专利名称：藤黄酸作为热休克蛋白90抑制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及藤黄酸，特别涉及藤黄酸作为热休克蛋白90抑制剂的应用。
背景技术：
热休克蛋白(Heat shock proteins，Hsps)是真核细胞中的一类分子伴侣，其主 要功能是参与新生蛋白的合成、变性蛋白的复性及细胞内部蛋白的迁移等生命活动。热休 克蛋白90(Hsp90)作为热休克蛋白家族中重要的一员，在细胞的生命活动中扮演重要的角 色，其在细胞中的含量约占细胞蛋白总量的 2%。Hsp90参与细胞代谢、生长、发育、分 化、死亡和免疫等几乎所有的生理过程的调节，因此其活性异常与人体的许多疾病(如神 经退行性疾病、心血管类疾病、病毒感染和癌症等)密切相关。人体中的Hsp90 —般可以分为Hsp90 α、Hsp90 β、GRP94和TRAPl等亚型，其单体 由一个25kDa的N-末端和一个15kDa的C-末端，通过约40kDa的中间连接区(TRAP1不含 这个区)组成。目前针对Hsp90开发的抑制剂类化合物，有些已作为抗肿瘤药物应用于临 床研究。寻找和发现新颖的Hsp90抑制剂，对于Hsp90相关疾病的治疗具有重要的意义。藤黄酸是60年代从中药藤黄中分离到的蒽酮类化合物，早期的研究表明藤黄 酸对肿瘤细胞有较强的抑制作用(Guo QL，You QD, Wu ZQ，Yuan ST, Zhao L =General gambogic acids inhibited growth of human hepatoma SMMC-7721 cells in vitro and in nude mice. Acta PharmacolSin 2004，25 :769_774.)，但迄今尚未见藤黄酸作为 Hsp90 抑制剂应用的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供藤黄酸在制备热休克蛋白90抑制剂中的应用。所述藤黄酸的名称为(ζ) _甲基-3-戊烯基)_ ； 1，5- 二亚甲基-1，3，11-三氢-呋 喃并(3,4-g)吡喃并(3,2-b)蒽酮-1-巴豆酸，分子式为C38H44O8，结构式为 所述藤黄酸(Gambogic acid，简称GB)为金黄色结晶，旋光度为-685° (甲醇)， 不易溶于水，在甲醇等有机溶剂中有较好的溶解性。实验表明，所述藤黄酸对Hsp90具有较强的抑制作用，是Hsp90的非竞争性可逆抑 制剂。其对HeLa细胞的IC5tl低于1 μ mol/L，具有很强的抗肿瘤活性，能够诱导肿瘤细胞的 凋亡，抗肿瘤作用靶点明确，可用于制备治疗癌症等的药物。鉴于藤黄酸对Hsp90的抑制作用，且Hsp90在引起肿瘤细胞凋亡等生物学过程中发挥着重要的作用，因而藤黄酸可在制 备热休克蛋白90抑制剂中的应用。
图1为藤黄酸对Hsp90的ATPase活性的抑制作用。在图1中，横坐标为化 合物Compounds,浓度均为200ymol/L,纵坐标为抑制率Inhibition(% )，图1表明， 藤黄酸对Hsp90的ATPase活性的抑制作用最强，抑制率接近80%，甚至高于阳性对照 GA(geldanamycin)。图2为藤黄酸作用HeLa细胞24h后相关蛋白质表达的Western blot分析结果。 在图2中，随着藤黄酸浓度(0. 2、0. 5、1.0、1.5μπιΟ1/ 的增加，Hsp90的客户蛋白Akt和 磷酸化的Akt表达量下调，而Hsp70的表达量显著上调，表明藤黄酸对Hsp90客户蛋白质具 有降解作用。图2中的GA为阳性对照。图3为藤黄酸对Hsp90内源荧光的影响。在图3中，横坐标为波长 Wavelength (nm)，纵坐标为荧光强度 Fluorescence Intensity (a. u)。藤黄酸对 Hsp90 的内 源荧光具有较强的淬灭作用，随着浓度的增加，淬灭作用增强。表明藤黄酸与Hsp90间形成 了静态复合物。由上述曲线可以计算得出藤黄酸与Hsp90的解离常数约为3. 5ymol/L。图4为分子相互作用仪(Fortebio)检测藤黄酸与Hsp90的结合。在图4中，横坐 标为结合与解离的时间(sec)，纵坐标为光移动的距离Shift，不同浓度(0、l、2、5ymOl/L) 的藤黄酸与Hsp90结合的曲线见图4中的600s以内的曲线。而600s以上的曲线为二者解 离的曲线。经计算得出二者间的解离常数约为3.0 μ mol/L。图5为藤黄酸对Hsp90紫外可见光谱的影响。在图5中，横坐标为波长(nm)，纵坐 标为Hsp90在有无藤黄酸存在时的吸收光谱Absorption。由图5可见，随着藤黄酸浓度的 增加，Hsp90的吸收光谱发生有规律的变化，进一步表明藤黄酸与Hsp90结合，导致其发色 团受到影响，从而使吸收光谱发生改变。图6为藤黄酸对Hsp90构象的影响。在图6中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为偏 振光的吸光度差(mdeg. cm. μ mol/L)，由图6可见，在浓度为1. 4 μ mol/L的藤黄酸作用下， Hsp90的α -螺旋结构由原来的21. 5%降低至17. 5%，即藤黄酸的结合导致Hsp90构象的改变。图7为藤黄酸对Hsp90的非竞争性可逆抑制作用。图7是双倒数图，横坐标为ATP 浓度的倒数1/[ATP]，纵坐标为反应速度的倒数1/v。由图7可见，藤黄酸对Hsp90的ATPase 活性的抑制作用的双倒数图呈现横轴的截距不变，而纵轴的截距逐渐变低的系列直线。由 此可以判断藤黄酸是Hsp90的非竞争性可逆抑制剂。图8为藤黄酸对HeLa细胞的细胞毒作用。在图8中，横坐标为藤黄酸的浓度 Concentration ( μ M)，纵坐标为HeLa细胞的抑制率Inhibition )。图8表明藤黄酸对 HeLa细胞的抑制作用呈现浓度依赖性。由此计算得出其IC5tl约为0. 69 μ mol/L。图9为藤黄酸对HeLa细胞形态的影响。由图9可见，随着藤黄酸浓度的增高，细 胞形态发生明显改变。从左至右分别为阴性对照；0.2、0.5、1.0、1.5ymol/L的藤黄酸以及 阳性对照(GA)的作用结果。可见藤黄酸在浓度较高时，其对HeLa细胞的形态影响较大，细 胞出现收缩变圆的凋亡形态。
图10为藤黄酸诱导HeLa细胞凋亡。图10中横坐标为DNA含量DNA content,纵 坐标为细胞数Relative cell number ；在图 10 中，用不同浓度(0、0· 2、0· 5、1. 0、1. 5 μ mol/ L)的藤黄酸作用HeLa细胞24和48h后用流式细胞仪分析细胞周期的变化。随着浓度和作 用时间的延长，HeLa细胞周期分布发生明显的变化，约有75%的细胞发生凋亡。图11为藤黄酸对HeLa细胞中凋亡调控蛋白质表达的影响。藤黄酸引起HeLa细 胞的凋亡与Hsp90客户蛋白的降解及Bax(—种促凋亡蛋白质)升高以及凋亡抑制蛋白质 XIAP的下调有关。
具体实施例方式下面结合具体实例进一步阐述本发明，但这些实例仅用于说明本发明，而不用于 限制本发明的范围。实施例1、藤黄酸对Hsp90的ATP酶(ATPase)活性的抑制作用采用孔雀绿磷钼酸铵分析法检测藤黄酸对Hsp90催化ATP水解的抑制作用。预先配置无机磷检测试剂Solution A (孔雀绿、聚乙烯醇、钼酸铵与水按 2:1:1: 2混合)，Solution 8(34%的柠檬酸钠)。实验中的6々(格尔德霉素)、1 ((根 赤壳菌素)、NB (新生霉素)及CM(潮霉素)均为已知的Hsp90抑制剂，作阳性对照，DMSO 为阴性对照，空白对照以GST(谷胱甘肽转硫酶)代替Hsp90。反应开始时，Hsp90与化合物 (浓度均为200μπιΟ1/ 室温下混合lh，加入ATP启动反应，反应在96孔板中进行。37°C， 反应3h。3h后加入80 μ L Solution A终止ATP水解反应，约5min后加入10 μ L Solution B终止显色反应，15min后于酶标仪检测OD62tl的值，每组数据做3次平行。抑制率(％ )= (阴性对照的3次平均值-实验组的平均值)/(阴性对照的3次平均值-空白对照组的平 均值)X 100%采用孔雀绿磷钼酸铵分析法，发现藤黄酸对Hsp90的ATPase活性有很强的抑制作 用。在测试的所有化合物中，藤黄酸对Hsp90的ATPase活性的抑制作用最强，在200 μ mol/ L时，其抑制率接近80% (图1)。实施例2、藤黄酸对Hsp90客户蛋白的降解作用在该实施例中，采用Western Blot法检测藤黄酸对肿瘤细胞中Hsp90的客户蛋白 的降解作用。分别用0. 2、0· 5、1、1. 5 μ mol/L的藤黄酸处理HeLa细胞24h，1 μ mol/L的GA作为 阳性对照，等量DMSO作为阴性对照。吸去培养液，用PBS漂洗一次，加入细胞裂解液，4°C裂 解5min左右，快速刮取细胞置于1. 5mL离心管中。冰浴超声裂解细胞10次，每次ls，得到 的细胞裂解液于4°C，13500rpm离心15min。取上清，Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋 白浓度一致，加入2 X sample buffer (样品缓冲液)混勻，100°C水浴lOmin，进行SDS-PAGE 电泳。再100V电泳转膜Ih到预先用甲醇浸润过的硝酸纤维素(PVDF)膜上。5% BSA(牛 血清蛋白)室温封闭lh，一抗(体积比1 1000稀释)室温孵育2h，TBST (Tris Buffered Saline with Tween)洗涤3次，每次lOmin。二抗(体积比1 5000稀释)室温孵育lh， TBST洗涤后的PVDF膜用增强型化学发光剂(ECL)溶液浸润，显影观察。不同浓度的藤黄酸处理HeLa细胞24h后，Western blot检测与Hsp90相关蛋白 的表达水平，结果发现Hsp90的客户蛋白Akt出现降解，而磷酸化的Akt (p-Akt)的水平下调；同时Hsp70表达量上调(图2)，与阳性对照GA的作用结果一致，表明藤黄酸在细胞水 平上，亦对Hsp90具有较强的抑制作用。实施例3、荧光光谱法检测藤黄酸与Hsp90的结合在该实施例中，使用荧光光谱法检测藤黄酸与Hsp90的结合作用。使用大肠杆菌异源表达Hsp90融合蛋白，蛋白溶于PBS(pH 7.4)中。实验前先将 Hsp90用PBS(pH 7.4)稀释至1 μ mol/L，取2mL至荧光比色皿并置于荧光分光光度计中，实 验分别在293，303和3101( 3个温度下进行。藤黄酸溶于DMSO中，浓度为lOmol/L。实验采 取滴加的方式增加体系中抑制剂的含量，每次加入后都要充分混勻，待体系稳定后重复测 定三次。藤黄酸的浓度变化分别为0、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10ymol/L。仪器参数设置激发波长为280nm，激发及发射狭缝宽度均为5nm，扫描速度为快 速扫描(间隔2nm/次)，记录290 500nm的荧光光谱。藤黄酸对Hsp90的内源荧光具有较强的猝灭作用(图3)，表明Hsp90与藤黄酸间 形成了静态复合物。经计算得出二者的解离常数约为3. 5 μ mol/L。实施例4、Fortebio实验证明藤黄酸与Hsp90的结合在该实施例中，采用Fortebio法验证藤黄酸与Hsp90的结合。使用大肠杆菌异源表达Hsp90融合蛋白，将Hsp90蛋白用生物素(biotin，B)进 行标记，利用B与(str印tavidin，SA)特异性的结合将目的蛋白固定在SA-biosenser上。 标记后的蛋白B-Hsp90过脱盐柱将未结合的B截留，并收集B-Hsp90浓缩至10 μ mol/L 于-80°C贮藏。实验中Hsp90蛋白浓度为0. 7 μ mol/L,藤黄酸浓度分别为1、2、4、5 μ Μ,结合 与解离的时间均为lOmin，实验温度为303K。藤黄酸与Hsp90的结合及解离曲线(图4)以及由此计算得出的解离常数 (3. O μ mol/L)，表明Hsp90与藤黄酸有较强的结合。实施例5、吸收光谱法检测藤黄酸与Hsp90的结合在该实施例中，采用紫外可见光谱法检测Hsp90与藤黄酸的结合。 使用大肠杆菌异源表达Hsp90融合蛋白，Hsp90溶于PBS (pH = 7. 4)中。实验前 先用PBS对仪器进行基线校正，将Hsp90稀释至3. 3 μ mol/L。藤黄酸溶于DMSO中，实验采 取逐滴加入的方式，每次加入后充分混勻并反应lmin，记录200 500nm的吸收光谱。实验 在298K下进行，藤黄酸的浓度变化分别为l、2、3、4、6、7.5、9ymol/L。空白对照为相同条件 下100 μ L PBS中加入等量的化合物或DMS0，作为本底值在数据处理中扣除。随着藤黄酸浓度的增加，Hsp90的吸收光谱发生有规律的变化(图5)，进一步表明 藤黄酸与Hsp90结合，导致其发色团受到影响。实施例6、藤黄酸对Hsp90 二级结构的影响在该实施例中，采用圆二色谱法检测藤黄酸对Hsp90 二级结构的影响。使用大肠杆菌异源表达Hsp90融合蛋白，蛋白于lOmol/L PBS (pH 7. 6)中透析除 去洗脱缓冲液(Elution Buffer)中的小分子，超滤浓缩至10 μ mol/L待用。实验前先用 PBS对仪器进行基线校正，取ImL浓度为0. 7 μ M的Hsp90至光路径为0. 5mm石英比色皿中 并置于圆二色谱仪中。藤黄酸溶于乙腈中，浓度为lOmol/L。实验采取逐滴加入的方式改变 体系中抑制剂的含量，每次加入后都要充分混勻，反应5min后再连续平行测定三次。藤黄 酸的浓度变化分别为0、0. 7,1. 4 μ mol/L,阴性对照及阳性对照分别为乙腈和GA。
仪器参数设置为灵敏度(sensitivity (IOOmdeg))；起始波长300nm，终止波长 190nm ；数据间隔(data pitch) :0· Inm ；扫描方式(scanning mode)连续扫描(continuous Scanning)；扫描速度(speed) :200nm/min ；频带宽度(band width) :lnm;温度(T) :298K。在浓度为1.4μπι01/1的藤黄酸作用下，Hsp90的α -螺旋结构由原来的21. 5%降 低至17. 5%。即藤黄酸的结合导致Hsp90构象的改变(图6)。实施例7、藤黄酸对Hsp90的非竞争性可逆抑制作用在该实施例中，通过酶动力学分析方法，分析藤黄酸对Hsp90的可逆抑制作用。使用大肠杆菌异源表达Hsp90融合蛋白，蛋白于lOmol/L PBS (pH 7. 6)中透析除 去洗脱缓冲液(Elution Buffer)中的小分子，超滤浓缩至ΙΟμπιοΙ/L待用。通过酶动力学 实验判断抑制剂类型。在蛋白浓度一定的条件下(Chsp9ci = 0. 18 μ mol/L)，同时检测ATP和 藤黄酸浓度的变化对Hsp90催化ATP水解速度的影响。阴性对照为2% DMS0，空白对照将 实验组中Hsp90替换为GST。反应于37°C下进行，时间为3h，每组数据3次平行。由ATP浓度与Hsp90催化ATP水解反应速度的双倒数图可以判断藤黄酸是Hsp90 的非竞争性可逆抑制剂(图7)。实施例8、体外抗肿瘤活性检测在该实施例中，采用MTT (Methyl Thiazolyltetrazolium)法检测藤黄酸在体外对 肿瘤细胞的抑制效果。收集对数生长期的HeLa细胞制成单细胞悬液，以6X IO4个/mL接种于96孔板 中，每孔80 μ L.另设3孔无细胞的空白对照孔(仅含DMEM完全培养基)。置37°C，5% CO2的培养箱中培养24h，然后加入20 μ L用DMEM完全培养基稀释好的样品，等量DMSO作 为阴性对照组，继续培养72h.每孔加10 μ L浓度为5mg/mL MTT溶液，37°C反应3h，每孔加 IOOyL终止液(10% SDS，0.01mol/L HCl)过夜，酶标仪比色测定(测定波长595nm，参考 波长655nm).对肿瘤细胞生长的抑制率按下式计算抑制率=(阴性对照组OD值-实验组 OD值)/ (阴性对照组OD值-空白组OD值)X 100%，实验重复3次，取平均值。半数抑制率(IC5tl)为肿瘤细胞生长抑制率为50%时的样品浓度。藤黄酸对宫颈癌细胞HeLa具有很强的抑制活性，IC50为0. 69 μ mol/L (图8)。实施例9、细胞凋亡分析在该实施例中，采用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色及流式细胞仪(Flow CytoMeter, FCM)测定法检测藤黄酸诱导肿瘤细胞凋亡的效果。细胞存活率测定取对数生长期的细胞，均以1. 5 2X IO5个/mL密度接种于6孔细胞培养板上或 者是以0. 5 1 X IO5个/mL密度接种于24孔细胞培养板上。培养过夜后，用藤黄酸处理 细胞，同时以未经处理细胞为阴性对照。 消化收集药物处理了 一定时间的细胞，包括培养液中悬浮的死细胞，SOOrpm离 心5min，去上清，加ImL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心去上清，最后重悬细胞于含5g/mL PI 的 PBS 缓冲液中(PI buffer :3· 4mmol/L 柠檬酸钠(Trisodium Citrate) ,9. 65mmol/L NaCl，PI 20mg/mL，0. 03% Nonidet P-40，配于H2O中)，避光冰上孵育lOmin，流式细胞仪测 定细胞存活率。
细胞周期测定
细胞的前期接种、药物处理与收集同上。收集的细胞经PBS缓冲液洗一次后，去上 清，将细胞逐滴加入70%预冷的乙醇中，-22°C固定6h以上。离心去上清，重悬细胞于PBS缓 冲液，再次离心，去上清，最后重悬细胞于含lOOimit/mL RNA酶的PBS缓冲液中，避光37°C 处理30min，加2mg/mL PI至终浓度50g/mL，避光孵育lOmin，过滤后流式细胞仪分析。对经藤黄酸作用后的HeLa细胞的形态进行显微观察。HeLa细胞经浓度为0. 2、
0.5,1. O和1. 5 μ mol/L的藤黄酸分别处理24h和48h。正常的HeLa细胞呈多角形，饱满， 细胞边缘较为圆滑，贴壁牢固；而1. 0 μ mol/L的藤黄酸处理24h的HeLa细胞开始皱缩，
1.5 μ mol/L的藤黄酸处理48h的HeLa细胞变圆，开始从壁上脱落，悬浮细胞增多(图9)。 从左至右分别为阴性对照；0.2、0.5、1.0、1.5ymol/L的藤黄酸以及阳性对照(GA)的作用 结果。可见藤黄酸在浓度较高时，其对HeLa细胞的形态影响较大，细胞出现收缩变圆的凋 亡形态。用浓度为0. 2、0. 5、1. 0和1. 5 μ mol/L的藤黄酸作用HeLa细胞24和48h，测定细 胞周期分布，从图中可以看出随时间的延长，浓度的升高，相应的凋亡峰逐渐增加(图10)。 用浓度为1. 5 μ mol/L的藤黄酸处理HeLa细胞48h，其凋亡细胞占到70%以上，即藤黄酸可 以引起HeLa细胞发生凋亡。用Western blot法检测凋亡相关蛋白质表达的影响，发现藤黄酸引起HeLa细胞 的凋亡与Hsp90客户蛋白的降解及Bax(—种促凋亡蛋白质)升高以及凋亡抑制蛋白质 XIAP的下调有关。但Bcl-2的下调不明显。(图11)。
权利要求
藤黄酸在制备热休克蛋白90抑制剂中的应用。
全文摘要
藤黄酸作为热休克蛋白90抑制剂的用途。涉及藤黄酸，提供藤黄酸在制备热休克蛋白90抑制剂中的应用。所述藤黄酸的名称为(z)-甲基-3-戊烯基)-；1，5-二亚甲基-1，3，11-三氢-呋喃并(3，4-g)吡喃并(3，2-b)蒽酮-1-巴豆酸，分子式为C38H44O8，旋光度为-685°，不易溶于水，在甲醇等有机溶剂中有较好的溶解性。所述藤黄酸能够抑制热休克蛋白90的ATP酶活性，降解热休克蛋白90的客户蛋白，在制备治疗各种因热休克蛋白90活性异常引起的疾病的药物上具有广泛的应用。
文档编号A61P35/00GK101890000SQ20101025644
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者孙艺飞, 宋思扬, 张连茹, 易玉婷, 沈月毛, 胡志钰, 郑忠辉, 郭秋菊, 陈俊杰 申请人:厦门大学