专利名称：欧芹素乙在制备防治肝炎或肝损伤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是香豆素类化合物欧芹素乙用于制备防治病毒性肝炎 以及抗免疫性或抗化学性肝损伤药物的新用途。
背景技术：
香豆素类化合物是顺式邻羟基桂皮酸脱水形成的内酯类化合物，此类化合物在伞 形科、芸香科、菊科、豆科、茄科植物中分布广泛，如蛇床子、独活、白芷、前胡、秦皮、茵陈、补 骨脂、续随子等中药均含有此类成分[罗雄明，漆淑华，尹浩，李敏一，高程海，张偎。直线 型呋喃香豆素类化合物及其药理活性的研究进展。天然产物研究与开发。2009;21(B05) 230-235]。欧芹素乙是香豆素类化合物中的一种，又名欧前胡素，其化学结构式如下香豆素类化合物欧芹素乙制备工艺简便，可以从植物中提取获得，也可采用香豆 素类化合物前体进行半合成的方法获得。[1.中华人民共和国卫生部药典委员会。中华人 民共和国药典一部。2010 97-98 ；2.《中草药》，1986，17 (2) :6]。现有研究报道，欧芹素乙 具有较强的抗凝血、镇静、抗炎、抗菌、抗诱变等作用，还能抑制由二磷酸腺苷(ADP)、花生四 烯酸(AA)、血小板活化因子(PAF)诱导的兔血小板聚集，拮抗肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞 介素I(IL-I)对脑血管平滑肌细胞的促增殖作用，拮抗TNF促进牛脑微血管内皮细胞与单 核细胞黏附的作用[1.刘厚佳，李铁军，邱彦，芮耀诚，卫立辛，吴孟超，张黎。欧芹素乙对 人脐静脉内皮细胞的保护作用及对血管内皮生长因子表达的影响。药学实践杂志。2009; 27(2) :94-98。2.嵇扬，曾国钱。欧芹素乙和异欧芹素乙对小鼠腹腔巨噬细胞体外释放肿 瘤坏死因子的影响。第二军医大学学报。1994;15(6) :511-513。3.李铁军，徐添颖，芮耀 诚，邱彦，张黎，杨鹏远。欧芹素乙对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。第二军医大学学 报。2004 ；25 (4) :431-433。]，但迄今尚未见有关欧芹素乙具有防治病毒性肝炎或肝损伤作 用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供香豆素类化合物欧芹素乙用于制备防治病毒性肝炎以及 抗免疫性或抗化学性肝损伤药物的新用途。经体内外实验表明，欧芹素乙具有抑制乙肝表面抗原(HbsAg)、乙肝病毒e抗原(HbeAg)及抗免疫性或化学性肝损伤的活性，因此可用于制备防治病毒性肝炎以及抗免疫 性或化学性肝损伤的药物。欧芹素乙制备方便、来源广泛，价格低廉、安全性高，具有良好的开发利用前景。本 发明为欧芹素乙提供了一种新用途，也为防治病毒性肝炎以及抗免疫性或化学性肝损伤提 供了一种新的药物来源。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但实施例仅用于说明本发明，本发明的 保护范围并不仅仅限于此。实施例1制备欧芹素乙白芷生药饮片(上海杨浦中药饮片厂)粉碎后过120目筛，取Ikg粉末，用5L 95% 乙醇热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩，回收乙醇，趁热分离水层。水层放 置凝固后，用100ml 40°C无水乙醇溶解，放置析晶。所得结晶再分别用IOml 40°C的95% 乙醇重结晶3次，用大孔吸附树脂纯化，得欧芹素乙9. 6mg。经HPLC检测，欧芹素乙纯度为 93. 2%。实施例2 欧芹素乙对乙肝病毒HBsAg、HBeAg表达的影响1.实验材料DMEM培养基美国Gibco公司产品，批号13200-035 ；小牛血清美国Gibco公司产品，批号16000-036 ；HBsAg检测试剂盒北京科卫临床诊断试剂生物技术有限公司产品，批号 200706003 ；HBeAg检测试剂盒北京科卫临床诊断试剂生物技术有限公司产品，批号 200708008 ；HepG 2. 2. 15细胞，由上海长海医院中心实验室提供，是共转染法将克隆双体HBV DNA及抗G418抗性质粒共转染人肝癌细胞株HepG2细胞所建立的，能转录、翻译HBV基因， 并能长期稳定地向培养上清液中分泌HBsAg和HBeAg，是目前国内外公认和常用的体外评 价抗HBV药物的细胞模型。欧芹素乙，由上海尚谊化工科技有限公司提供，纯度98% (下同)。阿昔洛韦(Aciclovir，ACV)湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所产品。2.细胞培养条件HepG 2. 2. 15细胞，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在体积分数5% CO2, 37 °C，饱和湿度下培养。3.实验分组空白对照组，不加细胞和药物，只加等体积含10% FBS的DMEM培养液；阴性对照组，加细胞不加药物，加等体积含10% FBS的DMEM培养液；阳性对照组细胞+阿昔洛韦溶液，所说的阿昔洛韦溶液是用含10% FBS的DMEM 培养液配成浓度为0. 02 μ mol/mL的溶液；欧芹素乙不同浓度组(简称药物组)细胞+不同浓度的欧芹素乙溶液，所说欧芹 素乙溶液是用含10% FBS的DMEM培养液配成欧芹素乙浓度分别为0. 125,0. 25，0. 5 μ mol/
4HiL的溶液。4.实验方法取对数生长期的H印G 2.2. 15细胞以IX IO5个/孔的密度接种于96孔板，每孔 0. lmL，置5% CO2, 37°C，饱和湿度下培养24小时，细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液， 然后按上述实验分组将培养液或药物溶液分别加入相应孔中，每组设4个复孔。在体积分 数5% CO2, 37°C，饱和湿度下培养。分别于第3天及第6天各换液一次并继续培养，第9天 收集细胞培养上清液，离心5min，取上清液，-20°C冰冻保存备用。用ELISA检测试剂盒测 定上清液中的HBsAg和HBeAg，酶标仪(检测波长570nm，参考波长630nm)测定A值。抑 制百分率(％)=[(阴性对照组A值-药物组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A 值)]X100%。5.实验结果实验结果见表1。表1 欧芹素乙对HBsAg、HbeAg表达的影响 由表1可见，欧芹素乙可以抑制H印G 2. 2. 15细胞分泌HBsAg、HBeAg，具有剂量依 赖性，特别是欧芹素乙高剂量组，抑制率与阳性对照组接近，提示欧芹素乙对病毒性乙型肝 炎具有一定的防治作用。实施例3欧芹素乙对免疫性肝损伤的保护作用1.实验材料卡介苗冻干粉(BCG)，购自中国药品生物制品检定所，用生理盐水配制成卡介苗浓 度为25mg/mL溶液；脂多糖(LPS)，购自SIGMA公司，用生理盐水配制成脂多糖浓度为75 μ g/mL溶液；天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)试剂盒，均购自南京 建成生物工程研究所；欧芹素乙用0. 25% CMC-Na分别配制成浓度为5、10、20mg/mL的混悬液；雄性ICR小鼠50只，体重18 25g，由第二军医大学实验动物中心提供，动物以颗 粒饲料喂养，自由摄食和饮水。2.实验方法将小鼠随机平均分为5组，每组10只，即阴性对照组正常小鼠不造模，给予等体积0. 25% CMC-Na溶液；模型组小鼠造模后给予等体积0. 25 % CMC-Na溶液；
欧芹素乙低剂量组造模后按体重给欧芹素乙，每天剂量为50mg/kg ；欧芹素乙中剂量组造模后按体重给欧芹素乙，每天剂量为100mg/kg ；欧芹素乙高剂量组造模后按体重给欧芹素乙，每天剂量为200mg/kg ；各组分别处理如下除阴性对照组外，其余各组小鼠按体重尾静脉注射2. 5mg/kg的BCG造模。然后， 按上述分组分别给予每组小鼠灌胃相应溶液阴性对照组灌胃0. 25% CMC-Na溶液，每天1次，连续12天； 模型对照组小鼠造模后灌胃0. 2mL 0. 25 % CMC-Na溶液，每天1次，连续12天；欧芹素乙低剂量组小鼠造模后按体重灌胃上述配制的欧芹素乙溶液，每天剂量 为50mg/kg，连续12天;欧芹素乙低剂量组小鼠造模后按体重灌胃上述配制的欧芹素乙溶液，每天剂量 为100mg/kg，连续12天;欧芹素乙低剂量组小鼠造模后按体重灌胃上述配制的欧芹素乙溶液，每天剂量 为200mg/kg，连续12天;第12天给药2小时后，模型对照组和欧芹素乙低、中、高剂量组的小鼠按体重经尾 静脉注射7. 5 μ g/10g的LPS，注射LPS后6小时，取眼眶静脉丛血液，3000rpm/min,离心10 分钟，分离血清，按试剂盒说明书方法测定天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水 平。另切取肝脏标本，按常规用生理盐水制备10%的肝组织勻浆，取上清液，按试剂盒方法 测定上清液的丙二醛(MDA)含量。数据结果采用Mean士SD表示，用SPSS13. 0软件进行方 差分析。3.实验结果，见表2。表2欧芹素乙对免疫性肝损伤小鼠ALT、AST及MDA水平的影响(Mean士SD，η = 10) 注*与模型对照组比较，P < 0. 05由表2可见，与模型对照组相比，欧芹素乙低、中、高剂量组均能显著改善免疫性 肝损伤小鼠的AST、ALT及MDA指标，表明欧芹素乙具有治疗免疫性肝损伤的作用。实施例4欧芹素乙对化学性肝损伤的保护作用1.实验材料四氯化碳(CCl4)，分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司产品；食用大豆油，金龙鱼食用油公司产品；
天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)试剂盒，均购自南京 建成生物工程研究所；欧芹素乙用0. 25% CMC-Na分别配制成浓度为5、10、20mg/mL的混悬液；ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18 25g，由第二军医大学实验动物中心提供。2.实验方法将小鼠随机平均分为5组，每组10只，雌雄各半，即阴性对照组正常小鼠，不给药，不造模；模型对照组不给药，用CCl4造成肝损伤模型；欧芹素乙低剂量组按体重灌胃欧芹素乙，每天剂量为50mg/kg ；欧芹素乙中剂量组按体重给欧芹素乙，每天剂量为100mg/kg ；欧芹素乙高剂量组按体重给欧芹素乙，每天剂量为200mg/kg ；阴性对照组、模型对照组灌胃等体积0. 25% CMC-Na,连续灌胃给药7天；末次给药 后1小时，阴性对照组小鼠腹腔注射大豆油(按体重20ml/kg)。欧芹素乙高、中、低剂量组 按上述分组灌胃不同剂量的欧芹素乙药物，连续7天。末次给药后1小时，将模型对照组和 欧芹素乙药物组小鼠一起，均按体重腹腔注射含0. 1% CCl4大豆油溶液20ml/kg。全部动 物于最后1次给药16小时后，取眼眶静脉丛血液，3000rpm/min,离心10分钟，分离血清，按 试剂盒说明书测定天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平。另切取肝脏标本， 用生理盐水制备10%的肝组织勻浆，取上清液按试剂盒说明书测定丙二醛(MDA)含量。数 据结果采用Mean士SD表示，用SPSS13. 0软件进行方差分析。3.实验结果结果见表3。表3 欧芹素乙对化学性肝损伤小鼠ALT、AST及MDA水平的影响(Mean士SD，n = 10) 注*与模型组比较，P < 0. 05由表3可见，与模型对照组相比，欧芹素乙高、中、低剂量组均能显著降低AST、ALT 及MDA的水平，且具有剂量依赖性。提示欧芹素乙具有改善肝功能的作用，能预防小鼠化学 性肝损伤。实施例5欧芹素乙的急性毒性实验1.实验材料
ICR小鼠50只，由第二军医大学动物中心提供，雌雄各半，体重18 25g，动物以 颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。欧芹素乙由实施例1制备，用0.25% CMC-Na分别配制成浓度为450mg/mL和 270mg/mL的混悬液。2.实验方法ICR小鼠按体重单次灌胃欧芹素乙4. 5g/kg，或ICR小鼠按体重单次腹腔注射欧芹 素乙2. 7g/kg，观察给药后动物14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次灌胃 给药后，小鼠活动滞缓，静卧少动，30-50分钟后即恢复正常。给药后14天内，小鼠未出现 死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。小鼠腹腔注射给药 后20分钟，3只小鼠出现精神萎靡、蜷缩，活动减少，给药后Ih后，全部小鼠恢复正常，给药 后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病 变。3.实验结果上述急性毒性实验结果表明，灌胃给药最大耐受量MTD不低于4. 5g/Kg，腹腔注射 给药最大耐受量MTD不低于2. 7g/Kg，说明欧芹素乙的毒性较低。
权利要求
香豆素类化合物欧芹素乙在制备防治病毒性肝炎药物中的应用。
2.香豆素类化合物欧芹素乙在制备防治免疫性或化学性肝损伤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是香豆素类化合物欧芹素乙用于制备防治病毒性肝炎以及抗免疫性或抗化学性肝损伤药物的新用途。经药理实验表明，欧芹素乙具有较强的抑制乙肝表面抗原(HbsAg)、乙肝病毒e抗原(HbeAg)及抗免疫性或化学性肝损伤的活性，因此可用于制备防治病毒性肝炎以及抗免疫性或化学性肝损伤的药物。欧芹素乙制备方便、来源广泛，价格低廉、安全性高。本发明为欧芹素乙提供了一种新用途，也为防治病毒性肝炎以及抗免疫性或化学性肝损伤提供了一种新的药物来源。
文档编号A61K31/37GK101904839SQ20101024775
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者刘厚佳, 卫立辛, 张黎, 李铁军, 潘勇华, 王卓, 王晓黎, 王晶, 芮耀诚, 赵娜萍, 辛海量, 霍炎, 马建丽, 高申 申请人:中国人民解放军第二军医大学