专利名称：重组人类偏肺病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及病毒疫苗，具体涉及重组人类偏肺病毒疫苗。
背景技术：
人类偏肺病毒(Human Metapneumovirus，hMPV)为荷兰学者于2001年首次在儿童 呼吸道感染标本中分离得到的一种新的呼吸道病原体。hMPV是长约131Λ的单负链非节段 RNA病毒，包含编码核衣壳蛋白(N)、核包膜磷酸化蛋白(P)、非糖化基质蛋白(M)、融合蛋白
(F)、转录延长因子(M2.1)、RNA合成调节因子(M2. 2)、小疏水表面蛋白(SH)、主要粘附蛋白
(G)、主要聚合酶亚单位(L)基因，顺序为3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’。hMPV基因结构和序 列均与禽偏肺病毒(APV)相似，最接近于APV-C亚型，氨基酸同源性高达80%。该病毒可导致人的上下呼吸道感染，其临床特征类似于RSV(呼吸道合胞病毒)， 主要症状包括咳嗽、咽痛、呼吸困难、缺氧、喘息等。有报道hMPV是老人、儿童、免疫缺陷者 严重呼吸道感染疾病的常见病原体。人类偏肺病毒已发现之后，亚洲、北美洲、欧洲、南美洲、非洲、大洋洲均有其感染 的流行病学报告，呈现全球流行趋势。在中国重庆和北京也有关于hMPV感染的报道。血 清学研究表明hMPV已经在人群流行50年以上，大多数人在5岁时均已感染过hMPV，4 10. 8%的呼吸道感染住院患儿与hMPV有关。hMPV可同其他一些病原体合并感染，如RSV， SARS-CoV (严重急性呼吸综合征冠状病毒)。由此可见，hMPV是一种常见的呼吸道病原体， 该病毒疫苗对于预防该病毒感染具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供重组人类偏肺病毒疫苗，它能用于预防人类感染人类偏肺病 毒，特别是老人、儿童、免疫缺陷者感染人类偏肺病毒。本发明所述的重组人类偏肺病毒疫苗，包括对人类偏肺病毒F基因的第57位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获得 的重组人类偏肺病毒活疫苗N57H ；即将人类偏肺病毒F基因的第57位相对应的氨基酸_天 冬酰胺(Asn，N)变为组氨酸(His，H)，氨基酸密码子由AAC变为CAC ；对人类偏肺病毒F基因的第172位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获 得的重组人类偏肺病毒活疫苗W72H ；即将人类偏肺病毒F基因的第172位相对应的氨基 酸-天冬酰胺(Asn，N)变为组氨酸(His，H)，氨基酸密码子由AAT变为CAT ；对人类偏肺病毒F基因的第353位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获 得的重组人类偏肺病毒活疫苗N353H ；即将人类偏肺病毒F基因的第353位相对应的氨基 酸-天冬酰胺(Asn，N)变为组氨酸(His，H)，氨基酸密码子AAC变为CAC ；上述氨基酸密码子中的A代表腺嘌呤脱氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸、C 代表胞嘧啶脱氧核苷酸、G代表鸟嘌呤脱氧核苷酸；还包括对人类偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位中的任意两位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获得的重组人类偏肺病毒活疫苗N57H+N172H， N57H+N353H, N172H+N353H ；还包括对人类偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位同时进行体外定点 突变和反向遗传(病毒拯救)获得的重组人类偏肺病毒活疫苗N57H+N172H+N353H。所述的重组人类偏肺病毒疫苗，是将获得的7种人类偏肺病毒分别在Vero-E6细 胞(非洲绿猴肾细胞株)培养繁殖而获得的病毒纯化液，每Iml疫苗含有不少于IO5蚀斑 形成单位(PFU)的人类偏肺病毒。所述的重组人类偏肺病毒疫苗，为N57H、N172H, N353H、N57H+N172H、N57H+N353H、 N172H+N353H.N57H+N172H,N57H+N353H,N172H+N353H7 种重组人类偏肺病毒疫苗中的一种， 或者为其中两种以上的重组人类偏肺病毒疫苗组合而成的混合病毒疫苗。所述的重组人类偏肺病毒疫苗的制备方法如下(1)从临床病人的鼻咽分泌液中分离获得人类偏肺病毒；取病人鼻咽分泌物，保存于2ml标本转移液中，置于冰上，2小时内转移至实验室； 混勻分泌物，在离心机上以1000转/分钟的转速，离心10分钟，弃去上清，再加入2ml硫酸 缓冲液重新悬浮沉淀；将上述2ml重悬液，用QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取试剂(德 国 QIAGEN 公司)提取 RNA，再用 PrimeScriptTM RT Reagent Kit 逆转录试剂(日本 TAKARA 公司)逆转录为cDNA，然后，扩增获得人类偏肺病毒F基因；(2)对人类偏肺病毒F基因进行体外定点突变；采用美国Mratagene公司的定点突变检测试剂盒，将人类偏肺病毒F基因的第57 位、172位、353位的氨基酸-天冬酰胺(Asn，N)变为组氨酸(His，H)；即人类偏肺病毒F基 因的第57位相对应的氨基酸密码子由AAC变为CAC、人类偏肺病毒F基因的第172位相对 应的氨基酸密码子由AAT变为CAT、人类偏肺病毒F基因的第353位相对应的氨基酸密码子 由AAC变为CAC ；上述氨基酸密码子中的A代表腺嘌呤脱氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸、C 代表胞嘧啶脱氧核苷酸、G代表鸟嘌呤脱氧核苷酸；通过以上步骤，获得上述位点的人类偏肺病毒F基因体外定点突变，即需要改变 的氨基酸；通过第一轮的PCR反应，获得改变后的F基因一N57H，W72H，N353H。然后， 在此基础上进行第二轮的PCR反应获得改变后的F基因一N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H ；最后，在第二轮产物的基础上再进行PCR反应获得3个点均突变的改变后的 F 基因一N57H+N172H+N353H ；将上述体外定点突变后获得的含有7种改变后的F基因转入荷兰Erasmus Institute的Rmchier教授处获得的人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体(该表达
=Herfst S, De Graaf Μ, Schickli JH, et al. Recovery of human metapneumovirus geneticlineages A and B from cloned cDNA. J Virol,2004,78(15) 8264-8270.)。(3)利用反向遗传系统获得重组人类偏肺病毒疫苗；采用上述获得的7种改变后的人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体，再利用反向 遗传系统(Reverse Genetics Systems)或称为病毒拯救(Virus Rescue)的方法获得7种重组人类偏肺病毒，作为人类偏肺病毒的活疫苗。本发明为预防人类感染人类偏肺病毒提供了疫苗，特别适用于老人、儿童、免疫缺 陷者预防感染人类偏肺病毒。每年在冬春季节，即人类偏肺病毒感染的高发季节，作为预防 人类偏肺病毒感染使用。
具体实施例方式本发明所述的重组人类偏肺病毒疫苗的制备方法如下(1)从临床病人的鼻咽分泌液中分离获得人类偏肺病毒；取病人鼻咽分泌物，保存于2ml标本转移液中，置于冰上，2小时内转移至实验室； 混勻分泌物，在离心机上以1000转/分的转速，钟离心10分钟，弃去上清，再加入2ml硫酸 缓冲液重新悬浮沉淀；(标本转移液即用于收集鼻咽分泌物的病毒运送介质。配制方法1、加入IOg牛 肉汤和2g牛血清蛋白到的400ml的重蒸馏水中。2、加入0. 8ml庆大霉素硫酸盐溶液(50mg/ ml)和3. 2ml两性霉素B Q50 μ g/ml)。3、过滤消毒。)将上述2ml重悬液，用QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取试剂(德国QIAGEN公 司生产)提取RNA，再用PrimeScriptTM RT Reagent Kit逆转录试剂(日本TaKaRa公司) 逆转录为cDNA，然后，用下述引物扩增人类偏肺病毒F基因；其上下游引物分别为上游引物MPVF 5' -ATGTCTTGGAAAGTGATG-3‘下游引物MPVR 5' -CTAACTATGCGGTATAAAAC-3‘PCR反应体系为北京天根生化科技有限公司的PCR反应预混试剂QXTaq PCRMasterMix,目录号KT201_02) 25 μ L，上、下游引物(10pmol/yL)各 2 μ L，cDNA 5μ L, 灭菌超纯水补足50 μ L ；PCR 反应条件94°C预变性 5min ;94°C 30s,55°C 45s, 72°C 30s，30 个循环；72°C 终延伸lOmin。取5yL PCR产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳观察结果，获得的产物即为人类 偏肺病毒F基因；其序列为atgtcttggaaagtgatgattatcatttcgttactcataa cacctcagcatggactaaaa60gaaagttatttagaagaatcatgtagtactataactgaag gatatctcagtgttttaaga120acaggttggtacaccaatgtctttacattagaagttggtg atgttgaaaaccttacatgt180actgatggacctagcttaatcaaaacagaacttgacctaa ccaaaagtgctctaagagaa240ctcaaaacagtttctgctgatcagttagcgggagaagaacaaattgaaaatcccagacaa300tcaaggtttgtcctaggtgcaatagctctcggtgttgccacagcagcagcagtcacagca360ggcattgcaatagccaaaaccataaggcttgagagtgaagtgaatgcaatcaaaggtgct420ctcaaaacaaccagcgaggcagtatccacactaggaaatggagtgcgagtcctagccacc480gcagtaagagagctgaaagaatttgtgagcaaaaacctgactagtgcaattaacaagaac540aaatgtgacattgctgatctgaagatggctgtcagcttcagtcaattcaacagaaggttc600ctaaatgttgtgcggcagttttcagacaatgcagggataacaccagcaatatcattggac660ctaatgactgatgctgagctggccagagctgtatcatacatgccaacatcagcaggacag720ataaaactaatgttagagaaccgtgcaatggtgaggagaaaaggatttggaatcttgata780
ggggtctacggaagctccgtgatttacatggtccagctgccgatctttggtgtcatagat840
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acaggggcacctccagagctgaatggtgttaccaacggcggttttataccgcatagttag1620 ο
上述人类偏肺病毒F基因翻译成F蛋白后的序列为
MSffKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGffYTNVFTL 50 EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100 SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150 LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200 LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250 VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300 CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC 350 NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400 KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450 FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500 LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539
(2)对人类偏肺病毒F基因进行体外定点突变；
通过前期的生物信息学方法预测和实验研究，发现通过将人类偏肺病毒F基因的 第57位、第172位和第353位氨基酸突变后并利用反向遗传系统获得重组人类偏肺病毒， 再经过对其抗原性和免疫原性进行研究，发现经过以上3个位点的改变后的病毒，适合用 作活疫苗。所以，选取了以上3个位点来进行体外定点突变；将人类偏肺病毒F基因的第57位、172位、353位的氨基酸-天冬酰胺(Asn，N)变 为组氨酸(His，H)；即人类偏肺病毒F基因的第57位相对应的氨基酸密码子由AAC变为 CAC、人类偏肺病毒F基因的第172位相对应的氨基酸密码子由AAT变为CAT、人类偏肺病毒 F基因的第353位相对应的氨基酸密码子由AAC变为CAC ；上述氨基酸密码子中的A代表腺嘌呤脱氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸、C 代表胞嘧啶脱氧核苷酸、G代表鸟嘌呤脱氧核苷酸；然后，采用美国Mratagene公司的定点突变检测试剂盒，对获得的人类偏肺病毒 F基因体外定点突变(该试剂盒可对某个已知基因的特定碱基进行定点突变，从而可以改变对应氨基酸序列和蛋白质结构)，获得上述需要改变的氨基酸；具体体外定点突变方法如下针对人类偏肺病毒F蛋白第57位、第172位和第353 位的氨基酸，突变使用 QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene) 进行定点突变，设计3对引物进行反应(加粗为突变后的碱基)第57位突变引物为00-57 F :5’ -GGTAGGCGATGTAGAGCAGCTTACATGTGCCGATGG-3，00-57 R :5’ -CCATCGGCACATGTAAGCTGCTCTACATCGCCTACC-3，第172位突变引物为00-172 F :5’ -GATTTTGTGAGCAAGCAGCTAACACGTGCAATCAAC-3，00-172 R :5’ -GTTGATTGCACGTGTTAGCTGCTTGCTCACAAAATC-3’第353位突变引物为00-353F :5’ -GCAGTCAAAGGAGTGCAACATACAGATATCTACTACTAATTACCC-3’00-353R :5’ -GGGTAATTAGTAGTAGATATCTGTATGTTGCACTCCTTTGACTGC-3’PCR反应体系为北京天根生化科技有限公司的PCR反应预混试剂QXTaq PCRMasterMix,目录号KT201_02) 25 μ L，上、下游引物(10pmol/yL)各 2 μ L，cDNA 5μ L, 灭菌超纯水补足50 μ L ；PCR 反应条件94°C预变性 5min ;94°C 30s,55°C 45s, 72°C 30s，30 个循环；72°C 终延伸lOmin。取5μ L PCR产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳观察结果；通过第一轮的PCR反应，获得改变后的F基因一Ν57Η，W72H，Ν353Η。然后， 在此基础上进行第二轮的PCR反应获得改变后的F基因一N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H ；最后，在第二轮产物的基础上再进行PCR反应获得3个点均突变的改变后的 F 基因一N57H+N172H+N353H ；通过上述方法即获得7种改变后的F基因(F基因的改变位点分别为N57H， N172H, N353H, N57H+N172H, N57H+N353H, N172H+N353H, N57H+N172H+N353H)；在以上方法的基础上，将从荷兰Erasmus Institute的Rmchier教授处获得的 人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体(该表达载体的具体情况参见=Herfst S，De Graaf M, Schickli JH, et al. Recovery of human metapneumovirus genetic lineages A and B fromcloned cDNA. J Virol, 2004, 78 (15) :8264-8270.)，通过上述体外定点突变后获得 含有7种改变后的F基因(F基因的改变位点分别为:N57H, N172H, N353H, N57H+N172H, N57H+N353H, N172H+N353H, N57H+N172H+N353H)的人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体。这7种人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体，其中含有的F基因的蛋白序列为以 下7种第一种MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300
CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第二种MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第三种MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第四种MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGN GVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350
9
NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第五种MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVEHITCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NI HISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第六种MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539第七种MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC 350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539
(3)利用反向遗传系统获得重组人类偏肺病毒疫苗；采用上述获得的7种改变后的人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体，再利用反向 遗传系统(Reverse Genetics Systems)或称为病毒拯救(Virus Rescue)的方法获得7种 重组人类偏肺病毒，作为人类偏肺病毒的活疫苗，用于预防感染人类偏肺病毒；具体的病毒拯救办法如下所述细胞与质粒BSR_T7细胞(稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞株)培养于含0. 5mg/ mL G418( —种氨基糖类抗生素)和5% (体积百分比)胎牛血清的DMEM(DulbeCC0 ‘ s Modified EagleMedia)培养基中；VeroE6细胞(非洲绿猴肾细胞)培养于含100IU/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素的 和5%胎牛血清的DMEM中；病毒培养液为含5% (体积百分比)胎牛血清和0. 25mg/mL胰酶的DMEM ；7种偏肺病毒全基因组cDNA表达载体及其N、P、L和M2. 1基因的4个表达载体 (pCITE-N、pCITE-P、pCITE-L 和 pCITE_M2. 1)由荷兰 Erasmus Institute 的 Fouchier 教 授惠赠；表达载体的具体情况及相关方法参考以下文献=Herfst S，De Graaf M，Schickli JH,et al. Recoveryof human metapneumovirus genetic lineages A and B from cloned cDNA.J Virol,2004,78 (15) :8264_8270。主要试剂DMEM培养基、G418和胎牛血清、转染试剂Lipofectamine 2000、 opti-MEM I培养基(低血清培养基)均购自美国^witrogen公司；质粒抽提试剂盒 (QIAGEN Plasmid MidiKit)为德国QIAGEN公司产品；鼠源hMPV F蛋白单克隆抗体购自美 国Chemicon公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为北京中杉金桥公司产品；取3μ g全基因组cDNA表达载体，辅助蛋白质粒pCITE_N、pCITE_L、pCITE_P、 PCITE-M2. 1 分另Ij 0· 3 μ g、0. 15 μ g、0. 3 μ g 和 0. 24 μ g,稀释到 250 μ L opti-MEM I 培养基 中，混合均勻；另将10μ L Lipofectamine 2000稀释到250 μ L opti-MEM I培养基中，室 温下混合5min ；然后，将稀释的质粒和Lipofectamine 2000溶液混合Q50 μ L+250 μ L)， 室温结合20min，以形成DNA-Lipofectamine 2000复合物；将6孔板中培养的BSR-T7 细胞吸去培养液，用无血清、无抗生素的DMEM液洗板2次，随即向每一孔中加入质粒和 Lipofectamine 2000的混合液500 μ L，摇勻。在37°C、5% CO2孵箱中培养约5小时，吸掉 含有质粒和Lipofectamine 2000的混合液，换为病毒培养液^il，继续在37°C、5% CO2孵 箱中培养，获得重组人类偏肺病毒疫苗。重组人类偏肺病毒疫苗的使用和储存条件-80°C，避光保存。疫苗使用前，仍应在 2-8°C避光保存。且在1小时内使用。使用人群适用于出生15个月以上的人群，免疫预防人类偏肺病毒感染。用法用量0. Iml/次，滴鼻。每年在冬春季节，即人类偏肺病毒感染的高发季节， 作为预防人类偏肺病毒感染使用。疫苗名称通用名重组人类偏肺病毒疫苗英文名禾尔Recombinant Human Metapneumovirus Vaccine汉语拼音Chongzu Renlei Pianfei Bingdu Yimiao成份和性状疫苗由重组人类偏肺病毒F蛋白57位、172位和353位氨基酸改变 后获得的 N57H，N172H, N353H, N57H+N172H, N57H+N353H, N172H+N353H, N57H+N172H+N353H, 7种重组病毒单个或相互混合组成。重组病毒经在Vero-E6细胞(非洲绿猴肾细胞株)培养 繁殖、病毒液收获、病毒液浓缩、病毒纯化等工序配制而成。用于预防人类偏肺病毒感染。接种对象适用于出生15个月以上的人群，特别是儿童、成人及老年人。作用与用途用于预防人类偏肺病毒感染。规格每支0.Iml。0. Iml含人类偏肺病毒不少于104蚀斑形成单位(PFU)。免疫程序和剂量接种部位鼻腔。接种剂量免疫为2次，每次免疫剂量分别为 0. 05ml,0. 1ml,间隔 21 天。禁忌1.对本疫苗其他成分过敏者或有其它过敏史者禁用本品。2.发热、患急性 疾病、慢性疾病的急性发作者及感冒者禁用本品。3.有格林巴利综合征病史者禁用本品。 4.严禁静脉注射。5.严禁分次使用。注意事项疫苗必须避光_80°C保存，疫苗使用前，仍应在2_8°C避光保存，且在1 小时内使用。孕妇及哺乳期妇女用药孕妇及哺乳期妇女应慎用。药物相互作用可与其他疫苗同时接种，但应接种在不同部位。使用免疫抑制剂 可能影响接种后的免疫效果，为避免可能的药物间相互作用，最好不同时使用。贮藏_80°C，避光保存。疫苗使用前，仍应在2_8°C避光保存。且在1小时内使用。包装1支/盒。低密度聚乙烯塑料瓶包装，0.Iml/支。序列表SEQUENCE LISTING<110>重庆医科大学附属儿童医院赵晓东赵耀<120>重组人类偏肺病毒疫苗<160>9<210>1<211>1620<212>DNA<213>偏月市病毒属(Metapneumovirus genus.)<220><22DHuman Metapneumovirus<400>1atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaagaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaagaacaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgtactgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaactcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaatcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagcaggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgctctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccaccgcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taacaagaac
60 120 180 240 300 360 420 480 540
aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600
ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660
ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc agcaggacag 720
ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780
ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840
acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900
tgcctcctaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960
ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg1020
atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca1080
tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct1 140
ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc1200
aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt1260
gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga1320
ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt1380
gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt1440
ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt1500
cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc1560
acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag1620
<2 10>2
<211>539
<2 l 2>PRT
<213>偏肺病毒属(Metapneum。ViruS genus．)
<22l>Human MetaDneum。ViruS
<400>2
MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGwYTNVFTL50
EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100
SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKK／NEAVS／150
LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200
LNVVRQFSDNAGI／PAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250
VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCwIVKAAPSCSGKKGNYA300
CLLREDQGwYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350
NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400
KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450
FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVI ILIAV500
LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539
<2 10>3
<211>539
<2 l 2>PRT
<213>人I序列
<221>重组人类偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>3MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC 350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>4<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重组人类偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>4MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF 200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM 250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA 300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC 350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII 400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK 450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV 500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>5<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重组人类偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>5MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL 50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ 100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST 150
LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>6<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重组人类偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>6MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NINISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>7<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重组人类偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>7MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVEHLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKNLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400
KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>8<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重组人类偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>8MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVENLTCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539<210>9<211>539<212>PRT<213>人工序列<221>重组人类偏肺病毒F基因氨基酸序列<400>9MSWKVVIIFSLLITPQHGLKESYLEESCSTITEGYLSVLRTGWYTNVFTL50EVGDVEHITCADGPSLIKTELDLTKSALRELRTVSADQLAREEQIENPRQ100SRFVLGAIALGVATAAAVTAGVAIAKTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVST150LGNGVRVLATAVRELKDFVSKHLTRAINKNKCDIADLKMAVSFSQFNRRF200LNVVRQFSDNAGITPAISLDLMTDAELARAVSNMPTSAGQIKLMLENRAM250VRRKGFGFLIGVYGSSVIYMVQLPIFGVIDTPCWIVKAAPSCSGKKGNYA300CLLREDQGWYCQNAGSTVYYPNEKDCETRGDHVFCDTAAGINVAEQSKEC350NIHISTTNYPCKVSTGRHPISMVALSPLGALVACYKGVSCSIGSNRVGII400KQLNKGCSYITNQDADTVTIDNTVYQLSKVEGEQHVIKGRPVSSSFDPVK450FPEDQFNVALDQVFESIENSQALVDQSNRILSSAEKGNTGFIIVIILIAV500LGSTMILVSVFIIIKKTKKPTGAPPELSGVTNNGFIPHN539
权利要求
1.重组人类偏肺病毒疫苗，包括对人类偏肺病毒F基因的第57位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获得的 重组人类偏肺病毒活疫苗N57H ；即将人类偏肺病毒F基因的第57位相对应的氨基酸_天 冬酰胺变为组氨酸，氨基酸密码子由AAC变为CAC ；对人类偏肺病毒F基因的第172位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获得的 重组人类偏肺病毒活疫苗W72H ；即将人类偏肺病毒F基因的第172位相对应的氨基酸-天 冬酰胺变为组氨酸，氨基酸密码子由AAT变为CAT ；对人类偏肺病毒F基因的第353位进行体外定点突变和反向遗传(病毒拯救)获得的 重组人类偏肺病毒活疫苗N353H ；即将人类偏肺病毒F基因的第353位相对应的氨基酸_天 冬酰胺变为组氨酸，氨基酸密码子AAC变为CAC ；上述氨基酸密码子中的A代表腺嘌呤脱氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸、C代表 胞嘧啶脱氧核苷酸、G代表鸟嘌呤脱氧核苷酸；还包括对人类偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位中的任意两位进行 体外定点突变和反向遗传获得的重组人类偏肺病毒活疫苗N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H ；还包括对人类偏肺病毒F基因的第57位、第172位、第353位同时进行体外定点突变 和反向遗传获得的重组人类偏肺病毒活疫苗N57H+N172H+N353H。
2.如权利要求1所述的重组人类偏肺病毒疫苗，其特征是将分别获得的7种人类偏肺 病毒分别在Vero-E6细胞培养繁殖而获得的病毒纯化液，每Iml疫苗含有不少于IO5蚀斑 形成单位的人类偏肺病毒。
3.如权利要求1或2所述的重组人类偏肺病毒疫苗，为N57H、N172H,N353H、 N57H+N172H、N57H+N353H、N172H+N353H、N57H+N172H，N57H+N353H, N172H+N353H7 种重组人 类偏肺病毒疫苗中的一种，或者为其中两种以上的重组人类偏肺病毒疫苗组合而成的混合 病毒疫苗。
4.重组人类偏肺病毒疫苗，其制备方法如下(1)从临床病人的鼻咽分泌液中分离获得人类偏肺病毒；取病人鼻咽分泌物，保存于2ml标本转移液中，置于冰上，2小时内转移至实验室；混勻 分泌物，在离心机上以1000转/分的转速，钟离心10分钟，弃去上清，再加入2ml硫酸缓 冲液重新悬浮沉淀；将上述2ml重悬液，用QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取试剂提取 RNA，再用PrimeScriptTM RT Reagent Kit逆转录试剂逆转录为cDNA，然后，扩增获得人类 偏肺病毒F基因；(2)对人类偏肺病毒F基因进行体外定点突变；将人类偏肺病毒F基因的第57位、172位、353位的氨基酸-天冬酰胺变为组氨酸；即 人类偏肺病毒F基因的第57位相对应的氨基酸密码子由AAC变为CAC、人类偏肺病毒F基 因的第172位相对应的氨基酸密码子由AAT变为CAT、人类偏肺病毒F基因的第353位相对 应的氨基酸密码子由AAC变为CAC ；上述氨基酸密码子中的A代表腺嘌呤脱氧核苷酸、T代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸、C代表 胞嘧啶脱氧核苷酸、G代表鸟嘌呤脱氧核苷酸；再采用定点突变检测试剂盒，获得上述位点的人类偏肺病毒F基因体外定点突变，即需要改变的氨基酸；通过第一轮的PCR反应，获得改变后的F基因——N57H, N172H, N353H。然后，在此基础上进行第二轮的PCR反应获得改变后的F基因——N57H+N172H, N57H+N353H, N172H+N353H ； 最后，在第二轮产物的基础上再进行PCR反应获得3个点均突变的改变后的F基因—— N57H+N172H+N353H ；将上述体外定点突变后获得的含有7种改变后的F基因转入人类偏肺病毒全基因组 cDNA表达载体；(3)利用反向遗传系统获得重组人类偏肺病毒疫苗；采用上述获得的7种改变后的人类偏肺病毒全基因组cDNA表达载体，再利用反向遗传 系统或称为病毒拯救的方法获得7种重组人类偏肺病毒，作为人类偏肺病毒的活疫苗。
全文摘要
本发明公开的重组人类偏肺病毒疫苗，包括重组人类偏肺病毒活疫苗N57H，重组人类偏肺病毒活疫苗N172H，重组人类偏肺病毒活疫苗N353H，重组人类偏肺病毒活疫苗N57H+N172H、N57H+N353H和N172H+N353H，重组人类偏肺病毒活疫苗N57H+N172H+N353H。本发明为预防人类感染人类偏肺病毒提供了疫苗，特别适用于老人、儿童、免疫缺陷者预防感染人类偏肺病毒。每年在冬春季节，即人类偏肺病毒感染的高发季节，作为预防人类偏肺病毒感染使用。
文档编号A61K39/155GK102145167SQ20101010667
公开日2011年8月10日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者张金辉, 窦颖, 赵晓东, 赵耀, 陈昕 申请人:赵晓东, 赵耀, 重庆医科大学附属儿童医院