专利名称：氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一系列氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，该纳米颗粒的制备方法及其抗菌用途。
背景技术：
目前国内外纳米金属抗菌药物的研发主要集中在纳米银、纳米二氧化钛以及纳米氧化锌上。但纳米银对光不稳定且对人体有害，纳米二氧化钛的抗菌效果依赖光源，纳米氧化锌的用药剂量太高。而纳米金作为抗菌剂的研发并不多。Sabo-Attwood T.L.等 (Norman, R. S. ；Stone, J. W. ；Gole, Α. ；Murphy, C. J. ；Sabo-Attwood, Τ. L. , Targeted photothermallysis of thepathogenic bacteria, pseudomonas aeruginosa, with gold nanorods. Nano Lett. 2008,8, (1),302-306)利用金纳米棒吸收近红外光发热的特性来杀菌，但同样需要一定功率的近红外光源。Xu bing等(Gu，H. ；Ho, P. L. ；Tong, E.； Wang, L. ；Xu, B. , Presenting vancomycin on nanoparticles to enhanceantimicrobial activities. Nano Lett 2003，3，(9)，1261-1263)提到将抗菌药万古霉素修饰到金纳米颗粒上，可以提高其对万古霉素抗性细菌的抗菌效果，但仍然对大肠杆菌作用不大，且合成过程较为复杂。2-巯基嘧啶或4-氨基-2-巯基嘧啶被认为可以抑制细菌t-RNA的合成而具有抗菌性。Mostafa S. I.等(Mostafa, S. I. ；Hadjiliadis, N. , Biologicallyactive 2-thione~4,6-diamino-5-hydroxypyrimidine transition metal complexes. Transition Metal Chemistry 2008，1-6)测试了 2-巯基_4，6_ 二氨基-5-羟基嘧啶的抗菌性，当它的浓度为20mg/mL以上时显现轻微的抗菌效果；将该嘧啶分子与金属银配位后，抗菌浓度降低为 10mg/mL。Sayed H. H.等(Sayed，H. H. ；Shamroukh, A. H. ；Rashad, Α. E.， Synthesis and biologicalevaluation of some pyrimidine, pyrimido[2,l~b][1,3] thiazine and thiazolo[3,2~a]pyrimidine derivatives. Acta Pharm 2006,56, (2), 231-44)测试了 2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶的衍生物——1,3,4-三羟基-2-巯基-4，6- 二 (苯亚甲基氨基)嘧啶的抗菌性，当浓度为25 μ g/ml时有轻微抗菌效果。这些药物的抗菌效果都太弱。 Jingfang Zhou 等(Zhou, J. ；Beattie, D. Α. ； Ralston, J. ；Sedev, R.， Colloid stability of thymine-functionalized gold nanoparticles. Langmuir 2007, 23，(24),12096-12103)用甲苯/水两相法合成了一种长链烷基修饰的巯基胸腺嘧啶—— 1-(10-巯基癸烷基)-5-甲基嘧啶的金纳米颗粒，该纳米颗粒只有在pH > 12. 3的水溶液才能完全分散。Weili Shi 等(Shi, W. ；Sahoo, Y. ；Swihart, Μ. Τ. , Gold nanoparticles surface-terminated with bifunctional ligands. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects 2004,246, (1—3)，109—113)在冰浴下在甲醇溶液中合成的4-氨基硫代苯酚修饰的金纳米颗粒团聚严重，该颗粒的配体与2-巯基-4，6-二氨基嘧啶结构类似。Selvaraj, V.等(Selvaraj, V. ；Alagara, M. ；Hamerton, I. ；Analytical detectionand biological assay of antileukemic drug using goldnanoparticles. Electrochimica Acta 2006，52，1152-1160)将药物 6-巯基嘌呤与金纳米颗粒混合后得到6-巯基嘌呤修饰的金纳米颗粒，药效有所提高，但是纳米颗粒团聚严重， 无法保存。
发明内容
本发明的一个目的是提供一系列金纳米颗粒，该颗粒表面由氨基嘧啶分子修饰， 所述氨基嘧啶分子为一种或多种2-巯基-4，6-二氨基嘧啶，2-巯基-4-氨基嘧啶和2，4-二氨基-6-巯基嘧啶。该系列金纳米颗粒可以作为抗菌药物使用。本发明的另一目的是提供所述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的制备方法。本发明的再一个目的是提供一种抗菌药物， 该抗菌药物含有氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒。本发明的又一个目的是提供所述的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的应用，包括在制备抗菌药物中的用途。用于实现上述目的的技术方案如下一方面，本发明提供一种金纳米颗粒，其中金纳米颗粒表面由氨基嘧啶分子修饰。优选地，修饰于金纳米颗粒表面的氨基嘧啶分子为一种或多种2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶，2-巯基-4-氨基嘧啶和/或2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶。进一步优选地，本发明提供的氨基嘧啶分子修饰的金纳米颗粒其粒径范围为 1.0 10. Onm;氨基嘧啶分子与金元素在纳米颗粒中的摩尔含量比为0. 1 1 0.9 1。上述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液浓度在0. 1 lmg/ml范围时可在4°C保存至少一年，冻干后可在4°C或-20°C保存至少一年，冻干颗粒仍可溶于水。另一方面，本发明提供上述金纳米颗粒的制备方法，其步骤包括(1)将氯金酸与氨基嘧啶溶解混合形成混合溶液；(2)还原剂(例如硼氢化钠或抗坏血酸钠)还原上述混合溶液中的氯金酸形成氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒；(3)纯化氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒。优选地，氯金酸与氨基嘧啶分子在混合溶液中的摩尔比为1 1 1 10;还原剂与氯金酸的摩尔比为1 3 1 10。优选地，氯金酸、氨基嘧啶和还原剂溶于有机溶剂中，进一步优选地，溶于二甲亚砜、甲醇、乙醇或四氢呋喃中。优选地，在混合溶液中还包含有机酸或无机酸，优选地，包含乙酸、丙酸或盐酸；酸在混合溶液中的体积含量为0. 5% 10%优选地，在混合溶液中还包含非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂优选为Triton X-100、吐温和聚乙二醇，非离子表面活性剂在混合溶液中的体积含量为 10%。优选地，上述制备方法的反应时间为0. 5h以上，反应温度范围为室温以下；进一步优选地，反应时间为1 池。再一方面，本发明提供一种抗菌药物，该抗菌药物含有氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒。优选地，所述抗菌药物选自一种或多种抗革兰氏阴性菌药物，抗革兰氏阳性菌药物和/或抗具有多药耐药性的临床分离菌药物。
进一步优选地，所述革兰氏阴性菌包含大肠杆菌，铜绿假单胞菌，痢疾杆菌，伤寒杆菌，变形杆菌和霍乱杆菌；所述革兰氏阳性菌包含表皮葡萄球菌，肺炎双球菌，白喉杆菌和破伤风杆菌；所述具有多药耐药性的临床分离菌包含多药耐药的大肠杆菌和铜绿假单胞菌。
又一方面，本发明提供金纳米颗粒在制备抗菌药物中的应用。优选地，所述抗菌药物选自一种或多种抗革兰氏阴性菌药物，抗革兰氏阳性菌药物和/或抗具有多药耐药性的临床分离菌药物。进一步优选地，所述革兰氏阴性菌包含大肠杆菌，铜绿假单胞菌，痢疾杆菌，伤寒杆菌，变形杆菌和霍乱杆菌；所述革兰氏阳性菌包含表皮葡萄球菌，肺炎双球菌，白喉杆菌和破伤风杆菌；所述具有多药耐药性的临床分离菌包含多药耐药的大肠杆菌和铜绿假单胞菌。与现有技术相比，本发明至少具有以下优点1、本发明的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，是将本身并无抗菌活性、常作为嘧啶类药物前体的2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶，2-巯基-4-氨基嘧啶和/或2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶修饰到金纳米颗粒上制备而成，具有优良的抗菌活性。2、本发明的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，制备方法简单，纳米颗粒粒径分布小，颗粒在水中分散性好(见附图2 4)，能在4°C或-20°C保存至少一年，冻干颗粒仍可溶于水。 而文献所报道的与氨基嘧啶结构类似的4-氨基硫代苯酚修饰的金纳米颗粒(附图6A，来自 Shi, W. et al, Colloids andSurfaces A :Physicochemical and Engineering Aspects 2004,246, (1-3)，109-113)和6-巯基嘌呤修饰的金纳米颗粒(附图6B，来自Selvaraj, V. et al, Electrochimica Acta 2006，52，1152-1160)均团聚严重。以下是本发明的详细描述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒由金纳米颗粒和与之结合的氨基嘧啶分子组成。氨基嘧啶选自一种或多种2-巯基-4，6-二氨基嘧啶(简称DAPT)，2-巯基-4-氨基嘧啶(简称APT)和/或2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶(简称iDAPT)，三种氨基嘧啶分子的化学结构见图1。单一氨基嘧啶分子修饰的金纳米颗粒包含2-巯基-4，6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简称Au_DAPT)，2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简称Au_APT)和2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒(简称Au_iDAPT)；混合氨基嘧啶分子修饰的金纳米颗粒包含2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶和2-巯基-4-氨基嘧啶共同修饰的金纳米颗粒(简称 Au_DAPT/APT)，2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶和2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_DAPT/iDAPT)，2-巯基-4-氨基嘧啶和2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶共同修饰的金纳米颗粒(简称Au_APT/iDAPT)和上述三种氨基嘧啶分子共同修饰的金纳米颗粒(简称 Au_DAPT/APT/iDAPT)。其中 Au_DAPT，Au_APT 和 Au_iDAPT 的透射电子显微镜(TEM)图见图 2 4。该系列纳米颗粒可以作为抗菌药物使用。优选地，上述纳米颗粒的制备方法可以包含以下步骤(1)原料氯金酸与氨基嘧啶分子、表面活性剂混合形成均一溶液；(2)还原剂例如硼氢化钠或抗坏血酸钠还原上述溶液中的氯金酸形成氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒；(3)除去溶剂和反应体系中的盐类等副产物，纯化氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒。所述金纳米颗粒可以溶于水保存于4°C或冻干保存于-20"C。
来自实施例的示范性的具体实施步骤包括(1)配制反应溶液配制浓度为5mM的氯金酸的二甲亚砜、甲醇、乙醇或四氢呋喃溶液；配制浓度为IOmM的氨基嘧啶的二甲亚砜、甲醇、乙醇或四氢呋喃溶液，并加入 200 μ 1无水乙酸、丙酸或盐酸(0. 1Ν)和50 μ 1 Triton X-100、吐温或聚乙二醇，得到含有氨基嘧啶的混合溶液；配制浓度为60mM硼氢化钠的二甲亚砜、甲醇、乙醇或四氢呋喃溶液；(2)混合氯金酸溶液和氨基嘧啶溶液在冰浴条件下，将步骤(1)配制的氯金酸的二甲亚砜、甲醇、乙醇或四氢呋喃溶液和含有氨基嘧啶的混合溶液相混合，搅拌10 30分钟；(3)还原反应制得氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒快速搅拌下，滴入步骤(1)配制的硼氢化钠的二甲亚砜、甲醇、乙醇或四氢呋喃溶液，2分钟之内滴完；之后降低搅拌速度搅拌1小时，充分反应后得到深红色溶液；(4)纯化氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒对上述深红色溶液减压除去溶剂，加入纯水，用截止分子量为3KDa的透析袋在纯水中透析48小时，每2小时换一次水；透析后的溶液经0. 22 μ m微孔滤器过滤除菌，得到氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液，置于4°C储存，或可冻干后_20°C储存。所述氯金酸来自上海九山化工有限公司，硼氢化钠、抗坏血酸钠、聚乙二醇和乙醇来自国药集团北京化学试剂公司，2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶来自默克公司，2-巯基-4-氨基嘧啶和2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶、二甲亚砜、甲醇、四氢呋喃、无水乙酸、Triton X-100和吐温(吐温20，吐温40，吐温60或吐温80)来自Sigma公司。所述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的粒径通过透射电子显微镜(Tecnai G220S-TWIN透射电子显微镜，美国FEI公司)来确定，纳米颗粒中金和氨基嘧啶的含量比例由X射线光电子能谱仪(ESCALab220I-XL，英国VG Scentific)来确定，纳米颗粒水溶液的浓度(金的浓度)由电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-0ES，美国PE公司)来确定。本发明对提供的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒进行了细胞毒性检测，证明氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒对细胞的增殖率没有影响，即没有细胞毒性。本发明对提供的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒进行了抗菌活性的检测，示范性的具体检测方法包括在肉汤培养基中分别培养五种细菌大肠杆菌(Escherichia coli，CGMCCl. 2389， 革兰氏阴性菌，用其它革兰氏阴性菌中的痢疾杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌或霍乱弧菌均可)、 铜绿假单胞菌O3SeudomonaS aeruginosa, CGMCC1. 2387，革兰氏阴性菌)、多药耐药的大肠杆菌(MDR E.coli，获得自北京天坛医院，VITEK全自动细菌分离仪分离鉴定细菌，临床分离号903657，耐药性革兰氏阴性菌，用其他耐药性菌如临床分离的其他耐药大肠杆菌均可)，多药耐药的铜绿假单胞菌(MDR P. aeruginosa，获得自北京天坛医院，VITEK全自动细菌分离仪分离鉴定细菌，临床分离号9036M，耐药性革兰氏阴性菌)和表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis, CGMCC1.对四，革兰氏阳性菌，用其它革兰氏阳性菌中的肺炎双球菌，白喉杆菌和破伤风杆菌均可)培养8 16小时(表皮葡萄球菌需培养16小时， 其它需培养8 10小时)，用新鲜肉汤培养基稀释菌液，使菌液的OD值(600nm)为0. 1。取12份1. 78ml的肉汤培养基，分成4组，每组至少3份(即至少三个平行)，各组分别加入不同浓度的药物水溶液(药物可为氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，氨基嘧啶或庆大霉素，以纯水作阴性对照)各200μ 1，同一组中的平行份所加的药物浓度相同，再向所有12份中加入 20 μ 1上述稀释后的大肠杆菌菌液，37°C、震荡速率200rpm下培养，24小时后测定菌液浑浊度，4组中菌液不浑浊(600nm处OD值<0. 1)的最低药物浓度即为该药物对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。另一方面，本发明提供了上述的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒作为纳米抗菌药物的应用，此系列纳米颗粒为抗革兰氏阴性菌药物、抗革兰氏阳性菌药物或/和抗具有多药耐药性的临床分离菌药物。其中，优选地，所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、 痢疾杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌或霍乱弧菌；所述的革兰氏阳性菌包括表皮葡萄球菌、肺炎双球菌、白喉杆菌或破伤风杆菌；所述的具有耐药性的临床分离菌包括多药耐药性的革兰氏阴性菌，如多药耐药的大肠杆菌和多药耐药的铜绿假单胞菌等。本发明提供了一种合成方法简单、纳米颗粒粒径分布小、水中分散性好、能在4°C 或-20°C保存一年以上，且对人源原代细胞无毒性的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒及合成方法和抗菌用途，即将本身并无抗菌活性、常作为嘧啶类药物前体的2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶、2-巯基-4-氨基嘧啶和/或2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶修饰(结合)到金纳米颗粒上制备氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，该氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒凸显出优良的抗菌活性。本发明的有益效果在于(1) 2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶、2-巯基_4_氨基嘧啶和/或2，4_ 二氨基_6_巯基嘧啶本身没有抗菌活性，修饰于金纳米颗粒后具有抗菌作用，不是旧药改造，而属于I类新药，可广泛地用于抗菌药物的制备，例如抗革兰氏阴性菌药物、抗革兰氏阳性菌药物或/和抗具有多药耐药性的临床分离菌药物；(2)本发明的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，纳米颗粒粒径分布小，制备方法简单， 易保存。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中图1为2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶(简称DAPT)，2_巯基_4_氨基嘧啶(简称APT) 和2，4_ 二氨基-6-巯基嘧啶(简称iDAPT)的化学结构。图2为2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的TEM图。图3为2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的TEM图。图4为2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒的TEM图。图5为不同浓度的2-巯基-4，6_ 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。图6为4-氨基硫代苯酚修饰的金纳米颗粒(A)和6-巯基嘌呤修饰的金纳米颗粒 ⑶。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐
8明本发明，而不是 为了限制本发明的范围。实施例1 制备2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，其步骤为(1)配制反应溶液配制浓度为5mM的氯金酸二甲亚砜溶液，即将41. 2mg氯金酸固体溶于20ml 二甲亚砜中制得；配制浓度为IOmM的2_巯基_4，6_ 二氨基嘧啶二甲亚砜溶液，即向IOml甲醇中加入14. 2mg的2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶固体，并加入50 μ 1盐酸(0. 1Ν)和50 μ 1 Triton X-100，超声溶解，得到含有2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶的混合溶液；配制浓度为60mM的硼氢化钠二甲亚砜溶液，即将12mg的硼氢化钠固体溶于5ml 二甲亚砜制得；(2)混合氯金酸溶液和氨基嘧啶溶液将步骤(1)配制的氯金酸二甲亚砜溶液和含有2-巯基-4，6_ 二氨基嘧啶的混合溶液混合，搅拌10分钟；(3)还原反应制得2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒快速搅拌下，滴入步骤(1)配制的硼氢化钠甲醇溶液，2分钟之内滴完；之后降低搅拌速度搅拌1小时，充分反应后得到深红色溶液；(4)纯化2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒对上述深红色溶液减压除去二甲亚砜，加入纯水，用截止分子量为3KDa的透析袋在纯水中透析48小时，每2小时换一次水；透析后的溶液经0. 22 μ m微孔滤器过滤除菌，得到2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液，置于4°C储存，或可冻干后_20°C储存。2-巯基-4，6_二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液的浓度(元素金)可由电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)测得。取10 μ 1纳米颗粒水溶液滴于400目碳支持膜铜网，自然干燥后通过透射电子显微镜(TEM)观察纳米颗粒大小和形状。用纯水洗涤三次金纳米颗粒，干燥后测X射线光电子能谱仪(XPS)，可得纳米颗粒中配体分子氨基嘧啶与元素金的摩尔含量比。本实施例1合成的含2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的水溶液为深红色，从图2(ΤΕΜ图)可以看出2-巯基-4，6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒粒径为2. 2 5. 6nm;2-巯基-4，6-二氨基嘧啶分子与金元素的摩尔比为0.4 1，以上分析和测定结果列于表1。实施例2 制备一种含2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，其步骤为(1)配制反应溶液配制浓度为5mM的氯金酸甲醇溶液，即将41. 2mg氯金酸固体溶于20ml甲醇中制得；配制浓度为30mM的2_巯基-4-氨基嘧啶甲醇溶液，即向IOml甲醇中加入37. 8mg 的2-巯基-4-氨基嘧啶固体，并加入300 μ L无水乙酸和50 μ 1吐温20，得到含有2-巯基-4-氨基嘧啶的混合溶液；
配制浓度为IOOmM的硼氢化钠甲醇溶液，即将20mg的硼氢化钠固体溶于5ml甲醇制得；(2)混合氯金酸溶液和氨基嘧啶溶液在冰浴条件下，将步骤(1)配制的氯金酸甲醇溶液和含有2-巯基-4-氨基嘧啶混合溶液混合，搅拌20分钟；(3)还原反应制得2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒快速搅拌下，滴入步骤(1)配制的硼氢化钠甲醇溶液，2分钟之内滴完；之后降低搅拌速度搅拌1小时，充分反应后得到深红色溶液；(4)纯化2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒对上述深红色溶液减压除去甲醇，加入纯水，用截止分子量为3KDa的透析袋在纯水中透析48小时，每2小时换一次水；透析后的溶液经0. 22 μ m微孔滤器过滤除菌，得到 2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液，置于4°C储存，或可冻干后_20°C储存。2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液的浓度(元素金)可由电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)测得。取10 μ 1纳米颗粒水溶液滴于400目碳支持膜铜网，自然干燥后通过透射电子显微镜(TEM)观察纳米颗粒大小和形状。用纯水洗涤三次金纳米颗粒，干燥后测X射线光电子能谱仪(XPQ，可得纳米颗粒中配体分子与元素金的摩尔含量比。本实施例2合成的含2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的水溶液为深红色， 由图3 (TEM图)可以看出2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的粒径为1. 5 6. Onm ； 2-巯基-4-氨基嘧啶分子与金元素的摩尔比为0.2 1，以上分析和测定结果列于表1。实施例3 制备2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒，其步骤为(1)配制反应溶液配制浓度为5mM的氯金酸四氢呋喃溶液，即将41. 2mg氯金酸固体溶于20ml四氢呋喃中制得；配制浓度为IOOmM的2，4_ 二氨基_6_巯基嘧啶四氢呋喃溶液，即向IOml四氢呋喃中加入14aiig的2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶固体，并加入400 μ 1无水乙酸和80 μ 1吐温 80，得到含有2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶的混合溶液；配制浓度为IOOmM的抗坏血酸钠四氢呋喃溶液，即将99mg的抗坏血酸钠固体溶于 5ml四氢呋喃制得；(2)混合氯金酸溶液和氨基嘧啶溶液将步骤(1)配制的氯金酸四氢呋喃溶液和含有2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶混合溶液混合，搅拌10分钟；(3)还原反应制得2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒快速搅拌下，滴入步骤⑴配制的抗坏血酸钠四氢呋喃溶液，2分钟之内滴完；之后降低搅拌速度搅拌2小时，充分反应后得到深红色略带紫色的溶液；(4)纯化2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒对上述深红色溶液减压除去四氢呋喃，加入纯水，用截止分子量为3KDa的透析袋在纯水中透析48小时，每2小时换一次水；透析后的溶液经0. 22 μ m微孔滤器过滤除菌，得到2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液，置于4°C储存，或可冻干后_20°C储存。2，4_二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液的浓度(元素金)可由电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)测得。取10 μ 1纳米颗粒水溶液滴于400目碳支持膜铜网，自然干燥后通过透射电子显微镜(TEM)观察纳米颗粒大小和形状。用纯水洗涤三次金纳米颗粒，干燥后测X射线光电子能谱仪(XPQ，可得纳米颗粒中配体分子与元素金的摩尔含量比。本实施例3合成的含2，4_ 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒的水溶液为深红色，由图4(ΤΕΜ图)可以看出2，4_ 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒的粒径为 3. 5 10. Onm，2，4-二氨基-6-巯基嘧啶分子与金元素的摩尔比为0. 3 1，以上分析和测定结果列于表1。实施例4 制备2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶/2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，其步骤为(1)配制反应溶液配制浓度为5mM的氯金酸四氢呋喃溶液，即将41. 2mg氯金酸固体溶于20ml四氢呋喃中制得；配制浓度为IOmM的嘧啶四氢呋喃溶液，即向IOml四氢呋喃中加入71mg的2-巯基_4，6- 二氨基嘧啶和的2-巯基-4-氨基嘧啶固体，并加入400 μ 1无水乙酸和 100 μ 1聚乙二醇2000，得到含有2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶和2-巯基-4-氨基嘧啶的混合溶液；配制浓度为IOOmM的硼氢化钠四氢呋喃溶液，即将20mg的硼氢化钠固体溶于5ml 四氢呋喃制得；(2)混合氯金酸溶液和氨基嘧啶溶液将步骤(1)配制的氯金酸四氢呋喃溶液和含有2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶/2-巯基-4-氨基嘧啶混合溶液混合，搅拌30分钟；(3)还原反应制得2，4-二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒快速搅拌下，滴入步骤(1)配制的硼氢化钠四氢呋喃溶液，2分钟之内滴完；之后降低搅拌速度搅拌2小时，充分反应后得到深红色略带紫色的溶液；(4)纯化2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶/2-巯基_4_氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒对上述深红色溶液减压除去四氢呋喃，加入纯水，用截止分子量为3KDa的透析袋在纯水中透析48小时，每2小时换一次水；透析后的溶液经0. 22 μ m微孔滤器过滤除菌，得到2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶/2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液，置于4°C储存，或可冻干后-20°C储存。2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶/2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液的浓度 (元素金)可由电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OEQ测得。取10 μ 1纳米颗粒水溶液滴于400目碳支持膜铜网，自然干燥后通过透射电子显微镜(TEM)观察纳米颗粒大小和形状。用纯水洗涤三次金纳米颗粒，干燥后测X射线光电子能谱仪(XPQ，可得纳米颗粒中配体分子与元素金的摩尔含量比。
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本实施例4合成的含2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶/2-巯基_4_氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的水溶液为深红色，粒径为2. 0 6. Onm。实施例5 本发明2-巯基-4，6_ 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的细胞毒性检测取第二代生长状态良好的人脐静脉血管 内皮细胞按1 X IO4个/孔接种于96孔板， 待贴壁后，在第二行加入含有ΙΟΟμ g/ml金纳米颗粒的M199培养基200 μ 1，第三行和第四行依次加入含有10和50 μ g/ml金纳米颗粒的M199培养基200 μ 1，每行都加六个孔。第五行加入不含纳米颗粒的Μ199培养基200 μ 1。培养24小时后用CCK_8kit作用显色4小时，在酶标仪上以600nm作参比、读取450nm处吸光值，统计各种浓度的纳米颗粒作用下吸光值，做柱状图，见图5，表明浓度高至100 μ g/ml时，含2-巯基-4，6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液对细胞的增殖率也没有影响，即没有细胞毒性。上述细胞毒性检测采用的是实施例1制备的2-巯基-4，6_ 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，同理采用本发明提供的制备方法制备的其它氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒也可进行细胞毒性检测。实施例6 对本发明的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒进行抗革兰氏阴性菌活性的检测在肉汤培养基中培养大肠杆菌(Escherichia coli，CGMCCl. 2389) 8 10小时，用新鲜肉汤培养基稀释菌液的OD值(600nm)为0. 1。取12份1. 78ml的肉汤培养基，分成4 组，每组3份(即三个平行)，1 4组分别加入4，6，8和10 μ g/ml的2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液各200μ 1，同一组中的三份所加的药物浓度相同，再向所有 12份中加入20 μ 1稀释后的大肠杆菌菌液，37°C、震荡速率200rpm下培养，24小时后测定菌液浑浊度，4组中菌液不浑浊(600nm处OD值< 0. 1)的最低纳米颗粒浓度为6 μ g/ml,即 2-巯基-4，6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒对该大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为6yg/ ml ο上述抗菌活性的检测采用的是实施例1制备的2-巯基-4，6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，同理使用实施例1制备的2-巯基_4，6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒、实施例2制备的2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒、实施例3制备的2，4_ 二氨基-6-巯基嘧啶修饰的金纳米颗粒和实施例4制备的2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶/2-巯基-4-氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒也进行了抗大肠杆菌、抗铜绿假单胞菌、多药耐药大肠杆菌、多药耐药铜绿假单胞菌活性的检测，检测结果证明上述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液同样具有抑菌作用。以上氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的抗革兰氏阴性菌活性检测结果(最低抑菌浓度MIC)共同列于表1。实施例7 对本发明的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒进行抗革兰氏阳性菌活性的检测在肉汤培养基中培养表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, CGMCC1. 2429) 16小时，用新鲜肉汤培养基稀释菌液的OD值(600nm)为0. 1。取12份1.78ml 的肉汤培养基，分成4组，每组3份(即三个平行)，1 4组分别加入4，8，16和32 μ g/ml 的2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液各200 μ 1，同一组中的三份所加的药物浓度相同，再向所有12份中加入20 μ 1稀释后的表皮葡萄球菌菌液，37°C、震荡速率 200rpm下培养，M小时后测定菌液浑浊度，4组中菌液不浑浊^OOnm处OD值< 0. 1)的最低纳米颗粒浓度为32 μ g/ml,即2-巯基-4，6-二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒对该表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为32 μ g/ml。2-巯基-4，6_二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的抗革兰氏阳性菌活性检测结果(最低抑菌浓度MIC)共同列于表1。实施例8 对氨基嘧啶水溶液进行抗菌活性的检测在肉汤培养基中培养大肠杆菌(Escherichia coli，CGMCC1. 2389) 8 10小时，用新鲜肉汤培养基稀释菌液的OD值(600nm)为0. 1。取9份1. 78ml的肉汤培养基，分成3组， 每组3份(即三个平行)，1 3组分别加入10，100和1000 μ g/ml的2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶水溶液各200μ 1，同一组中的三份所加的药物浓度相同，再向所有9份中加入20μ 1 稀释后的大肠杆菌菌液，37°C、震荡速率200rpm下培养，M小时后测定菌液浑浊度。所有3 组菌液均浑浊(600nm处OD值分别为1. 62士0. 14，1. 76士0. 11和1. 90士0. 11)，所以2-巯基-4，6-二氨基嘧啶对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)大于1000 μ g/ml，认为没有抗菌活性。上述抗菌活性的检测采用的是实施例1制备2-巯基-4，6_ 二氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒水溶液时所用的嘧啶配体，同理使用其它实施例制备相应氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒时所用的氨基嘧啶配体也进行了抗菌活性的检测，检测结果证明上述氨基嘧啶配体最低抑菌浓度皆大于1000 μ g/ml，认为没有抗菌活性。以上氨基嘧啶配体抗菌活性检测结果共同列于表1。实施例9 对庆大霉素水溶液进行抗菌活性的检测在肉汤培养基中培养大肠杆菌(Escherichia coli，CGMCCl. 2389) 8 10小时，用新鲜肉汤培养基稀释菌液的OD值(600nm)为0. 1。取12份1. 78ml的肉汤培养基，分成4 组，每组3份(即三个平行)，1 4组分别加入0. 4，0. 8，1和2 μ g/ml的庆大霉素水溶液各200 μ 1，同一组中的三份所加的药物浓度相同，再向所有12份中加入20 μ 1稀释后的大肠杆菌菌液，37°C、震荡速率200rpm下培养，24小时后测定菌液浑浊度(600nm处OD值)。 4组中菌液不浑浊(600nm处OD值< 0. 1)的最低药物浓度为1 μ g/ml,即庆大霉素对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为1 μ g/ml。上述抗菌活性的检测所用菌种为大肠杆菌，采用同样方法可对铜绿假单胞菌、多药耐药大肠杆菌、多药耐药铜绿假单胞菌及革兰氏阳性菌进行抗菌活性的检测。氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒各项性质和抑菌检测结果见表1。表中“_”表示无必要或未测项目。表 权利要求
1.一种金纳米颗粒，其特征为，金纳米颗粒表面由氨基嘧啶分子修饰。
2.如权利要求1所述的金纳米颗粒，其特征为，所述修饰于金纳米颗粒表面的氨基嘧啶分子为同种或多种2-巯基-4，6- 二氨基嘧啶，2-巯基-4-氨基嘧啶和/或2，4- 二氨基-6-巯基嘧啶。
3.如权利要求1或2所述的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，其特征为，所述颗粒平均粒径范围为1.5 10. Onm，氨基嘧啶分子与金元素在纳米颗粒中的摩尔含量比为0. 1 1 0.9 1。
4.如权利要求1-3中任一项所述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的制备方法，其步骤包括(1)将氯金酸与氨基嘧啶溶解混合形成混合溶液；(2)还原剂例如硼氢化钠或抗坏血酸钠还原上述混合溶液中的氯金酸形成氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒；(3)纯化氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒。
5.如权利要求4所述的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的制备方法，其特征为，所述氯金酸与氨基嘧啶分子在混合溶液中的摩尔比为1 1 1 10;还原剂与氯金酸的摩尔比为 1 3 1 10。
6.如权利要求4或5所述的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的制备方法，其特征为，所述氯金酸、氨基嘧啶和硼氢化钠或抗坏血酸钠溶于有机溶剂中，优选地，溶于二甲亚砜、甲醇、乙醇或四氢呋喃中。
7.如权利要求4-6中任一项所述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的制备方法，其特征为， 所述混合溶液中包含有机酸或无机酸，优选地，包含乙酸、丙酸或盐酸；进一步优选地，酸在混合溶液中的体积含量为0. 5% 10%。
8.如权利要求4-7中任一项所述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的制备方法，其特征为， 所述混合溶液中包含非离子表面活性剂；优选地，所包含的非离子表面活性剂为Triton X-100、吐温和聚乙二醇；进一步优选地，非离子表面活性剂在混合溶液中的体积含量为 10%。
9.如权利要求4-8中任一项所述氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的制备方法，其特征为， 所述还原剂还原氯金酸的反应时间为0. 5h以上，反应温度为室温以下；进一步优选地，所述反应时间为1 3小时。
10.一种抗菌药物，该抗菌药物包含如权利要求1-3中任一项所述的氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒。
11.如权利要求10所述的抗菌药物，其特征为，所述抗菌药物选自一种或多种抗革兰氏阴性菌药物，抗革兰氏阳性菌药物和/或抗具有多药耐药性的临床分离菌药物；优选地， 所述革兰氏阴性菌包含大肠杆菌，铜绿假单胞菌，痢疾杆菌，伤寒杆菌，变形杆菌和霍乱杆菌，所述革兰氏阳性菌包含表皮葡萄球菌，肺炎双球菌，白喉杆菌和破伤风杆菌，所述具有多药耐药性的临床分离菌包含多药耐药的大肠杆菌和铜绿假单胞菌。
12.如权利要求1-3中任一项所述金纳米颗粒在制备抗菌药物中的应用；优选地，所述抗菌药物选自一种或多种抗革兰氏阴性菌药物，抗革兰氏阳性菌药物和/或抗具有多药耐药性的临床分离菌药物；进一步优选地，所述革兰氏阴性菌包含大肠杆菌，铜绿假单胞菌，痢疾杆菌，伤寒杆菌，变形杆菌和霍乱杆菌，所述革兰氏阳性菌包含表皮葡萄球菌，肺炎双球菌，白喉杆菌和破伤风杆菌，所述具有多药耐药性的临床分离菌包含多药耐药的大肠杆菌和铜绿假单胞菌。
全文摘要
本发明提供了一系列氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒，所述氨基嘧啶为一种或多种2-巯基-4，6-二氨基嘧啶，2-巯基-4-氨基嘧啶和/或2，4-二氨基-6-巯基嘧啶。氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的粒径为1.5～10.0nm；氨基嘧啶分子与元素金在纳米颗粒中的摩尔含量比为0.1～0.9。此系列氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒具有抗菌作用，可广泛地用于抗菌药物的制备，例如抗革兰氏阴性菌药物、抗革兰氏阳性菌药物或/和抗具有多药耐药性的临床分离菌药物。本发明还提供该氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的制备方法和应用。本发明进一步提供包含该氨基嘧啶修饰的金纳米颗粒的抗菌药物。
文档编号A61P31/04GK102188383SQ20101011917
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者刘文文, 张伟, 田月, 蒋兴宇, 赵玉云 申请人:国家纳米科学中心