专利名称：汉城链霉素及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及从海洋放线菌(Str印tomyces seoulensis)液体发酵物中提取的汉城链霉素(str印toseomycin)及其制备方法与应用。
背景技术：
虽然微生物的次生代谢产物已被广泛研究，但一些特境微生物的代谢产物还是没 有引起人们足够重视。海洋环境的特殊性造就了海洋放线菌独特的代谢方式和代谢产物。 近年来人们不断从各种海洋环境的放线菌中寻找到能产生具有新型作用机制的抗生素。除 了抗生素以外，海洋放线菌还能够产生多种酶的抑制剂，海洋放线菌的多样性为次生代谢 产物提供了一个丰富的来源。随着抗生素的广泛使用，致病菌耐药性急剧增加，原有的抗生素疗效已经大幅度 降低，新的疾病不断出现，这些都给抗生素发展带来了巨大的挑战，发现新菌种以寻找新型 抗生素成为迫切的需要。海洋放线菌可能是筛选抗生素的一条重要途径。然而，到目前为 止，尚未见从汉城链霉菌(Str印tomyces seoulensis)分离抗生素的报道。
发明内容
本发明需要解决的问题是1.提供具有抗菌活性的汉城链霉素(str印toseomycin)。2.提供一种提取、分离汉城链霉素(str印toseomycin)的方法。3.提供汉城链霉素(str印toseomycin)在制备抗生素药物中的应用。本发明通过下述技术方案予以实现。本发明所述汉城链霉素(str印toseomycin)，从海洋放线菌液体发酵提取物中分
离得到，其结构式为 Streptoseomycin单晶结构图见说明书附图1。汉城链霉素(Str印toseomycin)的制备方法，包括下述步骤1.将新鲜的从对虾(Penaeus chinensis)肠道中分离、纯化得到的汉城链霉菌 菌体块接种到高氏I号培养基(可溶性淀粉20g, KN03lg, NaCl 0. 5g，K2HP04 3H20 0. 5g，MgS04 ‘ 7H20 0. 5g，FeS04 7H20 0. 01g，lL 蒸馏水)中，于摇床上，在 150rpm、28°C条件下培 养5天作为种子液；2.然后将种子液接种于马丁培养基中，在150rpm、20-3(TC条件下发酵10天；3.将步骤2所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色 粗浸膏F1 ；4.将粗浸膏F1悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液经 浓缩得浸膏F2 ；5.对浸膏F2进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿，氯仿甲醇=100 1，氯 仿甲醇=100 2，氯仿甲醇=100 4，进行洗脱，浓缩100 4(氯仿甲醇)段得 到黑色浸膏F3 ；6.然后对浸膏F3进行S印hadex LH-20分离(洗脱液氯仿甲醇=1 1)合并 绿色荧光部分洗脱液得淡黄色浸膏F4 ；7.对浸膏F4，用反相柱0DS进行分离，先用55%甲醇进行洗脱除去环二肽，然后用 65%甲醇洗脱，合并绿色荧光部分洗脱液得淡黄色固体F5 ；8.对浸膏F5，用高压液相色谱法(色谱柱Allsphere 0DS-2. 5mm(250R4. 6mm) column ；流动相甲醇/水=60/40 (v/v)流速2. OmL/min)分离得到汉城链霉素 streptoseomycin (保留时间 tE = 38. 2min)。本发明的汉城链霉素(str印toseomycin)对厌氧菌具有很强的抑制作用，且不具 有细胞毒性，因此汉城链霉素(str印toseomycin)可作为一种新颖的抗生素，并在制备抗 生素中得到应用；同时该化合物具有很强的绿色荧光，有望深入研究这类抗生素的作用机 制。与现有技术相比，本发明具有下述突出优点1.本发明的汉城链霉素(str印toseomycin)是结构新颖的化合物，可制备成新型 抗生素或先导化合物。克服现有抗生素耐药性的缺点。2.本发明的汉城链霉素(str印toseomycin)可以利用微生物进行液体发酵生产， 工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。
图1为汉城链霉素(str印toseomycin)的单晶结构图。
具体实施例方式通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。实施例1 海洋来源的汉城链霉菌(Str印tomyces seoulensis)的分离与纯化在无菌条件下解剖对虾(Penaeus chinensis)，将取出的对虾肠道在75%酒精中 表面消毒2分钟，无菌水漂洗3次，后加少量无菌水在无菌研钵中研磨，用无菌水对研磨液 梯度稀释成10、10_2，10_3，10_4，分别取各梯度稀释液0. 2毫升涂布于高氏I号培养基(可溶 性淀粉 20g, KN03lg, NaCl 0. 5g, K2HP04 3H20 0. 5g, MgS04 7H20 0. 5g, FeS04 7H200. Olg, 1L蒸馏水)中，置于28°C恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取孢子纯化培养，得到虾肠道放线菌，经中国科学院微生物研究所鉴定为汉城链霉菌(Str印tomyces seoulensis)，现保藏 在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院)，保藏编 号为CGMCC No. 3689，保藏日期为2010年3月25日。实施例2 海洋来源的汉城链霉菌(Str印tomyces seoulensis)的液体发酵活化海洋来源的汉城链霉菌(Str印tomyces seoulensis)，将新鲜的菌体块接种 到1 OOOmL锥形瓶中，每瓶含有400mL的高氏培养基，接种5-6瓶于摇床上，在150rpm、28 V 条件下培养5天作为种子液，然后将20mL种子液接种于含有400mL的高氏或马丁培养基的 IOOOmL锥形瓶中，在150rpm、20-30°C条件下发酵8天。实施例3 汉城链霉素(str印toseomycin)的提取与分离实施例2中所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色 粗浸膏Fl。将粗浸膏Fl悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓 缩得浸膏F2，对浸膏F2进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿，氯仿甲醇=100 1， 氯仿甲醇=100 2，氯仿甲醇=100 4，进行洗脱，浓缩100 4 (氯仿甲醇)段 得到黑色浸膏F3，然后对浸膏F3进行Si^phadex LH-20分离(洗脱液氯仿甲醇=1 1) 合并绿色荧光部分洗脱液得淡黄色浸膏F4，对浸膏F4，用反相柱ODS进行分离，先用55% 甲醇进行洗脱除去环二肽，然后用65%甲醇洗脱，合并绿色荧光部分洗脱液得淡黄色固体 F5，对浸膏F5，用高压液相色谱法(色谱柱Allsphere 0DS-2. 5mm column ；流动相甲醇/ 水=60/40 (ν/ν)，流速-.2. OmL/min)分离得到汉城链霉素str印toseomycin (保留时间tK = 38. 2min)。实施例4 汉城链霉素(str印toseomycin)的结构鉴定汉城链霉素(str印toseomycin)的结构是基于它们的质谱、核磁共振谱、X_ray单 晶衍射分析和Mosher，s法而确定的。光谱学数据如下汉城链霉素(str印toseomycin)，无色晶体，在紫外下具有较强的绿色荧光， 熔点(m. p.) 268-270 "C ；[叱。=+91.3。(c = 0.080，MeOH) ；CD(MeOH, c = 6. 6X10_3) λ (Δ ε ) = 361sh (-11. 97) 288 (+1. 63) ,22sh(+2. 30) ,224 (-9. 40mor1dm3cm_1) ；1H 禾口 13C NMR 数据见表 1 ；IR :v(cm_1) = 3462，3426，3245，2896，1769，1724，1695，1641，1594， 1263, 1206, 1176, 1106, 1023,754 ；UV/Vis (MeOH) λ max ( ε ) = 358 (2305)，293 (454)， 207nm(10891moΓ1 Cta3CnT1) ；HR-ESIMS :m/z :calcd forC31H37O11NNa :622. 2261 ；found :622. 2262 [M+Na]+·表1.汉城链霉素的NMR数据Table 1. NMR spectral data of streptoseomycin in DMS0_d6 S 单峰，d 双重峰，t 三重峰，dd 四重峰，m 多重峰，br 宽单峰汉城链霉素(str印toseomycin)的Χ-ray单晶衍射分析=C31H37NO11, M599，空间
群P2(l)，晶胞参数a= 12.816(2)，b = 11.607(2)，c=15.681(3)A, α = 90.00°，β =
108. 12(3) ° , γ = 90. 00° ；晶胞体积 V-2105.2(7) A3，晶胞内分子数 Z = 4。Rf 和 Rw 值分 别为0.0696，0. 1102。用MoK α辐射、石墨单色器。用ω扫描方式，获得独立衍射点3699 个。在微机上用直接法(SHELXS-97)解析出汉城链霉素(str印toseomycin)的单晶结构 (见附图1)。实施例5 =MIC法测定汉城链霉素(str印toseomycin)抗厌氧菌活性1)培养基的制备强化布鲁氏琼脂中加入5% (ν/ν)溶解绵羊血、氯化血红素5 μ g/ml和1 μ g/ml维 生素K1。2)琼脂稀释平板的制备首先配制好不同浓度的试验用的抗生素溶液及事先配制好试验用的强化布鲁氏琼 脂。然后制备含不同浓度抗生素的琼脂平板。具体步骤如下在每块平板上标记好每一种抗 生素的浓度，然后放置于水平桌面上。将熔化的强化布鲁氏琼脂冷却至50°C左右，加入不同 浓度的抗生素，同时加入5% (ν/ν)溶解绵羊血，轻轻混勻，注意不要产生气泡，然后倒入平板 内，使其凝固，可放在无菌层流橱内并将平板盖半开着，或35°C孵育30min，使其表面干燥。
3)接种方法及接种菌量首先在平板上标记好接种菌的位点，使用含量为1 2 μ 1的多点接种器，蘸取菌 液后直接加在琼脂表面，每点最终接种菌量为105CFU。4)琼脂稀释法药敏试验首先将不同稀释度的抗生素加入已熔化并冷却至50°C左右的琼脂中，混勻后倾注 平板，待其凝固后，使用接种器将接种标准化的被检菌株菌悬液分别接种在含不同抗生素 的平板上，在接种后30min内将接种平板放入无氧环境中，越快越好，以免对氧极度敏感的 厌氧菌死亡。孵育48h后，肉眼检查接种的平板，能抑制细菌生长的最低的抗生素浓度，可 报告为抗生素的MIC。抗厌氧菌活性测试结果(表2)表明汉城链霉素(str印toseomycin)可以选 择性的抑制嗜酸乳杆菌(临床株)、双歧杆菌(临床株)、短真杆菌(临床株)、丙酸杆菌 (ATCC6919)和丙酸杆菌(ATCC11827)。表2化合物str印toseomycin的抗厌氧菌活性Table 2. the antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria of streptoseomycin *以硫酸庆大霉素(Gentamicin)为阳性对照以上结果提示，汉城链霉素(str印toseomycin)具有很强的抗厌氧菌活性且具有 一定的选择性，因此本发明的汉城链霉素可开发成新型抗生素。
权利要求
一种汉城链霉菌，其特征是在PDA平板上，菌落典型特征为基内菌丝黄色，易产生单个菌落，划线不连续气生菌丝灰褐色，孢子白色；在马丁培养基上，基内菌丝灰褐色，气生菌丝白色，孢子灰褐色，菌落产生花状边缘；在高氏一号平板上，基内菌丝灰褐色，气生菌丝白色，孢子灰褐色，菌落产生花状边缘；在查氏培养基上状态较特殊，基内菌丝浅黄色，气生菌丝亮黄绿色，孢子褐色。经中国科学院微生物研究所鉴定为汉城链霉菌Streptomyces seoulensis，现保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No.3689，保藏日期为2010年3月25日。
2.根据权利要求1所述汉城链霉菌发酵液制备的汉城链霉素，其特征是结构式为
3.根据权利要求2所述的汉城链霉素str印toseomycin的制备方法，其特征是由以下 步骤构成1)将新鲜的从对虾Penaeuschinensis肠道中分离、纯化得到的汉城链霉菌 Streptomycesseoulensis菌丝体块接种到高氏I号培养基中，于摇床上,在150rpm、28°C 条件下培养5天作为种子液；高氏I号培养基可溶性淀粉20g，KNO3 lg, NaCl 0. 5g, K2HPO4 · 3Η200· 5g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, IL 蒸馏水；2)然后将种子液接种于高氏或马丁培养基中，在150rpm、20-3(TC条件下发酵8天；3)将步骤2所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色粗浸 膏Fl ；4)将粗浸膏Fl悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓缩 得浸膏F2 ；5)对浸膏F2进行硅胶柱层析，依次用先4倍体积的氯仿，氯仿甲醇=100 1，氯 仿甲醇=100 2，氯仿甲醇=100 4，进行洗脱，浓缩100 4段得到黑色浸膏F3 ；6)然后对浸膏F3进行S^hadexLH-20分离，洗脱液氯仿甲醇体积比1 1，合并绿 色荧光部分洗脱液得淡黄色浸膏F4 ；7)对浸膏F4，用反相柱ODS进行分离，先用55%甲醇进行洗脱除去环二肽，然后用 65%甲醇洗脱，合并绿色荧光部分洗脱液得淡黄色固体F5 ；8)对浸膏F5，用高压液相色谱法制备得到汉城链霉素str印toseomycin。
4.根据权利要求2所述的汉城链霉素str印toseomycin在制备抗生素药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及从海洋放线菌(Streptomyces seoulensis)液体发酵物中提取的汉城链霉素(streptoseomycin)及其制备方法与应用。汉城链霉素从海洋来源的汉城链霉菌分离纯化发酵生产获得。汉城链霉素(streptoseomycin)对厌氧菌有很强的抑制作用，且对细胞没有毒性，因此汉城链霉素可作为抗生素生产的先导化合物，并在制备抗生素药物中得到应用。
文档编号A61P31/04GK101892181SQ20101018043
公开日2010年11月24日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者乔红运, 刘敏, 吴琦, 宋勇春, 梅亚宁, 谭仁祥 申请人:南京大学