抗人il-21受体的抗体及其应用的制作方法

专利名称：：抗人il-21受体的抗体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗体，例如人抗体，和其片段，它们与白细胞介素-21(IL-21)受体结合，特别是与人IL-21受体结合，以及涉及其在调节由IL-21受体介导的免疫应答中的用途。此处公开的抗体可用于诊断、预防和/或治疗免疫疾病，例如自身免疫疾病。
背景技术：
：抗原引发免疫应答并且激活两个最大的淋巴细胞群体T细胞和B细胞。在遭遇抗原后，T细胞增殖并且分化成效应细胞，而B细胞增殖并且分化成抗体分泌浆细胞。淋巴细胞的增殖和分化由细胞外蛋白调控。其中一些蛋白称为细胞因子，其是由淋巴细胞和其它细胞类型分泌的小蛋白(<30kDa)。白细胞介素-21(IL-21)是最近发现的细胞因子，其与IL_2、IL_4和IL_5紧密相关(Parrish-Novak等人Q000)Nature408:57-63)。人IL-21具有大约15kDa的分子量，由131个氨基酸组成，并且与小鼠IL-21有着大约57%的同一性。IL-21主要由被激活的⑶4+T细胞产生。IL-21受体(IL-21R)是属于I类细胞因子受体家族的跨膜IL-21结合蛋白。人和小鼠的IL-21R都已在W001/85792中得以描述，此处引用作为参考。预测的人IL-21R的大小大约为5个氨基酸。IL-21R显示与IL-2受体β链和IL-4受体α链具有很高的序列同源性(Ozaki等人Q000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:11439-11444)。人和小鼠IL-21R序列具有大约62%的同一性。在与配体结合时，IL-21R与由IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13和IL-15受体共享的共有γ细胞因子受体链(Yc)结合(Ozaki等人Q000)同上；Asao等人Q001)J.Immunol.167:1_5)。IL-21R主要在淋巴组织例如B细胞、T细胞和天然杀伤(NK)细胞中表达。IL-21R的广泛淋巴分布暗示着IL-21可能在免疫调控中起作用。事实上，体外研究已经显示出，IL-21显著地调节B细胞、CD4+和CD8+T细胞以及NK细胞的功能(Parrish-Novak等人(2000)同上；Kasaian,Μ.T.等人(2002)Immnunity.16:559-569)。IL-21和IL-21R还显示对调节巨噬细胞和滑膜细胞的活性具有重要作用。例如，IL-21促进由抗CD40抗体刺激的B细胞增殖，和抑制由抗IgM和IL-4刺激的B细胞增殖。IL-21促进T细胞和人NK细胞的增殖和细胞溶解活性。IL-21也介导由T细胞、NK细胞、巨噬细胞和滑膜细胞分泌的细胞因子、趋化因子或其组合的表达。由于B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞和滑膜细胞对于IL-21的依赖性，因此改变IL-21对IL-21R的结合可能会影响某些免疫应答。这样的操作提供了治疗免疫系统疾病的方法，例如自身免疫疾病、炎性疾病、过敏、移植排斥、癌症、免疫缺陷和其它疾病。发明简述本申请提供结合11^-21受体(“11^-211”)，特别是人11^-21受体的抗体，所述抗体对IL-21受体具有很高的亲和力和特异性。在一个实施方案中，抗体减少、抑制或拮抗IL-21R的活性。通过拮抗IL-21R的活性，这类抗体可用来调节免疫应答或免疫细胞相关的疾病。在另一个实施方案中，抗IL-21R抗体可作诊断使用或作为靶向抗体向表达IL-21R的细胞传递治疗性或细胞毒性试剂。因而，本发明的抗IL-21R抗体在诊断和治疗免疫细胞相关的病理学症状(例如，与T细胞(⑶8+，CD4+T细胞)、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞中的至少一种的活性相关的病理学症状，包括移植排斥和自身免疫疾病)。因此，在一个方面，本发明表征了与IL-21R特别是人IL-21R结合的分离的抗体。抗IL-21R抗体可具有至少一个下列特性(1)其是单克隆或单一的特异性抗体；(其是人或在体外产生的抗体；(3)其结合IL-21R，特别是结合人IL-21R的细胞外结构域，并具有至少IO6M-1的亲和常数(Ka)；和(4)其如同IgG—样以IOnM或更低的IC50抑制IL-21与IL-21R的结合，例如由实施例9中所描述的基于细胞的测定法所测量，或其以IOnM或更低的IC5tl抑制抗体与IL-21R的结合，例如由实施例11中所描述的抗原决定部位结合测定法所测量的。本发明抗体的非限制性说明性实施方案此处被称为“MUF”、“MUF种系”、“MU11”、“18G4”、“18A5”、“19F5”、“CP5G2”和“R18”。本发明的抗体可特异性地结合IL-21R的细胞外结构域，例如SEQIDNO:43(人IL-21R)的大约20到235的氨基酸，或与其有至少85%、90^^95^^96^^97%,98^^99%或更高同一性的序列。在另一个实施方案中，抗体特异性地结合IL-21R的片段，例如与SEQIDNO43所列氨基酸序列相邻的至少10、20、50、75、100、150或200个氨基酸的片段，或与其有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列。在其他实施方案中，抗体结合IL-21R的细胞外结构域并且竞争性地抑制“MUF”、“MUF种系”、“MU11”、“18G4”、“18A5”、“19F5”、“CP5G2”或“R18”与其靶抗原决定部位的结合。在另外的实施方案中，抗体结合IL-21R的细胞外结构域并且竞争性地抑制IL-21与IL-21R的结合。这种本发明抗体对于IL-21与其受体的结合的抑制可通过一个或多个此处提供的测定法进行测量。在一个实施方案中，本发明的抗体包括“MUF”、"MUF种系，，、"MUl1，，、“18G4”、“18A5”、“19F5”、“CP5G2”或“R18”的scFv片段的Vh结构域、V1^结构域或其组合。例如，抗体包括这样的Vh结构域和/或\结构域，即所述结构域具有表IA和IB中所列氨基酸序列(对于Vh为SEQIDNO:1，19，47，65，83，101，119或137，和对于Vl为SEQIDNO=2,20,48，66，84，102，120或138)，或基本与其一致的序列(例如，与其具有至少大约85%,90%,95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列，或与SEQIDNO1，2，19，20，47，48，65，66，83，84，101，102，119，120，137或138相异不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的序列)。在另一个实施方案中，抗体包括这样的Vh结构域和/或\结构域，即所述结构域由下列核酸编码，该核酸具有表IA和IB中所列核苷酸序列(对于Vh为SEQIDNO10，28，56，74，92，110，128或146，和对于八为SEQIDNO11，29，57，75，93，111，129或147)，或基本与其一致的序列(例如，与其具有至少大约85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列，或与SEQIDNO10,11,28,29,56,57,74,75,92,93,110，111，128，129，146或147相异不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列)。通常，scFv片段上的Vh和\结构域通过连接体序列连接。在其他实施方案中，所述抗体包括这样的scFv结构域，即所述scFv结构域具有表IA和IB中所列氨基酸序列(SEQIDNO:3，21，49，67，85，103，121或139)，或基本与其一致的序列(例如，与其具有至少大约85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列，或与SEQIDNO:3,21,49,67,85,103,121或139相异不超过1、2、5、10、15、20、30或35个氨基酸残基的序列)。在另一个实施方案中，所述抗体包括这样的scFv结构域，即所述scFv结构域由下列核酸编码，该核酸具有表IA和中所列核苷酸序列IB(SEQIDNO=12,30,58，76，94，112，130或148)，或基本与其一致的序列(例如，与其具有至少大约85%,90%,95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列，或与SEQIDNO12，30，58，76，94，112，130或148相异不超过3，6，15，30，45，60，90，或105个核苷酸的序列)。在另外的实施方案中，抗体包含至少一个这些Vh和八结构域的互补性决定区(CDR)。例如，所述抗体可包括Vh结构域的1、2或3个⑶R(即H1、H2和H3)，所述⑶R具有表IA和IB中所列氨基酸序列(SEQIDNO:4，5，6，22，23，24，50，51，52，68，69，70，86，87，88，104，105，106，122，123，124，140，141或142)，或基本与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85%,90%,95%,96%,97%、98%、99%或更高同一性的序列)。在一些实施方案中，基本上与SEQIDNO=4,5,6,22，23，24，50，51，52，68，69，70，86，87，88，104，105，106，122，123，124，140，141或142中所列的H1、H2或H3氨基酸序列同源的序列包括一个或多个氨基酸替代，例如一个或多个保守氨基酸替代。在另一个实施方案中，所述抗体可包括\结构域的1、2或3个⑶R(即Li、L2和L3)，所述CDR具有表IA和IB中所列氨基酸序列(SEQIDNO:7，8，9，25，26，27，53，54,55,71,72,73,89,90,91,107，108，109，125，126，127，143，144或145)，或基本与其一致的序列(例如，与其具有至少大约85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列)。在一些实施方案中，基本上与SEQIDNO:7，8，9，25，26，27，53，54，55，71，72，73，89，90，91，107，108，109，125，126，127，143，144或145所示的L1、L2和L3氨基酸序列同源的序列包括一个或多个氨基酸替代，例如一个或多个保守氨基酸替代。在另外一个实施方案中，抗体包括MUF、MUlUMUF种系、18G4、18A5、19F5、CP5G2或R18的Vh结构域的⑶R，所述CDR具有表IA和IB中所列氨基酸序列(SEQIDNO:6，24，52，70，88，106，124或142)，或基本与其一致的序列(例如，与其具有至少大约85%,90%,95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列)，所述基本与其一致的序列包括一个或多个氨基酸替代，例如一个或多保守氨基酸替代。根据本发明的抗体可包括包含单个CDR例如H3，或H1、H2和H3的任意组合的重链可变区。例如，在一些实施方案中，抗体可包含与CDR20E)组合的CDR(H3)。在其他实施方案中，抗体可包含与CDRl(Hl)组合的CDR3(H3)，或Hl和H2⑶R的组合。然而，优选地，抗体包括这样的重链可变区，所述重链可变区包含如SEQIDNO:6，24，52，70，88，106，IM，142中任意一个所示的CDR3(H3)和其具有氨基酸替代例如一个或多个保守氨基酸替代的序列，H3可以是单独地存在或与Hl和H2中一个或两个组合存在。类似地，在一些实施方案中，抗体包括MUF、MUlUMUF种系、18G4、18A5、19F5、CP5G2或R18的Vl结构域的⑶R，例如，具有如表IA和IB中所列氨基酸序列(SEQIDNO9，27，55，73，91，109，127或145)，或基本与其一致的序列(例如，与其具有至少大约85%,90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列)的L3CDR，所述基本与其一致的序列包括一个或多个氨基酸替代，例如一个或多保守氨基酸替代。根据本发明的抗体可包括包含单个⑶R例如L3，或L1、L2和L3的任意组合的轻链可变区。例如，在一些实施方案中，抗体可包含与L2组合的L3。在其它实施方案中，抗体可包含与Ll组合的L3。在另外一个实施方案中，抗体可包含与Ll和L2CDR的组合。然而，优选地，抗体包括这样的轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQIDNO:9，27，55，73，91，109，127，145中任意一个所示的L3和其具有氨基酸替代例如一个或多个保守氨基酸替代的序列，L3可以是单独地存在或与Ll和L2中一个或两个组合存在。在一些实施方案中，本发明的抗体与包含与SEQIDNO:1,19,47,65,83,101,119或137所示氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或超过99%同一性的Vh结构域和与SEQIDNO:2，20，48，66，84，102，120或138所示氨基酸序列具有至少95%、96%、97%,98^^99%或超过99%同一性的Vl结构域的抗体竞争结合IL-21R。在某些实施方案中，抗体与含有包含至少一个重链CDR的重链可变区的抗体竞争结合IL-21R，所述重链CDR选自SEQIDNO:6，24，52，70，88，106，IM，142和其中有氨基酸替代例如一个或多个保守氨基酸替代的序列。在某些实施方案中，根据本发明的抗体与含有包含至少一个轻链CDR的轻链可变区的抗体竞争结合IL-21R例如人IL-2R，所述轻链CDR选自SEQIDNO=9,27,55,73,91,109，127，145和其中有氨基酸替代例如一个或多个保守氨基酸替代的序列。与本发明的抗体竞争结合IL-21R例如人IL-21R的抗体可同时包含一个选自SEQIDNO=6,24,52,70，88，106，124和142的重链CDR和一个选自SEQIDNO:9，27，55，73，91，109，127和145的轻链CDR。在一些实施方案中，根据本发明的抗体包括超过一个的重链CDR和/或一个或多个轻链可变区⑶R，所述重链⑶R对于MUF选自SEQIDNO:4，5,6；对于MUll选自SEQIDNO:22，23，24；对于18G4选自SEQIDNO:50，51，52；对于18A5选自SEQIDNO:68,69,70；对于MUF-种系选自SEQIDNO:86，87，88；对于19F5选自SEQIDNO104，105，106；对于CP5G2选自SEQIDNO122，123，124；和对于R18选自SEQIDNO140，141，142，所述轻链可变区CDR对于MUF选自SEQIDNO:7，8，9；对于MUll选自SEQIDNO=25,26,27；对于18G4选自SEQIDNO:53,54,55；对于18A5选自SEQIDNO:71，72，73；对于MUF-种系选自SEQIDNO:89，90，91；对于19F5选自SEQIDNO107，108，109；对于CP5G2选自SEQIDNO125,126，127；和对于R18选自SEQIDNO:143，144，145。在另外的实施方案中，根据本发明的抗体与IL-21例如人L-21竞争结合IL-21R例如人IL-21R。本发明的抗体可以是全长(例如，包含至少一个完整的重链和至少一个完整的轻链)，或可仅包含抗原结合片段(例如，Fab，F(ab’)2，Fv或单链Fv片段(scFv))。抗体可包含选自κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定区基因中的任一个的恒定区或其部分。例如，可使用各种同种型的重链恒定区，所述同种型包括=IgG1UgG^IgG3、IgG4,IgM、IgA1,IgA2,IgD和IgE。所述轻链恒定区可选自κ或λ。抗体可以是IgG，或其也可以是IgGlK或IgG1A。可将此处描述的抗IL-21R抗体进行衍生或连接到另一个功能性分子(例如另一个肽或蛋白质(例如，Fab片段))上。例如，本发明的抗体可功能性地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它方式)到至少一个其他分子实体上，除了其他以外，例如另一个抗体(例如，双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒性剂或细胞抑制剂。在另一个方面，本发明表征了含有至少一种抗IL-2R抗体和药物学可接受载体的药物组合物。所述药物组合物可进一步包含至少一种抗IL-21R抗体和至少一种治疗性试剂(例如，此处更详细描述的细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒性剂、细胞抑制剂或其组合)的组合。抗IL-21R抗体和治疗性试剂的组合也在本发明范围内。本发明的组合物和组合可用于调节IL-21依赖性免疫细胞，例如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞和滑膜细胞。在另一方面，本发明表征了治疗患有免疫细胞相关疾病的受试者的方法。所述方法包括给受试者施用剂量足以抑制免疫细胞的至少一种IL-21R活性的抗IL-21R抗体，从而治疗免疫细胞相关疾病。所述抗IL-21R抗体可单独或与此处描述的其他治疗性试剂组合施用给受试者。所述受试者可以是患有免疫细胞相关病理学症状(例如，与T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞中的至少一种细胞的异常活性相关的病理学症状)的哺乳动物。所述受试者可以是人。例如，所述方法可用于治疗具有免疫细胞相关疾病例如移植排斥和自身免疫疾病的受试者。自身免疫疾病可包括糖尿病(I型)、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎)、多发性硬化、重症肌无力、脉管炎、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、牛皮癣、硬皮病、哮喘、过敏、炎性肠病(IBD)和克罗恩病。使用本发明的抗IL-21R抗体治疗关节炎疾病(例如，选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎中的至少一种的疾病)是本发明的一个实施方案。在另一方面，本发明提供了用于在体外检测样品中存在IL-21R的方法。样品可包括生物学样品例如血清、血浆、组织和活组织切片。本方法可用于诊断疾病，例如此处描述的免疫细胞相关疾病。所述方法包括(1)将所述样品和对照样品与抗IL-21R抗体接触，和(2)检测抗IL-21R抗体和所述样品或对照样品之间的复合物的形成，其中相对于对照样品，在所述样品中复合物的形成在统计学上发生显著改变表示IL-21R存在于所述样品中。在另一方面，本发明提供了在体内检测IL-21R的存在的方法(例如，在受试者中的体内成像)。所述方法可用于诊断疾病，例如此处所描述的免疫细胞相关疾病。所述方法包括(1)在允许所述抗体与IL-21R结合的条件下给受试者或对照受试者施用抗IL-21R抗体，和(2)检测所述抗体和IL-21R之间的复合物的形成，其中相对于对照例如对照受试者，在所述受试者中复合物的形成在统计学上发生显著改变表示存在IL-21R。根据本发明的抗体可以直接或间接地用有助于检测结合或未结合的抗体的可检测物质进行标记。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。在另一方面，本发明提供了用于在体内将试剂例如治疗性或细胞毒性试剂递送或靶向表达IL-21R的细胞的方法。所述方法包括在允许所述抗体与IL-21R结合的条件下对受试者施用抗IL-21R抗体。可将所述抗体与第二治疗性部分例如毒素偶联。本公开内容提供了来自MUF、MUF种系、MU11、18G4、18A5、19F5、CP5G2和R18的Vh和八结构域的核酸序列。也提供了包含至少一个来自MUF、MUF种系、MU11、18G4、18A5、19F5、CP5G2和R18的⑶R的核酸序列。本公开内容也提供了包含这类核酸的载体和宿主细胞。本公开内容进一步提供了产生新的V1^Pt结构域以及功能性抗体的方法，所述功能性抗体包含所有或部分这类来源于MUF、MUF种系、MU11、18G4、18A5、19F5、CP5G2和R18的Vh或\结构域的结构域。本公开内容的另外方面部分将在描述中列出，和部分可明显地从描述中看出或可从实施本发明中获知。提出本发明，并且在权利要求中特别地加以指出，和本公开内容不应当被解释为限制所述权利要求的范围。下列详细描述包括本发明各种实施方案中的举例性的代表方案，它们不是对所要求保护的本发明的限制。附图与该描述一起构成了本说明书的一部分，仅起举例说明实施方案的作用并不限制本发明。附图简述图IA描述了ELISA的结果，其显示MUll特异性结合人IL-21R。图IB描述了通过FACS进行分析而得到的结合测定法的结果，其显示MUF和MUll都结合到人IL-21R的表面上。图IC描述了通过FACS进行分析而得到的结合测定法的结果，其显示MUF与小鼠B细胞上的IL-21R结合。图2描述了ELISA的结果，其显示MUF抑制人IL-21与人IL-21R的结合。图3A描述了细胞增殖测定法的结果，其显示MUF的加入阻断了IL-21增加人CD4+T细胞的增殖的能力。图:3B描述了细胞增殖测定法的结果，其显示MUll阻断了COS细胞培养基中的IL-21增加小鼠⑶4+T细胞的增殖的能力。图3C描述了细胞增殖测定法的结果，其显示MUll以剂量依赖方式阻断了COS细胞培养基中的IL-21增加小鼠CD8+T细胞的增殖的能力。图4描述了细胞增殖测定法的结果，其显示MUFscFv和MUFIgG均阻断了IL-21增加Baf3Mu-l细胞的增殖的能力，所述Baf3Mu-l细胞表达IL-21R。图5A描述了将IL-21加入到从关节炎患者中分离的人成纤维样滑膜细胞中而导致趋化因子MCP-I和GRO的分泌增加。图5B描述了将IL-21加入到从关节炎患者中分离的人成纤维样滑膜细胞中而导致趋化因子1-309、TARC,Eotaxin,MDC、Lymph、SDFIB、IP-10、I-TAC,MG和MP!3B的分泌增加。图5C和5D描述了将IL-21加入到从关节炎患者中分离的人成纤维样滑膜细胞中而导致细胞因子IFN-α和TNF-α(图5C)以及IL-6和IL8(图5D)的分泌增加。图5E显示了，如通过对CIA指征的测量，IL-21在关节炎小鼠模型中加重了胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)。图6显示了，在移植排斥的体外模型即混合淋巴细胞反应中，IL-21增加了C57BL/6J细胞的增殖。发明详述定义为了使本发明能更易理解，首先定义一些术语。另外的定义在整个详述中提出。“抗体”是指免疫球蛋白或其片段，并且包括任何含有抗原结合位点的多肽。该术语不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、人的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的、移植的和体外产生的抗体。除非在之前冠以修饰词“完整的”，所述术语“抗体”包括抗体片段例如Fab、F(ab’)2、Fv、ScFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段。通常，这类片段包含抗原结合结构域。术语“抗原结合结构域”和“抗原结合片段”是指包含负责抗体与抗原之间特异性结合的氨基酸的抗体分子的部分。所述被抗体特异性识别和结合的抗原的部分称为“抗原决定部位”。抗原结合结构域可包含一个抗体轻链可变区和一个抗体重链可变区(Vh)；然而，其不必两者都包含。例如，Fd片段具有2个并且通常保留一些完整的抗原结合结构域的抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的例子包括(I)Fab片段，由\、VH、Cl和ChI结构域构成的单价片段；(2)F(ab')2片段，包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；⑶由两个Vh和ChI结构域构成的Fd片段；(4)由抗体的单个臂的\和Vh结构域构成的Fv片段；(5)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546)，其由Vh结构域构成；和(6)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域八和Vh由分开的基因编码，但它们可通过采用重组方法经合成的连接体连接起来，所述连接体能使它们成为单个的蛋白链，在该蛋白链中\和域配对形成单价分子(称为单链Fv(SCFV)；参见例如，Bird等人(1988)kience242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。通过使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以和完整的抗体相同的方式筛选所述片段加以使用。术语“有效量”是指这样的剂量或数量，即其足以调节IL-21R活性以改善临床症状或获得想要的生物学效果，例如降低的T细胞和/或B细胞活性、自身免疫的抑制、移植排斥的抑制等。术语“人抗体”包括具有基本上对应于Kabat等人(参见Kabat等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)描述的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外的随机或定点诱变或体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，并且特别是在CDR3中。所述人抗体可具有至少1、2、3、4、5或更多个被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替代的位置。术语“IL-21R活性”是指至少一个由于IL-21结合细胞上的IL-21R而引发或中断的细胞过程。IL-21R的活性包括下列中的至少一个，但不限于此(1)结合IL-21(例如，人IL-21)；(2)与信号转导分子(例如，￥(和/或从1(-1)相联合；(3)刺激STAT蛋白(例如，STAT5、STAT3或其组合)的磷酸化；(4)激活STAT蛋白；和(5)调节(例如，增加或减少)免疫细胞的增殖、分化、效应细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、存活或其组合。免疫细胞可包括⑶8+和⑶4+T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞。IL-21R活性可在体外例如通过使用实施例8和9中描述的T细胞增殖测定法进行测定。IL-21R活性也可在体内例如通过实施例12中描述的免疫应答或疾病的进程计分法进行测定。短语“抑制”或“拮抗”IL-21R活性和其同源词汇是指由于结合抗IL-21R抗体而减少、抑制或减弱IL-21R的至少一种活性，其中所述减少是相对于相同抗体不存在的情况下IL-21R的活性而言的。可如实施例7、8、9和11中所描述的方法测量所述活性。抑制或拮抗并不一定表示完全消除IL-21R多肽的生物学活性。活性减少可以为大约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。术语“白细胞介素-21受体”或“IL-21R”是指I类细胞因子受体，也称为NILR(WOO1/85792;Parrish-Novak等人Q000)Nature408:57-63;0zaki等人Q000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:11439-114444)在配体结合时，IL-21R就与共有的γ细胞因子受体链(Yc)(Asao等人(2001)J.Immunol.167:1_5)相互作用，并且引起STATl和STAT3(Asao等人(2001)同上)或STAT5(Ozaki等人(2000)同上)的磷酸化。IL-21R显示出广泛的淋巴组织分布。术语“IL-21R”是指能与IL-21结合的受体(可以是哺乳动物的)，并且具有至少一个下列特征(1)天然发生的哺乳动物IL-21R多肽或其片段的氨基酸序列，例如SEQIDNO:43(人)或SEQIDNO:45(鼠科动物)或其片段所示的氨基酸序列；⑵与SEQIDNO:43(人)或SEQIDNO45(鼠科动物)或其片段所示的氨基酸序列基本一致，例如具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；(3)由天然发生的哺乳动物IL-21R核苷酸序列或其片段(例如，SEQIDNO:44(人)或SEQIDNO:46(鼠科动物)或其片段)编码的氨基酸序列；(4)由与SEQIDNO:44(人)或SEQIDNO:46(鼠科动物)或其片段所示的核苷酸序列基本一致，例如具有至少85%、90^^95^^96^^97^^98^^99%同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(5)由与天然发生的IL-21R核苷酸序列或其片段例如SEQIDNO:44(人)或SEQIDNO46(鼠科动物)或其片段简并的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(6)与前述核苷酸序列中的一个在严紧条件下，例如在高度严紧条件下杂交的核苷酸序列。IL-21R可结合到哺乳动物来源例如人或小鼠的IL-21上。(Parrish-Novak等人(2000)同上)。在此处使用时，“体外产生的抗体”是指全部或部分可变区(例如，至少一个OTR)产生于非免疫细胞选择(例如，体外噬菌体展示、蛋白质芯片或任何其他可以测试候选序列结合抗原的能力的方法)的抗体。该术语不包括通过在免疫细胞中基因组重排产生的序列。术语“分离的”是指基本上脱离其天然环境的分子。例如，分离的蛋白基本不含有来自其所来源的细胞或组织源的细胞材料或其他蛋白质。该术语也指这样的制剂，该制剂中分离的蛋白质的纯度足以用于药物组合物；或具有至少70-80%(w/w)的纯度；或具有至少80-90%(w/w)的纯度；或具有至少90-95%(w/w)的纯度；或具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(w/w)的纯度。人IL-21R的核苷酸序列和预测的氨基酸序列分别显示于SEQIDNO44和SEQIDN0:43中。人IL-21R氨基酸序列(SEQIDNO43)的分析揭示了下列结构特征前导序列(SEQIDNO43的大约第1-19位氨基酸)；WSXWS基元(SEQIDNO43的大约第213-217位氨基酸)；跨膜结构域(SEQIDNO:43的大约第236-252位氨基酸)；细胞外结构域(SEQIDNO43的大约第1-235位氨基酸，和成熟的IL-21R序列的大约第20-235位氨基酸)；和来自SEQIDNO43的大约第253-538位氨基酸的细胞内结构域。据信成熟的人IL-21R具有SEQIDNO43的第20-538位氨基酸的序列。术语“库集(repertoire)”是指全部或部分来源于编码免疫球蛋白的序列的核苷酸序列的遗传多样性集合。所述序列可以通过重链的V、D和J片段以及轻链的V和J片段在体内重排产生。作为另一种选择，所述序列可在响应例如体外刺激而发生重排的细胞中产生。可选择地，通过DNA拼接、核苷酸合成、诱变和其它方法(参见例如美国专利5，565，332)可获得所述序列的部分或全部。术语“特异性结合”、“选择性结合”和“选择性地结合”是指两个分子形成在生理学状况下相对稳定的复合物。选择性结合的特征在于高亲和力和低至中等的容量，这与通常具有低亲和力及中等至高容量的非特异性结合不同。通常，当亲和常数Ka高于IO6M-1时，结合被认为是特异性的或选择性的。如果必要，通过改变结合条件可将非特异结合减小而基本上不影响选择性结合。通过使用常规技术，本领域技术人员可优化合适的结合条件，例如抗体浓度、溶液的离子强度、温度、结合时间、封闭剂浓度(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)等。说明性的条件列于实施例1-11中，但本领域技术人员已知的其他条件也落在本发明的范围内。在此处使用时，术语“严紧”描述用于杂交和洗涤的条件。严紧条件对本领域技术人员来说是已知的，并且可在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中查见。含水和无水的方法描述于该文献中并且二者都可使用。一个严紧杂交条件的例子是在大约45°C下于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)溶液中进行杂交，接着在50°C下用0.2XSSC、0.1%SDS洗涤至少一次。第二个严紧杂交条件的例子是在大约45°C下于6XSSC溶液中进行杂交，接着在55°C下用0.2XSSC、0.1%SDS洗涤至少一次。另一个严紧杂交条件的例子是在大约45°C下于6XSSC溶液中进行杂交，接着在60°C下用0.2XSSC、0.1%SDS洗涤至少一次。另外一个严紧杂交条件的例子是在大约45°C下于6XSSC溶液中进行杂交，接着在65°C下用0.2XSSC、0.1%SDS洗涤至少一次。高度严紧条件包括在65°C下于0.5M磷酸钠、7%SDS中杂交，接着在65°C下用0.2XSSCU%SDS洗涤至少一次。短语“基本如列出的”、“基本一致”或“基本同源”的意思是，相关的氨基酸或核苷酸序列(例如，⑶R(s)、Vh或\结构域)与列出的序列相比基本一致或具有不显著的差异(通过保守氨基酸替代)。不显著的差异包括少量氨基酸变化，例如在特定区域的5个氨基酸序列上的1或2个替代。在抗体的情况下，第二个抗体具有相同的特异性，并且具有原抗体的至少50%的亲和力。与此处公开的序列基本一致或同源(例如，至少大约85%的序列同一性)的序列也是本申请的一部分。在一些实施方案中，序列同一性可达大约90^^91^^92^^93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。可选择地，当所述核酸区段在选择的杂交条件下(例如，高度严紧条件)与所述链的互补链杂交时，就认为存在基本同一性或同源性。所述核酸可以存在于整个细胞中、存在于细胞裂解物中或者以部分纯化或基本纯的形式存在。可通过标准的比对算法，例如由Altshul等人((1990)J.Mol.Biol.,215403-410)描述的BasicLocalAlignmentTool(BLAST)；Needleman等人((I97O)J.Mol.Biol.,48:444-453)的算法；或Meyers等人((1988)Comput.Appl.Biosci.，4:11-17)的算法来确定同一性百分数。一组参数可以是具有缺口罚分(gappenalty)为12、缺口延伸罚分(gapextendpenalty)为4禾口移码缺口罚分(frameshiftgappenalty)为5的Blosum62计分矩阵。两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分数可通过使用已整合入ALIGN程序(2.O版本)中的计E.Meyers和W.Miller((1989)CABI0S，4:11-17)的算法，使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分(gaplengthpenalty)和4的缺口罚分(gappenalty)来确定。术语“治疗性试剂”是治疗或辅助治疗医学疾病的物质。在此处使用时，治疗性试剂是指当给具有抗IL-21R抗体的受试者施用时，与单独施用治疗性试剂或抗IL-21R抗体相比提供更好的治疗效果的物质。这些治疗性试剂可包括但不限于以补充抗IL-21R抗体的IL-21R活性的方式调节免疫细胞或免疫应答的物质。此处描述了治疗性试剂的非限定性实例和用途。在此处使用时，抗IL-21R抗体的“治疗有效量”是指，当以单剂或多剂方式施用给受试者(例如病人)时，对于治疗、预防、医治、延缓疾病或复发性疾病的至少一个症状，减轻疾病或复发性疾病的至少一个症状的严重度，改善疾病或复发性疾病的至少一个症状，或延长受试者的存活时间至超过在缺少这种治疗的情况下所预期的存活时间有效的抗体数量。术语“治疗”是指治疗性或预防性措施。所述治疗可以是给患有医学疾病的受试者或最终可能会得病的人施用药物以预防、医治、延缓疾病或复发性疾病的一个或多个症状，减轻疾病或复发性疾病的一个或多个症状的严重度，或改善疾病或复发性疾病的一个或多个症状，或者延长受试者的存活时间至超过在缺少这种治疗的情况下所预期的存活时间。抗IL-21R抗体本公开内容提供了包含新的抗原结合片段的新型抗IL-21R抗体。通常，通过采用例如常规的杂交瘤技术(Kohler和Milstein(1975)Nature，256495-499)、重组DNA方法(美国专利4，816，567)或使用抗体文库的噬菌体展示(Clackson等人(1991)Nature,352:624-628)；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.，222:581-597)来制备抗体。为查找另外的抗体生产技术，可参考“Antibodies:ALaboratoryManual",Harlow等人(编者)，ColdSpringHarborLaboratory，1988。本发明不受限于任何特定的原料、生产方法或抗体的其它特殊的特征。完整的抗体是免疫球蛋白(Ig)，其通常是由两条轻链(各为25kDa)和2条重链(各为50kDa)组成的四聚体糖基化蛋白。轻链分为两类同种型(λ和κ)而重链分为5类同种型(A、D、E、G和Μ)。一些重链同种型进一步分为同种型亚类，例如IgGpIgG2,IgG3和IgQ。不同抗体的结构域和三维结构在本领域是已知的(Harlow等人，同上)。简而言之，轻链由恒定结构域(Q)和N末端可变结构域构成。重链由三个或四个恒定结构域(Ch)、铰链区和N末端可变结构域(Vh)构成。紧邻Vh结构域的Ch称为ChI。Vh和八结构域包含4个称作构架(FR)区(FR1、FR2、FR3和FR4)的序列保守区域，所述区域为三个称作互补性决定区(OTR)的超可变序列区域形成支架。所述CDR(⑶R1、⑶R2和⑶包含绝大部分特异性结合抗原的抗体氨基酸。重链⑶R表示为HI、H2和H3，而轻链⑶R表示为Li、L2和L3。Fab片段(抗原结合片段)结构域通过恒定区之间的二硫键共价连接构成。Fv片段较小，和由V1^nt结构域通过非共价连接构成。为克服非共价连接的结构域易于解离的趋势，可构建单链Fv片段(scFv)。所述scFv包含(1)将Vh的C末端连接到八的N末端，或(2)将八的C末端连接到N末端的柔性多肽。15聚体(Gly4Ser)3肽可用作连接体，但其他连接体在本领域是已知的。通过使用编码可变区的多个种系基因和各种体细胞事件可产生抗体多样性。所述体细胞事件包括可变基因区段以及多样性(D)和连接(J)基因区段的重组以产生完整WVh区域，和可变以及连接基因区段的重组以产生完整的\区域。CDR3(H;3)是在抗体序列内最大的分子多样性来源。例如，H3可以短至2个氨基酸残基或大于沈个氨基酸残基。最小的抗原结合片段是Fv，其由Vh和\结构域构成。具有与此处公开的⑶R序列一致或相似的⑶R序列的抗体和组合物不可能是独立产生的。在组装和体细胞突变后抗体基因的序列是高度变化的，并且据估计这些变化的基因编码IOltl个不同的抗体分子(ImmunoglobulinGenes，第二版，Jonio等人(编者)，AcademicPress,SanDiego,CA,1995)。本公开内容提供了来源于人免疫球蛋白基因文库的新CDR。具有CDR的结构通常是抗体的重链或轻链或其部分，其中所述CDR位于天然产生的CDR区域。如Kabat等人的"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，，，No.91-3242,NationalInstitutesofHealthPublications,Bethesda,MD(1991)中的描述，可确定可变结构域的结构和位置。本发明的抗IL-21R抗体(包括其scFv片段、Vh和\结构域和OTR)的说明性实施方案的DNA和氨基酸(AA)序列于序列列表中和列举于表IA和表IB中。将所述抗体的特殊实施方案确定为]皿、]\1皿-种系、]\^11、1864、1845、195丄562和R18。抗体的V1^P\结构域中的⑶R位置列于表2。表IA:ΥΠ和Vl结构域、Fv和CDR的AA和DNA序列区域类型MUFMUll18G418Α5VhAASEQIDNO1SEQIDNO19SEQIDNO47SEQDNO65VLAASEQIDNO2SEQIDNO20SEQIDNO48SEQIDNO66scFvAASEQIDNO3SEQIDNO21SEQIDNO49SEQIDNO67HlAASEQIDNO4SEQIDNO22SEQIDNO50SEQIDNO68Η2AASEQIDNO5SEQIDNO23SEQIDNO51SEQIDNO69Η3AASEQIDNO6SEQIDNO24SEQIDNO52SEQIDNO70LlAASEQIDNO7SEQIDNO25SEQIDNO53SEQIDNO71L2AASEQIDNO8SEQIDNO26SEQIDNO54SEQIDNO-J2L3AASEQIDNO9SEQIDNO27SEQIDNO55SEQIDNO73VhDNASEQIDNO10SEQIDNO28SEQIDNO56SEQIDNO7权利要求1.分离的抗体，其包含与选自SEQIDNO:1，2，3，19，20，21，47，48，49，65，66，67，83，84，85，101，102，103，119，120，121，137，138和139的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述抗体选择性地与IL-21受体结合。2.分离的抗体，其由与选自SEQIDNO:10,11,12,28,29,30,56,57,58,74,75,76,92,93，94，110，111，112，128，129，130，146，147和148的核苷酸序列具有至少95%同一性的核苷酸序列编码，其中所述抗体选择性地与IL-21受体结合。3.分离的抗体，其包含Vh结构域和八结构域，所述Vh结构域具有与选自SEQIDNO1，19，47，65，83，101，119和137的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，所述Vl结构域具有与选自SEQIDNO:2，20，48，66，84，102，120和138的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述抗体选择性地与IL-21受体结合。4.分离的抗体，其包含含有一个或多个⑶R的Vh结构域，所述⑶R选自SEQIDNO4,5，6，22，23，24，50，51，52，68，69，70，86，87，88，104，105，106，122，123，124，140，141和142以及其保守氨基酸替代物，其中所述抗体选择性地与IL-21受体结合。5.分离的抗体，其包含含有一个或多个⑶R的&结构域，所述⑶R选自SEQIDNO:7，8，9，25，26，27，53，54，55，71，72，73，89，90，91，107，108，109，125，126，127，143，144和145以及其保守氨基酸替代物，其中所述抗体选择性地与IL-21受体结合。6.分离的抗体，其与包含选自SEQIDNO:1，2，3，19，20，21，47，48，49，65，66，67，83，84，85，101，102，103，119，120，121，137，138和139的氨基酸序列的抗体竞争结合IL-21受体。7.分离的抗体，其与包含选自SEQIDNO:1，2，3，19，20，21，47，48，49，65，66，67，83，84，85，101，102，103，119，120，121，137，138和139的氨基酸序列的抗体结合IL-21受体上相同的抗原决定部位。8.权利要求1，2，3，4，5，6或7的抗体，其中所述抗体选择性地结合到与包含SEQIDNO43所列至少100个连续氨基酸的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列上。9.权利要求1，2，3，4，5，6或7的抗体，其中所述抗体选择性地结合人IL-21受体的细胞外结构域。10.权利要求1，2，3，4，5，6或7的抗体，其中所述抗体抑制IL-21与IL-21受体的结合。11.权利要求1，2，3，4，5，6或7的抗体，其中所述抗体是人抗体。12.权利要求1，2，3，4，5，6或7的抗体，其中所述抗体是IgG1抗体。13.权利要求12的抗体，其中所述抗体是IgG1A和IgGlK。14.由具有ATCC保藏号PTA-5030或PTA-5031的宿主细胞所表达的分离的抗体。15.包含权利要求1，2，3，4，5，6或7的抗体的药物组合物。16.编码权利要求1，2，3，4，5，6或7的抗体的分离的核酸。17.包含权利要求16的核酸的表达载体。18.用权利要求17的载体转化的宿主细胞。19.权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞。20.具有ATCC保藏号PTA-5030或PTA-5031的宿主细胞。21.生产与IL-21受体结合的抗体的方法，所述方法包括在允许所述抗体表达的条件下培养权利要求20的宿主细胞，并且从细胞培养物中分离所述抗体。22.产生选择性结合IL-21受体的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括(a)提供编码可变结构域的核酸的库集，所述可变结构域包括要被替代的CDR1、2或3，或者缺少⑶Rl，2，3编码区域；(b)将所述库集与供体核酸组合，所述供体核酸编码基本上如SEQIDN0:4、5、6、7、8、9、22、23、24、25、26、27、50、51、52、53、54、55、68、69、70、71、72、73、86、87、88、89、90、91、104、105、106、107、108、109、122、123、124、125、126、127、140、141、142、143、144或145中所列的氨基酸序列，这样所述供体核酸就插入到所述库集的CDR1、2或3中，如此提供了编码可变结构域的核酸的产物库集。(c)表达所述产物库集的核酸；(d)选择对于IL-21受体特异的抗原结合片段；(e)回收所述抗原结合片段或编码该抗原结合片段的核酸。23.由权利要求22的方法产生的抗体。24.权利要求22的方法，所述方法进一步包括种系转化的步骤。25.调节免疫应答的方法，所述方法包括用权利要求1，2，3，4，5，6，7或23的抗体与细胞接触，从而调节所述免疫应答。26.权利要求25的方法，其中所述细胞是白细胞或滑膜细胞。27.权利要求沈的方法，其中所述白细胞是T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞。28.权利要求25的方法，其中所述免疫应答包括细胞增殖、细胞溶解活性、细胞因子分泌或趋化因子分泌。29.在受试者中治疗或预防免疫细胞相关疾病的方法，所述方法包括以足以抑制或减少受试者体内免疫细胞活性的剂量给受试者施用权利要求1，2，3，4，5，6，7或23的抗体，从而治疗或预防所述疾病。30.权利要求四的方法，其中所述免疫细胞相关疾病选自多发性硬化、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、移植排斥、炎性肠病、牛皮癣和克罗恩疾病。31.权利要求30的方法，其中所述免疫细胞相关疾病选自类风湿性关节炎、炎性肠病、克罗恩病和牛皮癣。32.权利要求四的方法，所述方法进一步包括给受试者施用选自细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒性剂和细胞抑制剂的其它治疗性试剂。33.权利要求32的方法，基中所述治疗性试剂选自TNF拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-22拮抗剂、T细胞消耗性试剂、B细胞消耗性试剂、甲氨蝶呤、来氟米特、雷帕霉素、或其类似物、Cox-2抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAID和p38抑制剂。34.在受试者中治疗或预防过度增殖性疾病的方法，所述方法包括以足以抑制或减少受试者体内IL-21和/或IL-21受体应答细胞过度增殖的量给受试者施用权利要求1，2，3，4，5，6，7或23的抗体，从而允许所述抗体治疗或预防所述疾病。35.权利要求34的方法，其中所述受试者是哺乳动物。36.权利要求34的方法，其中所述受试者是人。37.权利要求四、30或33的方法，其中所述抗体以选自1μg/kg至20mg/kg、lμg/kg至10mg/kg、1μg/kg至lmg/kg、10μg/kg至lmg/kg、10μg/kg至100μg/kg、100μg/kg至lmg/kg以及500μg/kg至lmg/kg的范围进行施用。38.包含权利要求1，2，3，4，5，6，7或23的抗体的诊断试剂盒。全文摘要本发明提供了特异性结合人白细胞介素-21受体(IL-21R)的人抗体和其抗原结合片段。所述抗体可作为IL-21R活性的拮抗剂，因此在总体上调节免疫应答，特别是那些由IL-21R介导的免疫应答。所述公开的组合物和方法可用于例如诊断、治疗和预防炎性疾病、自身免疫疾病、过敏、移植排斥、癌症和其它免疫系统疾病。文档编号A61P37/00GK102040662SQ201010165730公开日2011年5月4日申请日期2004年3月12日优先权日2003年3月14日发明者A·J·威廉姆斯,D·A·扬,J·维特克,M·J·惠特斯,M·柯林斯,V·瓦尔格-阿彻申请人:医学免疫有限公司,惠氏有限责任公司