专利名称：一种组织因子靶向性蛋白纳米粒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医药领域，涉及靶向性给药的纳米载体及其制备方法和应 用技术，具体涉及组织因子靶向性蛋白纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术：
随着生物学技术的提高和对疾病分子水平发病机制的进一步认识，医学界开始 了针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的诊疗，即“靶向治疗”。组织因子(tissue factor, TF)是一种分子量为47kD的跨膜糖蛋白，作为血浆凝血因子VII (FVII)的受体 启动夕卜源性 疑血过程(参见Nigel Mackman. Roleof tissue factor in hemostasis, thrombosis, and vascular development. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology2004 ；24 (2) :1015-1022.)。研究表明，TF除了在正常止血方面的作用外，其异常 表达与脑血栓、动脉粥样硬化、急性冠脉综合症、深静脉血栓、弥散性血管内凝血、炎症及肿 瘤等密切相关，日益受到广泛关注(参见Julian N. Tissue-factor-endowed leukocytes do cause thrombosis. Blood2005 ； 106 (5) : 1506-1507. Levi M，van der Poll T, Buller HR. Bidirectionalrelation between inflammation and coagulation. Circulation2004 ； 109(22) :2698-2704. ) 0有关靶向TF的研究，在血栓的诊疗领域前景十分看好。目前有 关TF及其配体的抗体研究已经在血栓的诊疗中取得了重要进展，如David等研制的作 为抗凝剂的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白能结合于损伤部位并阻止血栓形成 的启动，可用于治疗多种血栓性病变(参见Haubitz Μ, Brunkhorst R. Influence of a novel rapamycin analogon SDZRAD on endothelial tissue factor and adhesion moleculeexpression. Transplant Proc 2002 ;34:1124-1126.)。同时，有关 TF 及其 配体FVII的研究还发现FVII上类表皮生长因子I区多肽(EGFl)是与TF结合的重要配 体(参见larke BJ, Ofosu Frederick, Sridhara Sampath, et al. The first epidermal growth factor domain of human coagulation factorVII is essential for binding with tissue factor. FEBS Lettl992 ;298 :206-210.)。目前的靶向制剂多依赖于抗体介 导。IgG型抗体的分子量约为150kDa，庞大的抗体或偶联物分子难以通过毛细管内皮层和 细胞外间隙到达深部靶点，因此，研制小型化制剂对提高疗效有重要意义。另一方面，目前 大多数的单抗制剂还是非人源性的，因此难免会发生发生一些免疫反应，多年的研究表明， 鼠源性抗体在人体可诱发人抗鼠抗体(HAMA)反应(参见ThorpeSJ，Turner C，Heath A，et al. Clonal analysis of a human antimouse antibody (HAMA)response. Scand J Immunol 2003 ；57(1) :85-92.),在临床应用一般效果不佳，因此靶向材料的选择应是兼顾生物安全 性的。纳米技术是靶向制剂研究中的热门之一，在药剂学中纳米粒载体通常系指粒径 在lO-lOOOnm，特别是500nm以下的胶体体系，通过物理或化学作用包封或吸附药物，可将 药物送至身体特定部位，以恰当速度和剂量释放，实现精确给药，提高药效，降低药物的毒 副作用。纳米粒作为药物的递送载体，存在诸多的优点，如对药物的缓控释作用，能够冻干并长期保存，更好的物理和化学稳定性，因此它可作为小分子化学药物或DNA的理想载体。 在纳米材料方面，可生物降解高分子材料主要包括聚酸酐(PAH)、聚氰基丙烯酸酯(PACA)、 聚膦嗪(PP)和聚酯等，因其生物相容性好、可生物降解、能人工调控其结构和性能等优点 成为制备纳米药物载体的最好选择，其中PACA和属于聚酯类的聚乳酸(PLA)是研究的 热点(参见Davis S S. Drug delivery systems. Interdiscipl Sci Rev 2000 ；25 (3) 175-183.)。PACA曾一度广泛用于药物载体的研究，但PACA纳米粒在制备过程中采用的 是乳液聚合法，需使用大量表面活性剂，其LD50只有20mg/kg，毒性问题未能解决(参见 Kreuter J. Nanoparticulate systems for brain delivery of drugs. Adv Drug Deliv Rev2001 ；47 :65-81.)。针对上述问题，我们选用了 PLA作为制备纳米粒的基材。PLA是 典型的可生物降解聚酯，在体内先降解为小分子片段，再进一步分解为乳酸，后者进入体内 的三羧酸循环，最终代谢为CO2和H2O(参见=Nicholasa AP, McInnisa C, Guptaa K B, et al. The fate of biodegradable microspheresinjected into rat brain. Neurosci Lett 2002 ；323 :85-88.),故毒副作用极低，还具有结构和种类多、有一定机械强度和临床研究 及应用的时间长等优点。此外，纳米粒子粒表面经聚乙二醇(PEG)修饰，可避免单核巨噬系 统(MPQ的吞噬，显著延长在血浆中的半衰期，提高血浆药时曲线下面积(AUC)，具有隐形 作用。同时，PEG与PLA都是经FDA批准可用于临床的少数几种药物辅料，因子该发明的纳米 载体具有良好生物安全性[参见Adams ML, Lavasanifar A, Kwon GS. Amphiphilic block copolymers for drug Delivery. J Pharm Sci 2003 ；92 :1343-55.]。
另一方面，有关TF表达调控的基础研究发现核转录因子KB(NF-KB)作为 启动TF表达的关键因子，成为TF表达的调控点(参见=Matsushita H，Morishita R, Nata T, et al.Hypoxia-induced endothelial apoptosisthrough nuclear factor-KappaB(NF-kappaB). mediated bcl-2suppression :in vivo evidence of the importance of NF-kappaB in endothelial cellregulatiou. Cirt Res 200012 ；86 (9) 97451)。诱骗寡核苷酸技术(decoy ODNs)是近年来发展起来的一种基因治疗策略(参 见Gambari R.New trends in thedevelopment of transcription factor decoy pharmacotherapy. Curr DrugTargets 2004;5:419-30·)。TF NF-κ B decoy ODNs (组织 因子核转录因子κ B诱骗寡核苷酸)是含有与TF启动子顺式作用元件κ B结合位点序 列(5，CGGAGTTTCC 3，)相同序列的双链核苷酸片段(参见=RyuichiMorishita, Jitsuo Higaki,Naruya Tomita,et al. Application oftranscription factor "decoy" strategy as means of gene therapy andstudy of gene expression in cardiovascular disease. Circ Res. 1998,82 :1023-8.)，若将该NF-κ B decoy ODNs转染至细胞后，能竞争性的与 NF-K B结合，封闭其结合位点，而阻止其转录启动作用，抑制TF表达。由于常用基因转 染方法在病毒载体的安全性、脂质体靶向性和转染率上存在缺陷(参见=Entaro Kogure, Hidetaka Akita, Hideyoshi Harashima. Multifunctional envelope-type nano device for non-viral gene delivery Concept and application of Programmed Packaging. Journal of ControlledRelease 2007 ; 122 :246-251.)。因此，寻找安全有效的靶向转染载 体，实现定向干预是当前研究的关键。
发明内容
本发明的任务是提供一种具有组织因子靶向性蛋白纳米粒及其制备方法和在制 备用于预防血栓形成的药物中的应用。实现本发明的具体方案是本发明提供的这种具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒，是凝血因子类表皮生长 因子I区多肽(EGFl)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与凝血因子类表皮生长因子I区 肽(EGFl)融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGFI-PEG-PLA-NP或 EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)，凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGFl)具有序列表中序列1 所示的氨基酸序列。本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒凝血因子类表皮生长因子I区 多肽(EGFl)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP)是按以下方法制备的(1)制备凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGFl)；(2)将EGFl多肽进行巯基化修饰；(3)制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒 (PEG-PLA-NP)；(4)将巯基化EGFl多肽与PEG_PLA_NP按照巯基与马来酰亚胺基的摩尔比为1 1 的比例混合均勻，磁力搅拌过夜后，过kpharose CL-4B柱，收集得到乳白色EGF1-PEG-PLA-NP 溶液，经真空冻干后得到白色粉末即为EGF1-PEG-PLA-NP，置于_20°C保存。以上步骤( 所述的将EGFl多肽进行巯基化修饰的具体方法是采用Traut试 剂，按照EGFl 2-亚氨氢氯化硫醇摩尔比为1 40混合，室温搅拌1小时，
G-100凝胶层析柱分离除去2-亚氨氢氯化硫醇，用0. 01mol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(pH 7. 0)作为洗脱液进行洗脱，即得巯基化EGFl多肽；以上步骤(3)所述的制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳 米粒(PEG-PLA-NP)的具体方法是分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和 单甲氧基聚乙二醇(MePEG)与D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和 MePEG-PLA二嵌段共聚物，再将这两种共聚物按质量比为1 20比例混合，采用复乳/溶媒 蒸发法制得Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)。本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与 凝血因子类表皮生长因子I区肽(EGFl)的融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳 酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法，包括以下步骤(1)通过基因工程技术从大鼠血浆凝血因子VII (FVII)克隆出类表皮生长因子I 区片段，通过与增强型绿色荧光蛋白重组，在大肠杆菌中表达纯化出强型绿色荧光蛋白与 凝血因子类表皮生长因子I区肽融合蛋白(EGFP-EGF1)；(2)将EGFP-EGF1进行巯基化修饰；(3)制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒 (PEG-PLA-NP)；(4)将巯基化EGFP-EGF1蛋白与PEG-PLA-NP按照巯基马来酰亚胺基摩尔比为 1 1混合均勻，磁力搅拌过夜后，过kpharose CL-4B柱，收集得到淡黄色溶液，经真空冻 干后得到的淡黄色粉末即为EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP，置于_20°C保存。
以上步骤( 所述的将EGFP-EGF1进行巯基化修饰的具体方法是采用Traut试 剂，按照EGFP-EGF1蛋白2-亚氨氢氯化硫醇摩尔比为1 40混合，室温搅拌1小时，经 Sephadex G-100凝胶层析柱分离除去2_亚氨氢氯化硫醇，用0. Olmol/L磷酸盐氯化钠缓冲 液(pH 7.0)作为洗脱液进行洗脱，即得巯基化EGFP-EGF1蛋白；以上步骤(3)所述的制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳 米粒(PEG-PLA-NP)的具体方法是分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和 单甲氧基聚乙二醇(MePEG)与D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和 MePEG-PLA二嵌段共聚物，再将这两种共聚物按质量比为1 20比例混合，采用复乳/溶媒 蒸发法制得Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)；本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒可用来制备针对组织因子的靶 向性药物，可用于制备预防血栓形成的药物，例如，可用于制备预防脑血栓形成的药物。本发明专利申请实施例部分对本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米 粒一一凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGFl)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒 (EGF1-PEG-PLA-NP)和增强型绿色荧光蛋白与凝血因子类表皮生长因子I区肽融合蛋白 (EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)的制备作了详细说 明。实验资料实验内容验证本发明提供的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒的靶向功能、生 物安全性及其载TF NF-kB decoyODNs后靶向干预组织因子表达及抑制脑血栓形成的作用。1.主要材料、试剂及设备脂多糖、2，3，5-氯化三苯四唑(TTC)、玫瑰红B染料均购自Sigma公司(美国)；、 大鼠血管内皮细胞系购自Cellapplications公司(美国)；、兔抗TF单克隆抗体购自 SantaCruz 公司(美国)；近红外荧光染料Dir (1，l，-dioctadecyl-3，3，3，，3，_tetramethyl indotricarbocyanine Iodide)购自 Biotium 公司(美国)；Cell counting kit-8 (CCK-8) 购自 Dojindo 公司(日本)；TF NF-K B decoy ODNs(5-GTCCCGGAGTTTCCTACCGGG-3， 3-CAGGGCCTCAAAGGATGGCCC-5)TF mRNA 引物(F :5_GTGCACTGAGCAATGGAAGA_3，R 5-AGGCCATGAAGGGAGTCTTT-3)由hvitrogen公司(中国)合成。成年雄性SD大鼠，体重 200-250g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心；其他常用基本试剂均为国内商业 公司购买。其他常用基本试剂均为国内商业公司购买。所涉仪器主要包括纳米粒子制备及表征设备同前；荧光显微镜(奥林巴斯，日 本)；流式细胞仪(Beckman，美国)；大鼠动物脑立体定位仪(Moelting，美国)；颅脑照射 光源(Oriel Scientific，美国)；多模式活体成像系统FX(Carestream Health，美国)。2.载 Dir/ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP 制备及理化性质表征2. 1. 1 制备载 Dir EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP,方法如下1)取IOOul Dir(5mg/ml)作为内水相加入到Iml 二氯甲烷中；2)取 MePEG-PLA (0. 0228g)及 Malemide-PEG-PLA (0. 0012g)溶解于上述二氯甲烧 中；3)将上述溶液连续超声30秒(160W)制备出水/油初乳；4)将超声后初乳加入到aiil 表面活性剂胆酸钠水溶液中；
5)将步骤4溶液再次超声30秒(160W)制备出水/油/水复乳；6)将复乳溶液加入到38ml 0. 5%胆酸钠水溶液中，使复乳分散；7)磁力搅拌 5min ；8)40°C旋转蒸发至无气泡除去溶液中二氯甲烷；9)将步骤8中溶液在4°C下HOOOrpm离心45min，后弃去上清液，即制得载Dir PEG-PLA-NP。10)取5ml 0. 01mol/L PBS，加入到步骤9中载Dir PEG-PLA-NP中，用移液器吹打 分散，混勻后转移入小烧杯中；11)按计算量加入巯基化EGFP-EGF1至上述溶液中；12)磁力搅拌过夜；13)将搅拌后的溶液在4°C下HOOOrpm离心45min，除去上清；14)加入 1. 5ml 0. 01mol/L PBS,吹打分散使混勻；15)将上述步骤14所得溶液过kpharose CL-4B柱，收集得到淡黄色溶液即为载 Dir EGFP-EGFI-PEG-PLA-NP 溶液；16)将载Dir EGFP-EGFI-PEG-PLA-NP溶液经真空冻干后为淡黄色粉末，置 于-20°C保存。2. 1. 2 制备载 ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP,方法如下1)取50ul 0DNs(lmg/mL)作为内水相加入到Iml 二氯甲烷中；2)取 MePEG-PLA (0. 0228g)及 Malemide-PEG-PLA (0. 0012g)溶解于上述二氯甲烧 中；3)将上述溶液连续超声30秒(160W)制备出水/油初乳；4)将超声后初乳加入到aiil 表面活性剂胆酸钠水溶液中；5)将步骤4溶液再次超声30秒(160W)制备出水/油/水复乳；6)将复乳溶液加入到38ml 0. 5%胆酸钠水溶液中，使复乳分散；7)磁力搅拌 5min ；8)40°C旋转蒸发至无气泡除去溶液中二氯甲烷；9)将步骤8中溶液在4°C下HOOOrpm离心45min，后弃去上清液，即制得载ODNs PEG-PLA-NP。10)取5ml 0. 01mol/L PBS，加入到步骤9中载ODNs PEG-PLA-NP中，用移液器吹 打分散，混勻后转移入小烧杯中；11)按计算量加入巯基化EGFP-EGF1至上述溶液中；12)磁力搅拌过夜；13)将搅拌后的溶液在4°C下HOOOrpm离心45min，除去上清；14)加入 1. 5ml 0. 01mol/L PBS,吹打分散使混勻；15)将上述步骤14所得溶液过kpharose CL-4B柱，收集得到淡黄色溶液即为载 ODNs EGFP-EGFI-PEG-PLA-NP 溶液；16)将载ODNs EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP溶液经真空冻干后为淡黄色粉末，置 于-20°C保存。按照下列公式计算Dir/ODNs的载药率
权利要求
1.一种具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒，其特征在于，它是凝血因子类表皮生长 因子I区多肽(EGFl)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与凝血因子类表皮生长因子I区 肽(EGFl)融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGFI-PEG-PLA-NP或 EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)，所述的凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGFl)具有序列表中 序列1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒，其特征在于，所 述的凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGFl)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒 (EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法是(1)化学合成法制备凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGFl)；(2)将EGFl多肽进行巯基化修饰；采用Traut试剂，按照EGFl 2-亚氨氢氯化硫醇 摩尔比为1 40混合，室温搅拌1小时，G-100凝胶层析柱分离除去2-亚氨 氢氯化硫醇，用0. Olmol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(pH7. 0)作为洗脱液进行洗脱，即得巯基化 EGFl多肽；(3)分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和单甲氧基聚乙二醇 (MePEG)与D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和MePEG-PLA 二嵌段 共聚物，再将这两种共聚物按质量比为1 20的比例混合，采用复乳/溶媒蒸发法制得 Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)；(4)将巯基化EGFl多肽与PEG-PLA-NP按照巯基马来酰亚胺基摩尔比为1 1 混合均勻，磁力搅拌过夜后，过kpharose CL-4B柱，收集得到乳白色溶液，即为 EGF1-PEG-PLA-NP,经真空冻干后为白色粉末，置于_20°C保存。
3.根据权利要求1所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒，其特征在于，增强型绿 色荧光蛋白与凝血因子类表皮生长因子I区多肽的融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二 醇-聚乳酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法是(1)通过基因工程技术从大鼠血浆凝血因子VII(FVII)克隆出类表皮生长因子I区片 段，通过与增强型绿色荧光蛋白重组，在大肠杆菌中表达纯化出增强型绿色荧光蛋白与凝 血因子类表皮生长因子I区肽融合蛋白(EGFP-EGF1)；(2)将EGFP-EGF1进行巯基化修饰；采用Traut试剂，按照EGFP-EGF1蛋白； EGFP-EGF1 2-亚氨氢氯化硫醇摩尔比为1 40混合，室温搅拌1小时，G-100 凝胶层析柱分离除去2-亚氨氢氯化硫醇，用0. 01mol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(pH 7. 0)作 为洗脱液进行洗脱，即得巯基化EGFP-EGF1蛋白；(3)分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和单甲氧基聚乙二醇 (MePEG)与D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和MePEG-PLA 二嵌 段共聚物，再将这两种共聚物按质量比为1 20比例混合，采用复乳/溶媒蒸发法制得 Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)；(4)将巯基化EGFP-EGF1蛋白与PEG-PLA-NP按照巯基马来酰亚胺基摩尔比为1 1 混合均勻，磁力搅拌过夜后，过kpharose CL-4B柱，收集得到淡黄色溶液，经真空冻干后淡 黄色粉末即为EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP，置于_20°C保存。
4.权利要求1、2或3所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒在制备针对组织因子 的靶向性药物中的应用。
5.权利要求1、2或3所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒在制备用于预防血栓形 成药物中的应用。
6.权利要求1、2或3所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒在制备用于预防脑血栓 形成药物中的应用。
7.一种用于预防脑血栓形成的药物，其特征在于，它是由权利要求1或2或3所述的 具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒为载体装载组织因子核转录因子κ B诱骗寡核苷酸(TF NF-k B decoy ODNs)构成。
8.权利要求1所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒凝血因子类表皮生长因子I区 多肽(EGFl)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法，包括以下步 骤(1)制备凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGFl)；(2)将EGFl多肽进行巯基化修饰；(3)制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)；(4)将巯基化EGFl多肽与PEG-PLA-NP按照巯基与马来酰亚胺基的摩尔比为1 1的比 例混合均勻，磁力搅拌过夜后，过kpharose CL-4B柱，收集得到乳白色EGFI-PEG-PLA-NP 溶液，经真空冻干后得到白色粉末即为EGF1-PEG-PLA-NP，置于_20°C保存。
9.权利要求8所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒凝血因子类表皮生长因子I 区多肽(EGFl)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法，其特征 在于，步骤( 所述的将EGFl多肽进行巯基化修饰的具体方法是采用Traut试剂，按照 EGFl 2-亚氨氢氯化硫醇摩尔比为1 40混合，室温搅拌1小时，G-100凝 胶层析柱分离除去2-亚氨氢氯化硫醇，用0. 01mol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(pH 7. 0)作为 洗脱液进行洗脱，即得巯基化EGFl多肽。
10.权利要求8所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒凝血因子类表皮生长因子 I区多肽(EGFl)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法，其特 征在于，步骤⑶所述的制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米 粒(PEG-PLA-NP)的具体方法是分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和 单甲氧基聚乙二醇(MePEG)与D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和 MePEG-PLA 二嵌段共聚物，再将这两种共聚物按质量比为1 20的比例混合，采用复乳/溶 媒蒸发法制得Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)。
11.权利要求1所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 与凝血因子类表皮生长因子I区肽(EGFl)的融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚 乳酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法，包括以下步骤(1)通过基因工程技术从大鼠血浆凝血因子VII(FVII)克隆出类表皮生长因子I区片 段，通过与增强型绿色荧光蛋白重组，在大肠杆菌中表达纯化出强型绿色荧光蛋白与凝血 因子类表皮生长因子I区肽融合蛋白(EGFP-EGF1)；(2)将EGFP-EGF1进行巯基化修饰；(3)制备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)；(4)将巯基化EGFP-EGF1蛋白与PEG-PLA-NP按照巯基马来酰亚胺基摩尔比为1 1 混合均勻，磁力搅拌过夜后，过kpharose CL-4B柱，收集得到淡黄色溶液，经真空冻干后得到淡黄色粉末即为EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP，置于_20°C保存。
12.根据权利要求11所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)与凝血因子类表皮生长因子I区肽(EGFl)的融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二 醇-聚乳酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法，其特征在于，步骤( 所述的将 EGFP-EGF1进行巯基化修饰的具体方法是采用Traut试剂，按照EGFP-EGF1蛋白2-亚 氨氢氯化硫醇摩尔比为1 40混合，室温搅拌1小时，G-100凝胶层析柱分离 除去2-亚氨氢氯化硫醇，用O.Olmol/L磷酸盐氯化钠缓冲液(pH 7.0)作为洗脱液进行洗 脱，即得巯基化EGFP-EGF1蛋白。
13.根据权利要求11所述的具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)与凝血因子类表皮生长因子I区肽(EGFl)的融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二 醇-聚乳酸纳米粒(EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)的制备方法，其特征在于，步骤( 所述的制 备Maleimide-PEG和MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)的具体方法 是；分别将马来酰亚胺封端的聚乙二醇(Maleimide-PEG)和单甲氧基聚乙二醇(MePEG)与 D，L-乳酸进行开环聚合反应，得到Maleimide-PEG-PLA和MePEG-PLA 二嵌段共聚物，再将 这两种共聚物按质量比1 20比例混合，采用复乳/溶媒蒸发法制得Maleimide-PEG和 MePEG表面共修饰的聚乳酸(PLA)纳米粒(PEG-PLA-NP)。
全文摘要
本发明提供了一种具有组织因子靶向性的蛋白纳米粒，其特征在于，它是凝血因子类表皮生长因子I区多肽(EGF1)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与凝血因子类表皮生长因子I区肽(EGF1)融合蛋白(EGFP-EGF1)修饰的聚乙二醇-聚乳酸纳米粒(EGF1-PEG-PLA-NP或EGFP-EGF1-PEG-PLA-NP)，可用于制备针对组织因子的靶向性药物，以其为载体装载TF NF-κB decoy ODNs即制备成组织因子靶向性预防脑血栓形成的药物，经实验证实，该药物能有效抑制血栓形成。
文档编号A61P9/10GK102119925SQ20101010656
公开日2011年7月13日 申请日期2010年2月3日 优先权日2010年2月3日
发明者梅恒, 王华芳, 石威, 胡豫, 郭涛 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院