相同或者根据 Kabat 的编号的可变区残基”等短语，在本文中对于重链可变区或轻链可变区而言，是参考这种编号系统的)。使用这种编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可能含有更少或更多的氨基酸，相应于可变区FR或⑶R的缩短或插入。例如，重链可变区可能在Vh⑶R2残基52后面包含一个单氨基酸插入(根据Kabat，残基52a)，和在重链FR残基82后面包含多个插入残基(例如根据Kabat，残基82a，82b和82c等)。给定抗体的残基的Kabat编号可以通过在该抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列进行比对加以确定。在本发明的上下文中，术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子的片段，或其衍生物，其在典型的生理条件下具有与抗原特异性结合的能力，具有相当时间的半寿期，例如至少大约30分钟，至少大约45分钟，至少大约1小时，至少大约2小时，至少大约4小时，至少大约8小时，至少大约12小时，大约M小时或者更长，大约48小时或者更长，大约3、4、5、6、7或更多天等，或者任何其它相关的功能上限定的期间(例如足够诱发、促进、提高和/或调节与抗体与抗原的结合关联的生理应答的时间，和/或足以供抗体募集效应物活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原互作的结合域。抗体(Abs)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应物细胞)和补体系统的组分，例如Clq，补体活化经典途径中的第一组分。抗-TF抗体还可以是双特异性抗体、双抗体(diabody)或类似分子(双抗体的描述见例如PNAS USA迎(14) ,6444-8(1993))。确实，本发明提供的双特异性抗体、双抗体等除了结合组织因子的一部分或组织因子FVIIa复合体之外，还可以结合任何合适的靶标。如前所述，除非在上下文中另外指出或明显有矛盾，在这里，术语“抗体”包括抗体保持与抗原特异性结合能力的片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在术语“抗体”中的结合片段的实例包括(i)Fab’或Fab片段，一种由\，VH，(^和 ChI域构成的单价片段，或者如W02007059782 (Genmab)中描述的单价抗体；(ii)F(ab ‘ )2 片段、包含两个通过在铰链区中的二硫桥连接的Fab片段的双价片段；(iii)基本上由Vh 和ChI域组成的Fd片段；(iv)基本上由八和乂11域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al.，Nature 341, 544-546 (1989)),其基本上由V11域构成，也称作结构域抗体(Ho 11 et al ；Trends Biotechnol. 2003 Nov ；21 (11) :484-90) ； (vi)骆驼抗体(camelid)或纳米抗体(nanobodies)(Revets et al ；Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan ；旦(1) :111-24)，禾口 (vii)分离的补体决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的两个域，，是由不同的基因编码的，但是它们可以通过合成的接头用重组方法连接起来，该合成的接头能够使它们作为单个蛋白链制造出来，其中\和Vh区配对形成单价分子(称作单链抗体或单链Fv(SCFV)， 见例如 Bird et al.，Science 242,423-426(1988)和 Huston et al.，PNAS USA 85, 5879-5883(1988))。除非另外指出或上下文中明确指明，这些单链抗体包含在术语“抗体” 的范围内。尽管这些片段一般包含在抗体的意思之内，它们总体上并且各自独立地构成本发明的独特特征，显示不同的生物学性质和效用。在本发明的上下文中，进一步讨论了这些和其它有用的抗体片段。还应当理解，除非另外指出，否则术语“抗体”还包括用任何已知的技术提供多克隆抗体、单克隆抗体(单抗)、抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及抗体的保留与抗原特异性结合能力的片段(抗原结合片段)，所述已知技术例如酶法切割(enzymatic cleavage)、肽合成和重组技术。所产生的抗体可以具有任何同种型。“抗-TF抗体”是如上所述的抗体，其与抗原组织因子特异结合。如这里所使用的，术语“人抗体”意图包括具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变，或在基因改组期间或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如这里所使用的，术语“人抗体”不意图包括如下的抗体，其中来自另一种哺乳动物物种(，例如小鼠)种系的CDR序列被嫁接到人框架序列上。在一个优选实施方案中，本发明的抗体是分离的。如这里所使用的，“分离的抗体” 意图指示如下的抗体，其基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体(例如，特异结合组织因子的分离抗体基本上不含特异结合除组织因子之外的抗原的抗体)。然而，特异结合人组织因子的表位、同种型或变体的分离抗体可以同其它相关抗原，例如来自其它物种的抗原(例如组织因子种间同源物)具有交叉反应性。而且，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学剂。在本发明的一个实施方案中，两种或多种具有不同抗原结合特异性的“分离”单克隆抗体被组合在良好限定的组合物中。
当在本文上下文中使用两种或多种抗体时，术语“与...竞争”或“与...交叉竞争”是指，两个或多个抗体竞争结合TF，例如在本文实施例6中所述的测定中竞争结合TF。 对于一些抗体对，实施例6中测定方法中的竞争只有在将一种抗体包被在平板上，而用另一种进行竞争时才能观察到，但反之则不行。当在本文中使用时，术语“与...竞争”还意图涵盖这些组合抗体。如这里所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一的结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，杂交瘤包含与永生化细胞融合的、从转基因或转染色体非人类动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，该动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。如这里所使用的，在抗体与预定抗原的结合的语境中，术语“结合”典型地是其以相当于Kd大约ΙΟΙ或者更小，例如大约101或者更小，例如大约ΙΟ—Ι或者更小，大约 IO^ioM或者更小，或者大约10_"M或者更小的亲和力结合(例如当在BIAcore 3000设备中用抗原作为配体、以抗体作为分析物通过表面等离子体共振(SPR)技术进行测定时)，并且与预定抗原的结合亲和力与除预定抗体或密切相关的抗原之外的非特异性抗原(例如BSA 或酪蛋白)的结合亲和力相比，与预定抗原的Kd比与非特异抗原的Kd低至少10倍，例如至少低100倍，例如至少低1，000倍，例如至少低10，000倍，例如至少低100，000倍。亲和力低出的量取决于抗体的KD，因此当抗体的Kd非常低时(即抗体高度特异)，对抗原的亲和力低于对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10，000倍。如这里所使用的，术语“k/^sec—1)是指特定抗体-抗原互作的解离速率常数。所述值也称作k。ff值。如这里所使用的，术语“ka” (M-1X sec"1)是指特定抗体-抗原互作的结合速率常数。如这里所使用的，术语“KD” (M)是指特定抗体-抗原互作的解离平衡常数。如这里所使用的，术语“ΚΑ” (Μ"1)是指特定抗体-抗原互作的结合平衡常数，并且通过ka除以kd获得。本发明还提供了包括实施例抗体的\区、、或一个或多个⑶R的功能变体的抗体。在抗-TF抗体的语境中使用的\、Vh或CDR的功能变体仍然允许该抗体保留本发明抗体的亲和力/亲合力和/或特异性/选择性的至少相当部分(至少大约50^,60^,70%, 80 %，90 %，95 %或更多)，并且在一些情况下，这种抗-TF抗体可以有比亲本抗体更大的亲和力、选择性和/或特异性。这些功能变体典型地保留与亲本抗体的显著序列同一性。两条序列之间的百分比同一性是序列所分享的相同位置的数目的函数(即，％同源性=相同位置数/总位置数 xlOO)，同时考虑缺口的数目和每个缺口的长度，缺口的引入是为了在两条序列间进行最佳比对的需要。两条序列之间的序列比对和百分比同一性的确定可以用数学算法实现，如下面非限制性实例中所述。两条核苷酸序列之间的百分比同一性可以用GCG软件包(可在http://WWW. gcg. com获得)中的GAP程序加以确定，使用NWSgapdna. CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，和长度权重1、2、3、4、5或6。两条核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性还可以用 E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4,11-17(1988))的算法加以确定，其已经被引入到ALIGN程序版)中，使用PAM120加权残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，两条氨基酸序列之间的百分比同一性可以用Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48,444-453 (1970))算法加以确定，其被引入到GCG软件包(可以从http //www. gcg. com获得)的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、 10、8、6、或4，长度权重为1、2、3、4、5、或6。⑶R变体的序列可以通过主要是保守的替换而与亲本抗体序列的⑶R序列不同， 例如变体的替换中有至少大约35%、大约50%或更多、大约60%或更多、大约70%或更多、 大约75%或更多、大约80%或更多、大约85%或更多、大约90%或更多、大约95%或更多 (例如大约65-99%，例如大约96%，97%或98% )是保守的氨基酸残基替换。⑶R变体的序列可以通过主要是保守的替换而与亲本抗体序列的⑶R序列不同， 例如变体中的至少10个替换，例如至少9、8、7、6、5、4、3、2或1个替换是保守的氨基酸残基替换。在本发明的上下文中，保守替换可以用下列三个表格中的一个或多个中反映的氨基酸分类中的替换加以定义。用于保守替换的氨基酸残基分类
权利要求
1.一种结合人组织因子的人抗体。
2.权利要求1的抗体，其中当用实施例13中所述的测定方法进行测定时，该抗体以 3nM或更低，例如0. 50nM或更低，例如0. 35nM或更低，例如0. 20nM或更低，例如0. InM或更低的表观亲和力(EC5tl)与组织因子的胞外域结合。
3.前述权利要求中任一项的抗体，其中该抗体结合表达组织因子的哺乳动物细胞，例如用编码组织因子的构建体转染的A431细胞，优选地，当用实施例14中所述的测定方法进行测定时，其表观亲和力(EC5tl)为IOnM或更低，例如8nM或更低，例如5nM或更低，例如2nM 或更低，例如InM或更低，例如0. 5nM或更低，例如0. 3nM或更低。
4.前述权利要求中任一项的抗体，其中该抗体能够在A431细胞中诱发抗体依赖的细胞细胞毒性，优选地，当用实施例20中所述的测定方法进行测定时，其EC5tl值为2nM或更低，例如InM或更低，例如0. 7nM或更低，或者0. 3nM或更低，例如0. 20nM或更低，或者0. InM 或更低，或者0. 05nM或更低。
5.前述权利要求中任一项的抗体，其中当用实施例M中所述的方法进行测定时，该抗体可有效抑制已建立的MDA-MB-231肿瘤的生长，和/或当用实施例沈中所述的方法进行测定时，可有效抑制已建立的BxPC3肿瘤的生长。
6.前述权利要求中任一项的抗体，其中该抗体抑制组织因子诱导的凝血，优选地，当用实施例19中所述的测定方法进行测定时，其中值抑制浓度小于ΙΟηΜ，例如小于5nM，例如小于2nM，例如小于InM。
7.前述权利要求中任一项的抗体，其中该抗体抑制FVIIa与组织因子结合，优选地， 当用实施例15中所述的测定方法进行测定时，其抑制的最大抑制值大于80%，例如大于 90%。
8.前述权利要求中任一项的抗体，其中该抗体抑制FVIIa诱导的MDA-MB-231细胞的 IL-8释放，优选地，当用实施例17中所述的测定方法进行测定时，抑制的最大抑制值大于 40 %，例如大于50 %，例如大于60 %。
9.前述权利要求中任一项中的抗体，其中该抗体抑制FX被TF/FVIIa复合体转变成 FXa,优选地，当用实施例18中所述的测定方法进行测定时，抑制小于50%，例如小于40%， 例如在1-30%的范围内。
10.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体与包括包含序列SEQID N0:9的VH 区和包含序列SEQ ID NO 65的VL区的抗体竞争组织因子结合。
11.前述权利要求中任一项的抗体，其中与组织因子的结合不涉及组织因子的下述任一氨基酸45位的W，46位的K或94位的Y。
12.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体与包括包含序列SEQID N0:37的VH 区及包含序列SEQ ID NO 93的VL区的抗体竞争组织因子结合。
13.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体抑制FVIIa诱导的ERK磷酸化，优选地，当用实施例16中所述的测定方法进行测定时，其中值抑制浓度小于ΙΟηΜ，例如小于 ^iM,例如小于&ιΜ。
14.权利要求1-7和9-13中任一项的抗体，其中该抗体抑制ERK磷酸化，优选地，当用实施例16中所述的测定方法进行测定时，其中值抑制浓度小于ΙΟηΜ，例如小于5nM，例如小于2nM，并且如实施例17中的测定方法所述的对FVII诱导的IL-8释放的抑制不超过最大10%。
15.前述权利要求中任一项的抗体，其中抗体能够诱导C3c和Wc沉积，优选地，如实施例21中所述进行测定，该抗体能够诱导C3c和Ck沉积。
16.前述权利要求中任一项的抗体，其中如实施例观所述，抗体Fab片段与组织因子胞外域结合，用ELISA测得的EC50值低于0. 1 μ g/mL,例如低于0. 05 μ g/mL,例如低于 0.04 μ g/mL。
17.权利要求1-15中任一项的抗体，其中如实施例28所述，抗体Fab片段与组织因子胞外域结合，按照ELISA测得的EC50值高于1. 0 μ g/mL。
18.权利要求1-15中任一项的抗体，其中如实施例28所述，抗体Fab片段与组织因子胞外域结合，EC50值低于10 μ g/mL,例如低于1 μ g/mL,例如低于0. 5 μ g/mL,或者低于 0.2 μ g/mL。
19.上述任一权利要求的抗体，其中该抗体与人组织因子结合但不与鼠组织因子结合， 并且相比于与人TF的结合，其与改组构建体42-84mm显示降低的结合，该改组构建体包含人的TF序列，只是氨基酸42-84被小鼠序列代替，如实施例27所述。
20.权利要求1-18的抗体，其中该抗体与人组织因子结合但不与鼠组织因子结合，并且相比于与人TF的结合，其与改组构建体85-122mm显示降低的结合，该改组构建体包含人的TF序列，只是氨基酸85-122被小鼠序列代替，如实施例27所述。
21.权利要求1-18的抗体，其中该抗体与人组织因子结合但不与鼠组织因子结合，并且相比于与人TF的结合，其与改组构建体123-137mm显示降低的结合，该改组构建体包含人的TF序列，只是氨基酸123-137被小鼠序列代替，如实施例27所述。
22.权利要求1-18的抗体，其中该抗体与人组织因子结合但不与鼠组织因子结合，并且相比于与人TF的结合，其与改组构建体185-225mm显示降低的结合，该改组构建体包含人的TF序列，只是氨基酸185-225被小鼠序列代替，如实施例27所述。
23.权利要求1-18的抗体，其中该抗体与人组织因子结合但不与鼠组织因子结合，并且相比于与人TF的结合，其与改组构建体226-250mm显示降低的结合，该改组构建体包含人的TF序列，只是氨基酸2沈-250被小鼠序列代替，如实施例27所述。
24.根据权利要求19-23中任一项的抗体，其中相比于与人TF的结合，其与超过1种改组构建体显示降低的结合，例如与下列改组构建体的降低的结合如权利要求19中所定义的改组构建体42-84mm和如权利要求20中所定义的改组构建体85-122mm，或如权利要求21中所定义的改组构建体123-137mm，和如权利要求22中所定义的改组构建体185-225mm，和如权利要求23中所定义的改组构建体226_250mm。
25.前述权利要求中任一项中的抗体，其中所述抗体-与包括包含序列SEQ ID NO 9的VH区及包含序列SEQ ID NO 65的VL区的抗体竞争组织因子结合，并且-不与包括包含序列SEQ ID NO 37的VH区及包含序列SEQ ID NO 93的VL区的抗体竞争组织因子结合。
26.权利要求25的抗体，其中所述抗体包括这样的VH⑶R3区，其具有a)如下所示的序列-SEQ ID No 12,-SEQ ID No 16,-SEQ ID No 20,-SEQ ID No 24,-SEQ ID No 28,或者b)所述任一序列的变体，例如具有最多1、2、3、4、或5个氨基酸修饰，优选替换例如保守替换的变体。
27.权利要求沈的抗体，其中该抗体包括具有如SEQID NO: 12所示的序列或其变体的VH⑶R3区，其中该变体在位置2、3、6、9和11中一个或多个位置处包含修饰，优选地，其中该修饰是替换，更优选地，其中该替换选自下组a)位置2处的R被K替换，b)位置3处的S被A或T替换，c)位置6处的G被T替换，d)位置9处的L被F替换，和e)位置11处的S被Y替换。
28.权利要求1或沈的抗体，其中该抗体包括a)包含CDR1，2和3序列SEQID NO :10，11和12的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO 66,67 和 68 的 VL 区，b)包含CDR1，2和3序列SEQID NO 14，15和16的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO 70,71 和 72 的 VL 区，c)包含CDR1，2和3序列SEQID NO 18，19和20的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO 74,75 和 76 的 VL 区，d)包含CDRl，2禾口3序歹Ij SEQ ID NO 22，23和M的VH区，和包含CDRl，2禾口 3序列SEQ ID NO 78,79 和 80 的 VL 区，e)包含CDR1，2和3序列SEQID NO :26，27和沘的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO 82,83 和 84 的 VL 区，或f)所述任一抗体的变体，其中所述变体优选地在所述序列中具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选地是氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
29.权利要求沈的抗体，包含这样的VH，其a)与选自SEQID NO :9，13，17，21和25的VH区序列具有至少80%同一性，例如至少 90 %，至少95 %，或者至少98 %或100 %同一性，或者b)与选自SEQID NO :9，13，17，21，21和25的VH区序列相比具有最多20个，例如15 个，或者10个，或者5、4、3、2或1个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
30.权利要求沈的抗体，包含这样的VL，其a)与选自SEQID NO :65，69，73，77和81的VL区序列具有至少80%同一性，例如至少 90 %，至少95 %，或者至少98 %或100 %同一性，或者b)与选自SEQID NO :65，69，73，77和81的VH区序列相比具有最多20个，例如15个， 或者10个，或者5、4、3、2或1个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
31.权利要求沈的抗体，包括a)包含序歹IjSEQ ID NO 9的VH区和包含序列SEQ ID NO 65的VL区，b)包含序列SEQID NO 13的VH区和包含序列SEQ ID NO 69的VL区，c)包含序列SEQID NO 17的VH区和包含序列SEQ ID NO 73的VL区，d)包含序歹IjSEQ ID NO :21的VH区和包含序列SEQ ID NO 77的VL区，e)包含序列SEQID NO 25的VH区和包含序列SEQ ID NO 81的VL区，或f)所述任一抗体的变体，其中所述变体在所述序列中优选地具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
32.权利要求114中任一项的抗体，其中所述抗体-与包括包含序列SEQ ID NO 9的VH区及包含序列SEQ ID NO 65的VL区的抗体竞争组织因子结合，并且-与包括包含序列SEQ ID NO 37的VH区及包含序列SEQ ID NO 93的VL区的抗体竞争组织因子结合。
33.权利要求32的抗体，其中所述抗体包括这样的VH⑶R3区，其具有a)如下所示的序列 -SEQ ID No 8, -SEQ ID No 52, 或者b)所述任一序列的变体，例如具有最多1、2或3个氨基酸修饰，优选替换例如保守替换的变体。
34.权利要求1或32的抗体，其中该抗体包括a)包含CDR1，2和3序列SEQID NO :6，7禾口 8的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO 62,63 和 64 的 VL 区，b)包含CDRl，2禾口3序列SEQ ID NO 50，51禾口 52的VH区，和包含CDRl，2禾口 3序列SEQ ID NO 106,107 禾口 108 的 VL 区，或c)所述任一抗体的变体，其中所述变体优选地在所述序列中具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
35.权利要求32的抗体，包括这样的VH，其a)与选自SEQID NO 5和49的VH区序列具有至少80%同一性，例如至少90%，至少 95%，或者至少98%或100%同一性，或者b)与选自SEQID NO :5和49的VH区序列相比具有最多20个，例如15个，或者10个， 或者5、4、3、2或1个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
36.权利要求32的抗体，其包括这样的VL，所述VLa)与选自SEQID N0:61和105的VL区序列具有至少80%同一性，例如至少90%，至少95%，或者至少98%或100%同一性，或者b)与选自SEQID NO 61和105的VH区序列相比具有最多20个，例如15个，或者10 个，或者5、4、3、2或1个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
37.权利要求32的抗体，其包括a)包含序列SEQ ID NO 5的VH区和包含序列SEQ ID NO :61的VL区，b)包含序列SEQID NO 49的VH区和包含序列SEQ ID NO :105的VL区，或c)所述任一抗体的变体，其中所述变体在所述序列中优选地具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
38.权利要求114中任一项的抗体，其中所述抗体-不与包括包含序列SEQ ID NO 9的VH区及包含序列SEQ ID NO 65的VL区的抗体竞争组织因子结合，并且-与包括包含序列SEQ ID NO 37的VH区及包含序列SEQ ID NO 93的VL区的抗体竞争组织因子结合。
39.权利要求38的抗体，其中所述抗体包括这样的VH⑶R3区，其具有a)如下所示的序列 -SEQ ID No 32, -SEQ ID No 36, -SEQ ID No 40, -SEQ ID No 56, 或者b)所述任一序列的变体，例如具有最多1、2或3个氨基酸修饰，优选替换，例如保守替换的变体。
40.权利要求1或38的抗体，其中该抗体包括a)包含CDRl，2禾口3序列SEQ ID NO 30，31禾口 32的VH区，和包含CDRl，2禾口 3序列SEQ ID NO 86,87 和 88 的 VL 区，b)包含CDR1，2和3序列SEQID NO :34，；35和36的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO 90,91 和 92 的 VL 区，c)包含CDRl，2禾口3序歹Ij SEQ ID NO 38，39禾口 40的VH区，和包含CDRl，2禾口 3序列SEQ ID NO 94,95 和 96 的 VL 区，d)包含CDR1，2和3序列SEQID NO 54，55和56的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO :110,11 和 112 的 VL 区，或e)所述任一抗体的变体，其中所述变体优选地在所述序列中具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
41.权利要求38的抗体，其包含这样的VH，所述VHa)与选自SEQID NO :29，33，37和53的VH区序列具有至少80%同一性，例如至少 90 %，至少95 %，或者至少98 %或100 %同一性，或者b)与选自SEQID NO : ，33，37和53的VH区序列相比具有最多20个，例如15个，或者10个，或者5、4、3、2或1个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
42.权利要求38的抗体，其包含这样的VL，所述VLa)与选自SEQID NO =85,89,93和109的VH区序列具有至少80%同一性，例如至少 90%，至少95%，或者至少98%或100%同一性，或者b)与选自SEQID NO :85，89，93和109的VH区序列相比具有最多20个，例如15个， 或者10个，或者5、4、3、2或1个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
43.权利要求38的抗体，其包括a)包含序歹IjSEQ ID NO 29的VH区和包含序列SEQ ID NO 85的VL区，b)包含序列SEQID NO 33的VH区和包含序列SEQ ID NO 89的VL区，c)包含序列SEQID NO 37的VH区和包含序列SEQ ID NO 93的VL区，d)包含序列SEQID NO 53的VH区和包含序列SEQ ID NO :109的VL区，或e)所述任一抗体的变体，其中所述变体在所述序列中优选地具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
44.前述权利要求I-M中任一项的抗体，其中所述抗体与包括包含序列SEQID N0:41 的VH区和包含序列SEQ ID NO 97的VL区的抗体竞争组织因子结合。
45.权利要求44的抗体，其中所述抗体包括这样的VH⑶R3区，其具有a)如下所示的序列-SEQ ID No 4,-SEQ ID No 44,-SEQ ID No 48,或者b)所述任一序列的变体，例如具有最多1、2或3个氨基酸修饰，优选替换例如保守替换的变体。
46.权利要求1或44的抗体，其中该抗体包括a)包含CDRl，2和3序列SEQID NO :2，3禾口 4的VH区，和包含CDRl，2和3序列SEQ ID NO 58,59 和 60 的 VL 区，b)包含CDR1，2和3序列SEQID NO :42，43和44的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO 98,99 和 100 的 VL 区，c)包含CDR1，2和3序列SEQID NO 46，47和48的VH区，和包含CDR1，2和3序列SEQ ID NO 102,103 禾口 104 的 VL 区，或者d)所述任一抗体的变体，其中所述变体优选地在所述序列中具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
47.权利要求44的抗体，其包括这样的VH，所述VHa)与选自SEQID NO :1，41和45的VH区序列具有至少80%同一性，例如至少90%， 至少95%，或者至少98%或100%同一性，或者b)与选自SEQID NO :1，41和45的VH区序列相比具有最多20个，例如15个，或者10 个，或者5、4、3、2或1个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
48.权利要求44的抗体，其包括这样的VL，所述VLa)与选自SEQID NO :57，97和101的VL区序列具有至少80%同一性，例如至少90%， 至少95%，或者至少98%或100%同一性，或者b)与选自SEQID N0:57，97和101的VH区序列相比具有最多20个，例如15个，或者 10个，或者5、4、3、2或1个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
49.权利要求44的抗体，包括a)包含序列SEQID NO 1的VH区和包含序列SEQ ID NO 57的VL区，b)包含序列SEQID NO :41的VH区和包含序列SEQ ID NO 97的VL区，c)包含序列SEQID NO 45的VH区和包含序列SEQ ID NO :101的VL区，或者d)所述任一抗体的变体，其中所述变体在所述序列中优选地具有最多1、2或3个氨基酸修饰，更优选氨基酸替换，例如保守氨基酸替换。
50.权利要求1-5中任一项的抗体，其中当用本文实施例22中所述的方法进行测定时， 该抗体对组织因子的亲和力小于5nM，例如小于3. 5nM，例如小于2nM。
51.权利要求1-5中任一项的抗体，其中当用本文实施例22中所述的方法进行测定时， 该抗体的kd大于KT3sec-1,和/或当用本文实施例22中所述的方法进行测定时，该抗体的 ka 大于 5xl04mol 1Sec 1O
52.权利要求1-5中任一项的抗体，其中当用本文实施例22中所述的亲和力方法进行测定时，该抗体的kd大于K^sec—1，并且当用本文实施例22中所述的亲合力方法进行测定时，该抗体的亲合力小于5nM，例如小于InM，例如小于0. 2nM。
53.权利要求1-5或51或52中任一项的抗体，其中该抗体与健康组织不显示结合，特别是与人肾小球不显示结合，例如用实施例23中所述的测定方法测得；但是与胰腺肿瘤显示结合，例如用本文实施例23中所述的测定方法测得。
54.权利要求1-5或51-53中任一项的抗体，其中当用本文实施例沈中所述的方法进行测定时，该抗体可有效抑制已建立的BX-PC3肿瘤的生长。
55.前述权利要求中任一项的抗体，其中该抗体进一步具有一种或多种如下性质抑制增殖、抑制肿瘤血管发生、诱导肿瘤细胞凋亡、与可变剪接的组织因子结合。
56.权利要求1-5中任一项的抗体，其与包含下列的抗体竞争组织因子结合a)包含序列SEQIDNO:9的VH区和包含序歹Ij SEQ ID NO 65的VL区，b)包含序列SEQIDNO1的VH区和包含序列SEQ ID NO 57的VL区，C)包含序列SEQIDNO:5的VH区和包含序列SEQ ID NO 61的VL区，d)包含序列SEQIDNO13的VH区和包含序列SEQIDNO69的VL区，e)包含序列SEQIDNO17的VH区和包含序列SEQIDNO73的VL区，f)包含序列SEQIDNO21的VH区和包含序列SEQIDNO77的VL区，g)包含序列SEQIDNO25的VH区和包含序列SEQIDNO81的VL区，h)包含序列SEQIDNO29的VH区和包含序列SEQIDNO85的VL区，i)包含序列SEQIDNO33的VH区和包含序列SEQIDNO89的VL区，j)包含序列SEQIDNO37的VH区和包含序列SEQIDNO93的VL区，k)包含序列SEQIDNO41的VH区和包含序列SEQIDNO97的VL区，1)包含序列SEQIDNO45的VH区和包含序列SEQIDNO101 的 VL 区，m)包含序列SEQIDNO49的VH区和包含序列SEQIDNO105的VL区，或者η)包含序列SEQIDNO53的VH区和包含序列SEQIDNO109 的 VL 区。
57.权利要求1-5中任一项的抗体，其与具有下述的抗体结合组织因子上的相同表位包含序歹Ij SEQ ID NO 9的VH区和包含序列SEQ ID NO 65的VL区， 包含序列SEQ ID NO 1的VH区和包含序列SEQ ID NO 57的VL区， 包含序列SEQ ID NO 5的VH区和包含序列SEQ ID NO :61的VL区， 包含序列SEQ ID NO 13的VH区和包含序列SEQ ID NO 69的VL区， 包含序列SEQ ID NO 17的VH区和包含序列SEQ ID NO 73的VL区， f)包含序歹Ij SEQ ID NO :21的VH区和包含序列SEQ ID NO 77的VL区，g)包含序列SEQIDNO25的VH区和包含序歹Ij SEQIDNO81的VL区，h)包含序列SEQIDNO29的VH区和包含序歹Ij SEQIDNO85的VL区，i)包含序列SEQIDNO33的VH区和包含序歹Ij SEQIDNO89的VL区，j)包含序列SEQIDNO37的VH区和包含序歹Ij SEQIDNO93的VL区，k)包含序列SEQIDNO:41的VH区和包含序歹Ij SEQIDNO97的VL区，1)包含序列SEQIDNO45的VH区和包含序列SEQIDNO101 的 VL 区，m)包含序列SEQIDNO49的VH区和包含序列SEQIDNO105的VL区，或者η)包含序列SEQIDNO53的VH区和包含序歹Ij SEQIDNO109 的 VL 区。
58.前述权利要求中任--项的抗体，其中该抗体包括-源自选自下组的人种系Vh序列的重链可变区IGHV1-18*01，IGHV3_23*01， IGHV3-30*01， IGHV3-33*01， IGHV3_33*03， IGHV1_69*02， IGHV1_69*04 和 IGHV5_51*01，和 /或-源自选自下组的人种系Vk序列的轻链可变区IGKV3-20*01，IGKV1_13*02， IGKV3-11*01和 IGKV1D-16*01。
59.前述权利要求中任一项的抗体，其中该抗体是全长抗体，优选IgGl抗体，特别是 IgGl，κ 抗体。
60.前述权利要求中任一项的抗体，其中该抗体偶联于另一部分，例如细胞毒部分、放射性同位素或药物。
61.权利要求1-3或15-49中任一项的抗体，其中该抗体是效应物功能缺陷抗体。
62.权利要求61的抗体，其中该效应物功能缺陷抗组织因子抗体是稳定化的人IgG4 抗体，例如其中人IgG4重链恒定区409位精氨酸被替换为赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸，优选赖氨酸，和/或其中铰链区包括Cys-ftO-Pro-Cys序列的抗体。
63.权利要求1-3或15-49中任一项的抗体，其中该抗体是单价抗体。
64.权利要求63的抗体，其中所述单价抗体用如下方法构建，其包括i)提供编码所述单价抗体轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和编码Ig之恒定CL区的核苷酸序列，其中所述编码选定的抗原特异性抗体之VL区的核苷酸序列和所述编码Ig之CL区的核苷酸序列可操作地连接在一起，并且其中，在IgGl亚型的情况下，编码所述CL区的核苷酸序列经过修饰，使得所述CL 区不含有任何如下所述的氨基酸在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸能够与其它包含与该CL区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或共价键； )提供编码所述单价抗体重链的核酸构建体，所述构建体包含编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和编码人Ig之恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列经过修饰，使得相应于铰链区的区域，以及如Ig亚型所要求的CH区的其它区域， 如CH3区，不含有任何如下所述的氨基酸残基在存在多克隆人IgG的条件下或者当施用于动物或人类时，所述氨基酸残基参与同其它包含与人Ig之CH区相同的氨基酸序列的肽形成二硫键或者共价或稳定非共价的重链间键，其中该编码选定的抗原特异性抗体之VH区的核苷酸序列和该编码所述Ig之CH区的核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。
65.权利要求63的抗体，其中该单价抗体包括(i)权利要求1-26的抗体的可变区或所述区的抗原结合部分，和( )免疫球蛋白Ch区或其包括Ch2和Ch3区的片段，其中该Ch区或其片段已被修饰， 从而使相当于铰链区的区域，以及，如果免疫球蛋白不是IgG4亚型，Ch区的其它区域，例如 Ch3区，不含有任何在多克隆人IgG存在下能够与相同的Ch区形成二硫键或者与相同的Ch 区形成其它共价或稳定非共价重链间键的氨基酸残基。
66.权利要求63-65中任一项的抗体，其中该重链已被修饰，使得整个铰链已被删除。
67.一种双特异性分子，包括权利要求1-62中任一项的抗体以及第二结合特异性，例如对人效应物细胞、人Fc受体或T细胞受体的结合特异性。
68.一种表达载体，包括编码选自SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :112的一个或多个氨基酸序列的核苷酸序列。
69.根据权利要求68的表达载体，进一步包括编码人抗体的轻链恒定区、重链恒定区、 或轻链和重链二者的恒定区的核苷酸序列。
70.一种重组真核或原核宿主细胞，其产生如权利要求1-59或61-66中任一项所限定的抗体。
71.—种药物组合物，其包含如权利要求I-M中任一项限定的抗体，或者如权利要求 67所限定的双特异性分子，以及药学可接受的载体。
72.如权利要求1-66中任一项限定的抗体或如权利要求67中所限定的双特异性分子， 其用于作为药物的用途。
73.权利要求72的抗体或双特异性分子，其中该用途是用于治疗癌症。
74.权利要求73的抗体或双特异性分子，其中该癌症选自下组中枢神经系统肿瘤、头颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、肝和胆癌、胰腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、 子宫内膜癌、卵巢癌、恶性黑素瘤、肉瘤、原始起源不明的肿瘤、骨髓癌、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、神经胶质瘤、脑的癌症、子宫的癌症和直肠的癌症。
75.权利要求72的抗体或双特异性分子，其中该用途是用于治疗胰腺癌。
76.权利要求72的抗体或双特异性分子，其中该用途是用于治疗结肠直肠癌。
77.权利要求72的抗体或双特异性分子，其中该用途是用于治疗卵巢癌。
78.权利要求72的抗体或双特异性分子，其中该用途是用于治疗乳腺癌。
79.权利要求72的抗体或双特异性分子，其中该用途是用于治疗前列腺癌。
80.权利要求72的抗体或双特异性分子，其中该用途是用于治疗膀胱癌。
81.权利要求72的抗体或双特异性分子，其中该药物用于与一种或多种其它治疗剂如化疗剂组合治疗癌症。
82.权利要求1-66中任一项的抗体或权利要求697的双特异性分子在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
83.权利要求82的用途，其包含权利要求中74-81任一项的附加特征。
84.一种用于抑制表达组织因子的肿瘤细胞的生长和/或增殖的方法，包括向有需要的个体施用权利要求1-66中任一项的抗体或如权利要求67所限定的双特异性分子。
85.一种用于产生权利要求1-59或61-66中任一项的抗体的方法，所述方法包括如下步骤a)培养权利要求70的宿主细胞，和b)从培养基中纯化抗体。
86.一种诊断用组合物，包含如权利要求1-67中任一项限定的抗体。
87.一种用于检测样品中组织因子之存在的方法，包括-使样品与权利要求1-66任一项的抗体或权利要求67的双特异性分子在允许所述抗体或双特异性分子同组织因子之间形成复合体的条件下接触；和 -分析是否形成了复合体。
88.一种用于检测样品中组织因子之存在的试剂盒，包括-权利要求1-66中任一项的抗体或权利要求67的双特异性分子；和 -使用该试剂盒的说明。
全文摘要
公开了与人TF结合的分离的人单克隆抗体和基于抗体的相关组合物和分子。还公开了包括该抗体的药物组合物，以及使用该抗体的治疗和诊断方法。
文档编号A61P35/00GK102317319SQ200980156348
公开日2012年1月11日 申请日期2009年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者伊娃.埃恩鲁思, 保罗.帕伦, 勒内.M.A.霍伊特, 奥利.巴德斯加德, 威廉.K.布利克, 戴维.P.E.萨廷, 桑德拉.弗普洛根, 汤姆.文克, 米沙.霍特坎普, 维比克.M.布雷恩霍尔特, 罗布.N.德琼格, 詹.范德温克尔, 马罗斯卡.奥德肖恩 申请人:根马布股份公司