专利名称：鳄鱼多肽粉及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鳄鱼产品，尤其是涉及一种鳄鱼多肽粉及其制备方法与应用。
背景技术：
蛋白作为人体必需的营养素，对人体的生命健康极为重要。流行病学调查结果表 明，如果每天蛋白摄入量过低，就容易患食管癌、胃癌、肝癌等。世界卫生组织和联合国粮农 组织的专家认为一个普通公民正常活动的标准饮食，每天蛋白摄入量不能低于75g。蛋白质 按照来源分为动物蛋白、植物蛋白、单细胞蛋白和藻类蛋白。这些大分子蛋白在一定程度上 补充人体所需要的蛋白，但是存在不易消化、吸收差、不耐酸性等缺点，有些蛋白还存在一 定的致过敏性。大量科学研究表明，通过选择适当蛋白酶，控制一定的水解程度，水解某些蛋白质 可得到大量生物活性多肽，这些生物活性多肽不仅具有活性高、易消化吸收和安全性高等 优点，而且具有特殊的生理调节功能，例如降低血脂、延缓衰老、美体养颜、抗氧化、抗忧郁、 抗疲劳、改善睡眠、增强记忆、抑制肿瘤等；还能促进人体对蛋白质、维生素及各种有益微量 元素的吸收。科学研究发现，机体内的活性多肽是沟通细胞与细胞之间、器官与器官之间的 重要化学信使，通过内分泌、旁分泌、神经内分泌以及神经分泌等作用方式，传递各种特异 信息，从而可调节生长、发育、繁殖、代谢和行为等生命过程。生物活性多肽研究领域发展很快，已经受到了各国科学家和政府的高度重视，且 随着现代蛋白工程酶技术迅速发展，酶解法生产生物活性多肽已取代了最初的直接提取法 和合成法等，成为当今多肽研究领域的热点。通过对食物蛋白进行酶解难或加工以获得生 物活性多肽，具有原料丰富、成本低廉、安全性好、便于工业生产、应用性好等独特的优点， 受到各国科学的推崇。活性多肽应用归结起来主要有医用和食用两大方面。活性多肽作为 药物，其活性作用点集中于较短多肽链上，不仅可以提高药物有效值和生物活性，而且可以 减少非目标活性成分的不良反应，提高其专一性。活性多肽在食品中的应用主要集中在功 能性食品上。功能性多肽保健食品在我国刚刚起步，且附加值高，具有巨大的市场空间，较 高的经济和社会效益。鳄鱼属脊椎动物爬行虫纲，广泛生长于越南、泰国、马来西亚等南亚国家，作为祖 龙现存唯一的后代，鳄鱼具有体形大、繁殖力强、生长快、抗病力强等特点。鳄鱼全身是宝， 鳄鱼的肉、骨、甲及内脏含有丰富的优良蛋白质和人体必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、维生 素及各种微量元素。现代医学研究发现，鳄鱼肉不但味美，而且能补气血、壮筋骨、治哮喘，对慢性咳 嗽、消渴病(糖尿病)也有显著疗效。公开号为CN1465351的发明专利申请提供一种抗癌新制品鳄鱼免疫抗癌丸，是以 人工饲养的鳄鱼的皮甲、肉骨、胆汁、血液等经加工精制后作为主要成分。本品对部分白血 病及已有转移的中、晚期癌症患者，收到较好效果。服用本品无任何毒性或副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种鳄鱼多肽粉及其制备方法与应用。本发明所述鳄鱼多肽粉的制备方法包括以下步骤1)将鳄鱼肉清洗去除脂肪组织后，剪成碎块；2)在鳄鱼碎块中加入水，置沸水浴煮后，勻浆，得鳄鱼肉勻浆液；3)在步骤2)所得的鳄鱼肉勻浆液中加入胰蛋白酶，水浴，酶解后得酶解混合液 A；4)将步骤3)所得的酶解混合液A置于沸水浴中，使酶失活，得酶解混合液B ；5)将步骤4)所得的酶解混合液B，冷却至室温后，过滤，得鳄鱼肉酶解液；6)将步骤5)所得的鳄鱼肉酶解液干燥，得产物即为鳄鱼多肽粉。在步骤1)中，所述碎块的大小可为1 2cm3。在步骤2)中，所述加入水的量，按体积比，鳄鱼碎块水可为1 (1 2.5);所 述沸水浴煮的时间可为20 40min。在步骤3)中，所述胰蛋白酶的加入量，按质量百分比，为鳄鱼肉的0.3% 0.5%， 所述水浴的温度可为40 45°C，所述酶解的时间可为4 6h。在步骤5)中，所述过滤可采用6 8层纱布过滤。在步骤6)中，所述干燥，可采用喷雾干燥。所得产品可用胶囊包装。本发明所制得的鳄鱼多肽粉含有蛋白质、多肽、氨基酸、糖、脂肪、水分、灰分和金 属元素等，由鳄鱼多肽粉的成分组成可以看出，鳄鱼多肽粉属于低糖、低脂、高蛋白食品。经鳄鱼多肽粉的体外抗氧化实验测定结果显示，鳄鱼多肽粉对各种自由基具有 较好的清除作用，当其浓度为6. Omg/ml时，其对DPPH的清除率可达44. 2% ；当其浓度为 3. 43mg/ml时，对羟基自由基清除率高达95. 5%;当其浓度为3. 5mg/ml时，对超氧阴离子自 由基的清除率可达56. 96%。连续喂食鳄鱼多肽粉20天，小鼠垂直爬绳实验和冰水浴负重 游泳实验结果显示，鳄鱼多肽粉能够较好地延长小鼠的爬绳及游泳力竭时间，垂直爬绳及 负重游泳力竭时间是反映动物运动疲劳程度的常用指标。这一结果进一步表明鳄鱼多肽粉 具有一定的抗疲劳，提高机体的运动能力功效，可在制备抗疲劳和提高机体运动能力药物 中应用。
图1为MALDI-T0F质谱检测鳄鱼多肽粉分子量分布范围。在图1中，横坐标为鳄鱼 多肽粉中各多肽离子的核质比m/z，数值上等于该肽段的相对分子量，纵坐标为鳄鱼多肽粉 中多肽离子流的强度(a. i)；从左至右的谱峰分别为684. 30，1041. 61，1107. 50，1184. 00， 1238.59，1286. 69。图2鳄鱼多肽粉对DPPH的清除作用。在图2中，横坐标为鳄鱼多肽粉的浓度 Concentration (mg/mL)，纵坐标为鳄鱼多肽粉对DPPH的清除百分率Clearup Rate(% )。图3鳄鱼多肽粉对羟自由基的清除作用。在图3中，横坐标为鳄鱼多肽粉的浓度 Concentration (mg/mL)，纵坐标为Fenton反应产生的羟基自由基的清除百分率Clearup Rate(% )，以未加鳄鱼多肽粉为实验对照组。
图4鳄鱼多肽粉对超氧阴离子自由基的清除作用。在图4中，横坐标为鳄鱼多肽 粉的浓度Concentration (mg/mL)，纵坐标为邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子自由基的清 除百分率Clearup Rate(% )，以未加鳄鱼多肽粉为实验对照组。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。实施例1鳄鱼多肽粉的制备1)称取2 5kg鳄鱼肉，清洗去除脂肪组织后，剪成大小为1 2cm3的碎块。2)按体积比，加入2 5蒸馏水，置沸水浴煮30min后，于组织捣碎机中勻浆，得鳄 鱼肉勻浆液。3)向步骤2)中所得的鳄鱼肉勻浆液中加入占鳄鱼肉质量0.4%的胰蛋白酶，充分 混勻后，于40 45°C水浴中，酶解4 6h，其间每隔20min搅拌一次。4)将步骤3)中所得的酶解混合液置于沸水浴中10 20min，使酶失活。5)将步骤4)中所得和酶解混合液，静置自然冷却至室温后，用6 8层纱布过滤， 得鳄鱼肉酶解液。6)将步骤5)中所得酶解液，进行喷雾干燥，仪器投条件设置为压力0. 08 0. 12MPa ；吹风速度0. 6 1. OmVmin ；入口温度120 130°C ；出口温度75 90°C ；进样速 度0. 8 1. 2L/h。产物即为鳄鱼多肽粉，保存于带盖玻璃瓶中。7)用2号胶囊以每粒300mg进行包装，即得鳄鱼多肽粉成品。实施例2鳄鱼多肽粉的成分测定称取一定量鳄鱼多肽粉，于蒸馏水复溶配制成200mg/mL母液，采用考马斯亮蓝法 测定母液的蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准品；采用Folin-酚法测定母液多肽含量，以 牛血清白蛋白为标准品；采用茚三酮比色法测定母液游离氨基酸的浓度，以甘氨酸为标准 品；含量采用硫酸-苯酚法测定的母液的总糖浓度，以葡萄糖为标准品；计算出蛋白、多肽、 游离氨基酸、总糖含量百分比。采用索氏提取法测定的脂肪含量百分比。采用常压干燥法测定水分含量百分比。采用高温灼烧的方法测定灰分含量百分比。具体步骤参见《食品检验与分析》(中 国轻工业出版社出版，1997)。实施例3鳄鱼多肽粉的金属元素含量测定称取0. 2g鳄鱼多肽粉于微波消解瓶中，加入5mL的浓硝酸，ImL浓高氯酸，置于微 波消解难中消解，消解后用双蒸水定容至IOOmL,采用原子吸收法，测定其金属元素含量。实施例4鳄鱼多肽粉的氨基酸组分分析称取一定量的鳄鱼多肽粉，用重蒸水溶解后对重蒸水透析除去无机盐小分子后， 取产物溶液加入终浓度为6mol/L HCl溶液中，在110°C下于封闭管内酸水解24h，将水解液 PH调至中性，并稀释至合适浓度，在Hitachi 835-50氨基酸自动分析仪上测定各种氨基酸含量。实施例5鳄鱼多肽粉的急性毒理实验按国标GB1519. 3-2003食品急性毒性试验，以小鼠为动物模型。选取清洁级KM 小鼠(由厦门大学抗癌研究中心实验动物室提供，许可证号SCXK(闽)2004-0001)，18
522g，雄性，各10只，标记、编号并称重。称取3g鳄鱼多肽粉溶于4mL双蒸水中并摇勻，得到 的检品浓度为0.75g/mL鳄鱼多肽粉。小鼠灌胃0.4mL/只(即剂量为15g/kg)后，连续观 察7天，并记录小鼠的饮食、饮水、排便、排尿、行动等日常情况，第7天称重后进行组织解剖 并观察器官病变情况。实施例6体外清除自由基能力称取一定量鳄鱼多肽粉，于蒸馏水复溶配制成200mg/ml母液。进行如下实验(1)对自由DPPH清除作用测定1.9mL无水乙醇中加入ImL不同浓度的效应物(鳄鱼多肽粉溶液)，加入0. ImL 3mmol/Ll, 1- 二苯基-2-苦苯胼自由基(DPPH)，立即混勻，室温反应30min，测0D517。清除率按以下公式计算 上式中，Atl为未加入效应物时的吸光度值(对照组)；Ai为加入效应物后的吸光度 值(加样组)。(2)对羟自由基的清除作用测定用Fenton反应产生羟基自由基。0. 5mL 9mmol/L FeSO4和ImL 9mmol/L水杨酸-乙 醇溶液中，加入ImL不同浓度效应物(鳄鱼多肽粉溶液)，最后加入ImL 8. 8mmol/LH202,立 即混勻启动反应，室温反应lh，测510nm的吸光值。基清除率按以下式子计算 上式中，Atl为未加入效应物时的吸光度值(对照组)A1为加入效应物后的吸光度 值(加样组)。(3)对超氧阴离子自由基的清除作用测定取2. 5mL pH8. 4浓度20mmol/L的Tris盐酸缓冲液，1. OmL蒸馏水混勻后在25°C 的水浴中保温20min，取出后立即加入在25°C预热的0. 5mmol/L邻苯三酚0. 3mL，在325nm 下测反应启动后Imin内邻苯三酚自氧化速率，为％。待测实验组取试剂同前，只是在加入 邻苯三酚前分别加入一定量的不同浓度的鳄鱼活性多肽母液，蒸馏水减少相应体积，测反 应启动后Imin内样品抑制邻苯三酚自氧化的氧化速率，为义。基清除率按以下式子计算 实施例7小鼠抗疲劳实验选用清洁级KM小鼠(由厦门大学抗癌研究中心实验动物室提供，许可证号 SCXK (闽)2004-0001)，18 22g，雄性，40只，随机分成4组即空白对照组和鳄鱼多肽粉高、 中、低剂量组，每组10只，标记、编号并称重。连续给药20天。
空白对照组小鼠灌胃0. 9% NaCl 0. 5mL/只，每天一次；鳄鱼多肽粉高、中、低各 剂量组浓度分别为0. 01g/mL、0. 02g/mL、0. 06g/mL，小鼠灌胃量为0. 5mL/只，每天一次。末 次给药12h后，将小鼠逐只放在垂直悬挂的细绳上，使其肌肉处于紧张状态或向上爬，记录 小鼠由于肌肉疲劳从细绳上跌落下来的时间。第3跌落时终止实验，累计3次的平均时间 作为爬绳时间。末次给药24h后，在小尾巴根本系上5g重砝码，将小鼠逐只放入游泳缸中 游泳，水温0°C (冰水混合浴)，水深20cm。记录小鼠从游泳开始至死亡时间。本发明所制得的鳄鱼多肽粉含有蛋白质、多肽及氨基酸含量丰富分别为1. 55%, 72. 75%, 2. 02%，酶解彻底；糖和脂肪含量较低，分别为1.24%，1.89%，另外其水分、灰分 含量分别为5.05%、4.98%，见表1。提示鳄鱼多肽粉属于低糖、低脂、高蛋白食品。金属元 素含量分析测定，对人体有益的金属元素含量丰富，含量从高到低依次为K、Na、Ca、Mg、Fe、 Zn、Cu，含量依次为31808. 18,2623. 64、1033. 53,253. 86,9. 89,5. 20、1. 37mg/kg，而对人体 有害的重金属Ag、Pb等含量大大低于国家食品检验标准(表2)。氨基酸组成测定结果显示，该活性多肽中氨基酸种类齐全，人体必需氨基酸(含 胱氨酸、酪氨酸)含量丰富，高达30. 11%,占氨基酸总量的39. 08%，而支链氨基酸与芳 香族氨基酸的比值为3. 63，显著高于各种鱼类，提示该活性多肽具有一定的保肝护肝功效 (表 3)。MALDI-T0F质谱检测，结果显示鳄鱼多肽粉分子量分布集中在1000_1300Da的这 个范围(图1)。经鳄鱼多肽粉的体外抗氧化实验测定结果显示，鳄鱼多肽粉对各种自由基具有较 好的清除作用，当其浓度为6. Omg/ml时，其对DPPH的清除率可达44. 2% (图2)。当其浓度为3. 43mg/ml时，对羟基自由基清除率高达95. 5% (图3)。当其浓度为3. 5mg/ml时，对超氧阴离子自由基的清除率可达56. 96% (图4)。连续喂食鳄鱼多肽粉20天，小鼠垂直爬绳实验和冰水浴负重游泳实验，结果显示 该产品能够较好地延长小鼠的爬绳及游泳力竭时间(表4)，垂直爬绳及负重游泳力竭时间 是反映动物运动疲劳程度的常用指标。这一结果进一步表明鳄鱼多肽粉具有一定的抗疲 劳，提高机体的运动能力功效。按国标GB1519. 3-2003食品急性毒性试验，以昆明种小白鼠为动物模型，结果显 示该活性多肽属无毒食品，安全可可靠。小鼠灌胃剂量为15g/kg，连续观察7天，第7天称 重。结果10只小鼠均健康成长、体重增加明显、没有出现行动迟钝、倦伏、运动失调、呼吸 加深、进食减少、饮水次数少、小大便不规则、四肢瘫软、昏迷等异常反应。解剖发现小鼠的
心、肝、脾、肾等各种器官没有明显的病变。表1鳄鱼多肽粉的成分分析 表2鳄鱼多肽粉的氨基酸组成分析 表3鳄鱼多肽粉的金属元素含量分析 表4鳄鱼多肽粉小鼠抗疲劳实验数据分析
对照组168 ±58209 ±25低剂量组203 ±39309 ±72实 验 组中剂量组278士115242 士 62髙剂量组212±78274 ±7权利要求
鳄鱼多肽粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)将鳄鱼肉清洗去除脂肪组织后，剪成碎块；2)在鳄鱼碎块中加入水，置沸水浴煮后，匀浆，得鳄鱼肉匀浆液；3)在步骤2)所得的鳄鱼肉匀浆液中加入胰蛋白酶，水浴，酶解后得酶解混合液A；4)将步骤3)所得的酶解混合液A置于沸水浴中，使酶失活，得酶解混合液B；5)将步骤4)所得的酶解混合液B，冷却至室温后，过滤，得鳄鱼肉酶解液；6)将步骤5)所得的鳄鱼肉酶解液干燥，得产物即为鳄鱼多肽粉。
2.如权利要求1所述的鳄鱼多肽粉的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述碎块的 大小为1 2cm3。
3.如权利要求1所述的鳄鱼多肽粉的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述加入水 的量，按体积比，鳄鱼碎块水为1 1 2. 5。
4.如权利要求1所述的鳄鱼多肽粉的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述沸水浴 煮的时间为20 40min。
5.如权利要求1所述的鳄鱼多肽粉的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述胰蛋白 酶的加入量，按质量百分比，为鳄鱼肉的0. 3% 0. 5%。
6.如权利要求1所述的鳄鱼多肽粉的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述水浴的 温度为40 45°C，所述酶解的时间为4 6h。
7.如权利要求1所述的鳄鱼多肽粉的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述过滤是 用6 8层纱布过滤。
8.如权利要求1所述的鳄鱼多肽粉的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述干燥，采 用喷雾干燥。
9.如权利要求1所述的鳄鱼多肽粉的制备方法所制得的鳄鱼多肽粉。
10.如权利要求9所述的鳄鱼多肽粉在制备抗疲劳和提高机体运动能力药物中的应
全文摘要
鳄鱼多肽粉及其制备方法与应用，涉及一种鳄鱼产品。提供一种鳄鱼多肽粉及其制备方法与应用。将鳄鱼肉清洗去除脂肪组织后，剪成碎块；在鳄鱼碎块中加入水，置沸水浴煮后，匀浆，得鳄鱼肉匀浆液；在所得的鳄鱼肉匀浆液中加入胰蛋白酶，水浴，酶解后得酶解混合液A；将所得的酶解混合液A置于沸水浴中，使酶失活，得酶解混合液B；将所得的酶解混合液B，冷却至室温后，过滤，得鳄鱼肉酶解液；将所得的鳄鱼肉酶解液干燥，得产物即为鳄鱼多肽粉。鳄鱼多肽粉具有一定的抗疲劳，提高机体的运动能力功效，可在制备抗疲劳和提高机体运动能力药物中应用。
文档编号A61K38/01GK101878849SQ20101020256
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者康劲翮, 张剑, 张祥盛, 李华亮, 熊佑熊, 胡泳华, 邱乒乒, 陈清西 申请人:厦门大学;泰国是拉差龙虎园有限公司