专利名称：连翘氯仿提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物，特别涉及连翘氯仿提取物在制备治疗糖尿病药物中 的应用。
背景技术：
酪氨酸磷酸酶SHP2是酪氨酸磷酸酶(tyrosine phosphatase)家族中的一个 重要成员，它的发现使人们第一次认识到蛋白激酶抗衡剂和抗衡机制的存在(Feng GS, Hui CC, Pawson T :SH2_containing phosphotyrosine phosphatase as a target of protein-tyrosine kinases. Science 1993，259 (5101) :1607_1611)。随后大量的系统研 究表明，SHP2不单单作为蛋白激酶信号的抗衡剂而抑制信号传导，也能促进多种细胞质信 号(2.Feng GS :Shp2_mediated molecular signaling in control of embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Cell Res 2007，17 (1) :37_4L 3. Feng GS Shp2 as a therapeutic target for leptin resistance and obesity. Expert Opin Ther Targets 2006，10(1) :135_142· 4. Mohi MG，Neel BG :The role of Shp2 (PTPNll) in cancer. Curr Opin Genet Dev 2007，17(1) :23_30.)。在代谢性疾病方面，通过一系列组织 特异性转基因动物模型，证明SHP2的正常活性是防止糖尿病的关键信号，其活性降低则诱 发糖尿病(5. Zhang SS, Hao E, Yu J, et al. Coordinated regulation by Shp2 tyrosine phosphatase of signaling events controlling insulin biosynthesis in pancreatic beta-cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2009,106(18) :7531_7536 ；6.Princen F,Bard E, Sheikh F,et al.Deletion of Shp2 tyrosine phosphatase in muscle leads to dilated cardiomyopathy, insulin resistance, and premature death. Mol Cell Biol 2009, 29(2) 378-388 ；7.Krajewska Μ,Banares S,Zhang EE,et al. Development of diabesity in mice with neuronal deletion of Shp2 tyrosine phosphatase. Am J Pathol 2008, 172(5) 1312-1324 ；8. Zhang EE,Chapeau E,Hagihara K,et al. Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism. Proc Natl Acad Sci USA 2004,101(45) 16064-16069 ；9.Bard-Chapeau EA，Yuan J, Droin N, et al. Concerted functions of Gab land Shp2 in liver regeneration and hepatoprotection. Mol Cell Biol 2006,26(12) 4664-4674 ； 10.Bard-Chapeau EA, Hevener AL, Long S, et al. Deletion of Gab Iin the liver leads to enhanced glucose tolerance and improved hepatic insulin action. Nat Med 2005，11 (5) :567_571.)。 SHP2 是糖尿病禾口 肥胖症的关键调控蛋白，SHP2在前脑剔除后，小鼠发生肥胖症，体重明显高于正常小鼠，血 液胰岛素和瘦素升高，产生高血糖、胰岛素、瘦素抵抗等II型糖尿病症状，随后发展则出现 多种糖尿病的典型并发症。而SHP2在前脑持续表达高活性时，小鼠不论进食多少，都不发 胖。另外，应用SHP2在肝脏、胰腺组织特异性剔除或激活的转基因小鼠，证明SHP2具有促 进和维护胰岛素的分泌，促进胰岛素调控肝细胞糖代谢的作用。连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspense(Thunb. ) Vahl的干燥果实。性微寒，味苦。具有清热解毒，消肿散结的功效。传统应用主要用于外感风热、咽喉肿痛、痈肿疮疖、 瘰疬等疾病的治疗。连翘中的化学成分主要是木脂素类、黄酮类、苯乙醇及其苷类及C6 C2天然醇类、萜类等。药理研究表明，连翘具有抗菌、抗病毒、抗炎、治疗心血管疾病、抗内 毒素、抑制弹性蛋白酶活力、抑制cAMP磷酸二酯酶活力、保肝作用等药理作用(11.张海 燕.连翘化学成分及药理活性的研究进展.中药材，2000，23 (10) :10)。但连翘在降糖方面 的应用却没有研究报道，因此，以SHP2为靶点，开发新型的连翘降糖药物具有十分重大的
眉、ο
发明内容
本发明的目的在于提供连翘氯仿提取物在制备酪氨酸磷酸酶SHP2促进剂和制备 治疗糖尿病药物中的应用。所述连翘氯仿提取物通过如下方法制备将干燥连翘经乙醇浸泡，加热回流后合 并提取液，减压干燥得连翘总提取物；再将连翘总提取物与硅藻土混合，或将连翘总提取物 用水混悬，采用氯仿萃取，减压浓缩，干燥，即得连翘氯仿提取物。经过氯仿萃取后的剩余连翘提取物可依次采用乙酸乙酯、乙醇(正丁醇)以及水 萃取，再分别减压浓缩，干燥，可得其它连翘提取物。所述连翘氯仿提取物能够促进酪氨酸磷酸酶SHP2的活性，发挥降低血糖浓度的 作用，在制备治疗糖尿病的药物上具有广泛的应用。利用酶和底物的反应，建立一个成熟有效的SHP2酶活性分析体系，可高通量的筛 选影响SHP2酶活性的成分。利用GST蛋白纯化的方法，从细菌中提取和纯化SHP2蛋白。将 SHP2 蛋白与它的催化底物 DiFMUP (8-diXuoro-4-methylumbelliferyl phosphate)发生荧 光反应，利用酶标仪读数，确立理想的SHP2蛋白和催化底物DiFMUP的使用量，建立灵敏高 效的SHP2酶活性分析模型。利用所述SHP2酶活性分析模型，对2000余个中药分离馏分的 活性进行筛选，发现所述连翘氯仿提取物具有明显的SHP2酶活性促进作用，并通过动物实 验证实所述连翘氯仿提取物能够通过SHP2这个靶点起到治疗糖尿病的作用。
图1为不同连翘提取物对酪氨酸磷酸酶SHP2酶活性的促进作用。在图1中，横坐 标为不同连翘提取物，浓度均为3. 84 μ g/mL，纵坐标为酪氨酸磷酸酶SHP2酶活性(％ )。图2为不同浓度连翘氯仿提取物对多种酪氨酸磷酸酶的作用。在图2中，横坐标 为连翘氯仿提取物浓度(μ g/mL)，纵坐标为连翘氯仿提取物对于不同酪氨酸磷酸酶的促进 率(% )；标记 为 SHP2，·为 SHP1，▲为 H印tp，·为 VHR。
具体实施例方式实施例1 连翘提取物的提取干燥连翘5kg，6倍量60%乙醇浸泡，加热回流4次，每次2. 5h，合并提取液，减压 干燥得连翘总提取物1000g。连翘总提取物用3 5倍量的硅藻土混勻，或将总提取物用水 混悬，混悬液用等体积的氯仿萃取，减压浓缩，干燥，即得连翘氯仿提取物260g。经过氯仿萃取后的剩余连翘提取物(水混悬液)再根据同样的方法用乙酸乙酯、
4乙醇(或正丁醇)依次萃取，分别减压浓缩、干燥各提取物。得连翘乙酸乙酯提取物90g，连 翘乙醇(或正丁醇)提取物221g以及连翘水提取物400g。实施例2 连翘提取物对SHP2的促进作用1、SHP2促进作用的活性评价方法利用酶和底物的反应，建立一个成熟有效的酶活性分析体系，可高通量的筛选影 响SHP2酶活性的成分。利用GST蛋白纯化的方法，从细菌中提取和纯化SHP2蛋白。将SHP2 蛋白与它的催化底物 DiFMUP (8-diXuoro-4-methylumbelliferyl phosphate)发生荧光反 应，利用酶标仪读数，确立理想的SHP2蛋白和催化底物DiFMUP的使用量，建立灵敏高效的 SHP2活性分析模型。利用96孔酶标板，将不同的馏分或天然小分子加入处理SHP2活性分 析体系，筛选促进SHP2活性的阳性小分子。将筛选得到的阳性小分子处理其他酪氨酸磷酸 酶VHR、Heptp, SHPl的活性分析体系，分析它们是否是SHP2活性的特异性促进剂。2、活性评价结果对实施例1中的不同连翘提取物(3. 84 μ g/ml)进行SHP2酶活性促进作用评价， 结果显示，连翘氯仿提取物具有很好的SHP2酶活性促进作用，连翘乙酸乙酯提取物，连翘 乙醇(正丁醇)提取物以及连翘水提取物对于SHP2酶活性促进能力较弱或无促进作用(参 见图1)。随后，用不同浓度的连翘氯仿提取物，处理SHP2及酪氨酸磷酸酶家族的另外三个 成员VHR、!feptp、SHPl，观察连翘氯仿提取物对各蛋白酶活性的促进作用，评价其对SHP2酶 活性的促进作用是否具有特异性。结果显示连翘氯仿提取物对SHP2酶活性的促进作用随 馏分浓度增加而增加，表现出良好的浓度依赖性，其对酪氨酸磷酸酶家族的另外3个成员 VHR,Heptp,SHPl的酶活性没有明显的促进作用。表明连翘氯仿提取物对于SHP2的促进作 用具有特异性(参见图2)。实施例3 连翘氯仿提取物的降糖作用采用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型实施。小鼠选用昆明小白鼠雌雄各 半，4周龄时购入，自由饮水摄食适应一周，开始利用链脲佐菌素造模。将小鼠分成2组，糖 尿病诱导组、注射柠檬酸缓冲液组。注射前将各小鼠称重，小鼠在注射链脲佐菌素液时应该 先禁食6小时。糖尿病诱导组按照小鼠体重40mg/kg的比例腹腔注射STZ-柠檬酸缓冲液 (STZ溶于0. lmol/L pH4. 5的柠檬酸缓冲液中)；对照组注射等量的柠檬酸缓冲液；连续注 射5天。随后，小鼠置于正常环境下饲养，每7天测血糖值(剪尾取血)，连续3周，非禁食 条件下血糖值在16. 7mmol/L以上的小鼠即为糖尿病小鼠模型。按血糖值均衡随机分组，每 组20只小鼠，每组小鼠血糖均值基本一致。以盐酸二甲双胍为阳性对照药，连翘氯仿提取 物的溶剂为阴性对照，连翘氯仿提取物设100mg/kg、400mg/kg、800mg/kg 3个剂量。另取1 组小鼠，腹腔注射生理盐水作为正常对照组，根据小鼠体重按照0. 02ml/g的量对小鼠进行 灌胃，每日一次，连续两周。在每日上午10时对小鼠进行禁食，禁食6小时后再对小鼠进行 灌胃。在第7天和第14天，禁食3h各测血糖一次。结果如表1所示，3个不同剂量的连翘氯仿提取物均表现出明显的降低血糖的作用。表1连翘氯仿层提取物对小鼠血糖的作用
5 a.与溶剂模型组比较，t-检验的ρ值。*p < 0. 05，< 0. 01。
权利要求
连翘氯仿提取物在制备酪氨酸磷酸酶SHP2促进剂中的应用。
2.连翘氯仿提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
全文摘要
连翘氯仿提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用，涉及一种中药提取物。提供连翘氯仿提取物在制备酪氨酸磷酸酶SHP2促进剂和制备治疗糖尿病药物中的应用。所述连翘氯仿提取物通过如下方法制备将干燥连翘经乙醇浸泡，加热回流后合并提取液，减压干燥得连翘总提取物；再将连翘总提取物与硅藻土混合，或将连翘总提取物用水混悬，采用氯仿萃取，减压浓缩，干燥，即得连翘氯仿提取物。所述连翘氯仿提取物能够促进酪氨酸磷酸酶SHP2的活性，发挥降低血糖浓度的作用，在制备酪氨酸磷酸酶SHP2促进剂和制备治疗糖尿病的药物上具有广泛的应用。
文档编号A61K131/00GK101912446SQ20101025647
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者吕忠显, 布艳艳, 石涛, 蒙明慧, 陈全成, 陈海峰 申请人:厦门大学