专利名称：多伞阿魏氯仿提取物的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多伞阿魏氯仿提取物的制备方法及其应用，属于医药技术、应用领域。
背景技术：
胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤。在我国，胃癌的发病率和病死率高居各种恶性肿瘤之首。据2000年资料统计，全球每年新发胃癌876000例，每年约有647000人因胃癌死亡。本病预后差，早期胃癌一般多无病状，一旦出现已为中晚期，其术后5年生存率仅为20-30%，进展期胃癌的自然病程一般不到I年。因此，胃癌正在严重威胁到世界人民和中国人民的健康。中医药治疗肿瘤，是中国在肿瘤治疗领域的一大特色，研发中医药治疗胃癌的药物应该引起足够重视，中医药在治疗胃癌方面的巨大潜力有待挖掘。多伞阿魏(Ferula ferulaeoides (Steud.) Korov.)是新疆维吾尔族人民常用的重要药材，为伞形科阿魏属植物，仅分布于新疆古尔班通古特沙漠南缘地区的沙丘、沙地和砾石质的蒿属荒漠中，资源丰富，药用部位为根和油胶树脂。在新疆民间广泛用作中药阿魏的代用品，其挥发性成分是其主要活性成分，在治疗虫积、肉积、痞块、心腹冷痛、疟疾、痢疾等方面具有显著的药理活性，在临床上用于治疗心腹冷痛、慢性肠胃炎、胃溃疡、风湿性关节炎等疾病。目前对多伞阿魏挥发性成分的研究报道主要涉及挥发油提取、化学成分分析、药理作用(具体可参见文献1:能元君，刘发，叶尔波等著《新疆三种阿魏对胃肠道作用的比较》，见新疆医学院学报，1993年第16(4)期；及文献2:叶尔波，刘发，能元君等著《新疆三种阿魏的抗炎与免疫抑制作用》 ，见西北药学杂志，1993年第8(2)期，第72-76页)及生药方面研究。迄今未见多伞阿魏氯仿提取物的制备方法及多伞阿魏氯仿提取物在抗胃癌活性方面的研究报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题就在于克服现有技术的缺陷，提供一种多伞阿魏氯仿提取物的制备方法及其应用，本发明提供的多伞阿魏氯仿提取物质量可控、稳定，制备方法简单，便于大生产和临床使用。多伞阿魏氯仿提取物的应用，为临床治疗肿瘤提供了一种新的选择，为今后继续深入开展这一传统维吾尔药材多伞阿魏的研究和开发利用提供了科学依据。为解决上述问题，本发明采用如下技术方案:本发明提供了一种多伞阿魏氯仿提取物的制备方法，包括下列步骤:取多伞阿魏药材粉末过60目筛，加入4 8倍体积分数的氯仿，水浴锅中回流提取3-4次，提取温度为45 60°C,每次提取时间为30 45min,过滤,合并氯仿提取液,旋转回收至少量，转溶至蒸发皿中，水浴蒸干，置于真空干燥箱内以45°C干燥72h，得多伞阿魏氯仿提取物。本发明同时提供了一种多伞阿魏氯仿提取物的应用，将多伞阿魏氯仿提取物用于抗胃癌。本发明提供的多伞阿魏氯仿提取物质量可控、稳定，制备方法简单，便于大生产和临床使用。为临床治疗肿瘤提供了一种新的选择，为今后继续深入开展这一传统维吾尔药材多伞阿魏的研究和开发利用提供了科学依据。
具体实施例方式实施例1 多伞阿魏氯仿提取的制备以多伞阿魏 氯仿提取率和体外抑制胃癌细胞SGC-7901的抑制率为考察指标，对影响多伞阿魏氯仿提取效率的提取次数、提取时间、提取温度、氯仿体积分数等四因素三水平1^9 (34)进行正交试验，筛选多伞阿魏氯仿提取物的最佳提取工艺条件为:取多伞阿魏药材 粉末过60目筛，加入4 8倍体积分数的氯仿，水浴锅中回流提取3-4次，提取温度为45 60°C，每次提取时间为30 45min，过滤，合并氯仿提取液，旋转回收至少量，转溶至蒸发皿中，水浴蒸干，置于真空干燥箱内以45°C干燥72h，得多伞阿魏氯仿提取物。本发明制备的多伞阿魏氯仿提取物质量可控、稳定，制备方法简单，便于大生产和临床使用。实施例2 MTT法检测多伞阿魏提取物对SGC-7901细胞增殖的抑制作用用0.25%胰蛋白酶消化SGC-7901细胞，用完全培养基配单细胞悬液，以每孔
0.4X104个接种于96孔板中，每孔100 μ L。培养24h，待细胞贴壁并进入对数生长期后饥饿细胞4h，并进行实验干预。实验分3组:阴性对照组(100 μ L RPMI1640+0.1%DMS0);阳性对照组；供试样品处理组。其中，每组设5个复孔，于37°C、5%C02的饱和湿度培养箱中继续培养12h后中止实验，取出96孔板，每孔加入IOyL MTT染色液，继续培养4h。吸弃上清，每孔加入IOOyL Formanzan,置摇床上低速振荡10_30min,使结晶充分溶解。以上实验重复3次。在酶联免疫检测仪570nm处测定吸光度(A)值，按下式求出生长抑制率(IR)，并求出半数抑制浓度(IC5tl)15细胞生长抑制率％ (IR) =(1-用药组平均A值/阴性对照组平均A值)X 100%。MTT数据均采用x±s表示，采用SPSS10.0软件包进行方差分析，以P彡0.05为有统计学差异。结果:多伞阿魏氯仿提取物在一定的的浓度范围内，对胃癌细胞SGC-7901细胞的生长具有明显的抑制作用，与对照组比较差异显著，且随着药物质量浓度增加，细胞抑制率越高，呈现显著的浓度依赖性。多伞阿魏氯仿提取物作用24h的IC5tl是12.16 μ g/mL。实施例3 倒置显微镜观察给药后细胞形态变化选用对数生长期的胃癌细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化数分钟后，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，离心去除培养基，每种细胞株加入对应的培养基配制成IX IO5个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100μ 1，96孔培养板四周的孔加PBS，不接细胞，置于37°C、5%C02、饱和湿度的培养箱培养24h，使其贴壁。24小时后分别对每个细胞加入不同浓度多伞阿魏氯仿提取物，使终浓度为IC5tl，分别于24h，48h，72h，使用倒置显微镜观察细胞形态变化并拍照片。结果:胃癌细胞株阴性对照组细胞生长状况良好，在镜下观察可见，透明度大、折光性强、细胞轮廓不清、形态较规则、贴壁性好。相反，给药组胃癌细胞生长状态不良，细胞折光性变弱、轮廓增强、胞质中常出现空泡、脂质和颗粒样物、细胞之间空隙加大、细胞变得不规则、贴壁性不好，部分细胞成凋亡状态，细胞变圆，细胞贴壁性变差，细胞膜发生皱缩、凹陷，并可见细胞凋亡小体。实施例4 流式细胞仪(FCM)分析癌细胞周期和凋亡分别接种胃癌细胞于6孔板和给药于6孔板，收集上述处理后的包括贴壁和悬浮的细胞，用4°C预冷PBS洗涤细胞一次，用低温离心机于4°C以转速IOOOrPm离心IOminj^慢加入I ml-20°C预冷70%乙醇于4°C固定过夜，再用4°C预冷的PBS漂洗细胞两次，用上述离心条件离心，加100 μ g/ml的PI染色剂150 μ I 0.4%tritonl50 μ 1，4°C避光染色30min,于30min内用FCM进行细胞周期DNA含量分析，确定细胞周期分布。细胞周期和凋亡采用CellQuest及Motifit分析软件分析。结果:多伞阿魏氯仿提取物样品可显著使胃癌细胞SGC-7901凋亡。流式细胞仪分析可知，多伞阿魏氯仿提取物作用后，GcZG1细胞数增加，S和G2/M期细胞数减少，细胞增殖指数降低，显示多伞阿魏氯仿提取物作用后细胞分裂增殖被抑制在GcZG1-S期。通过流式细胞仪(FCM)分析胃癌细胞周期和凋亡，初步探索了此类化合物抑制胃肿瘤细胞增殖的初步机制。最后应说明的是:显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
权利要求
1.一种多伞阿魏氯仿提取物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤:取多伞阿魏药材粉末过60目筛，加入4 8倍体积分数的氯仿，水浴锅中回流提取3-4次，提取温度为45 60°C,每次提取时间为30 45min,过滤,合并氯仿提取液,旋转回收至少量，转溶至蒸发皿中，水浴蒸干，置于真空干燥箱内以45°C干燥72h，得多伞阿魏氯仿提取物。
2.—种多 伞阿魏氯仿提取物的应用，其特征在于:将多伞阿魏氯仿提取物用于抗胃癌。
全文摘要
本发明公开了一种多伞阿魏氯仿提取物的制备方法及其应用，包括下列步骤取多伞阿魏药材粉末过60目筛，加入4～8倍体积分数的氯仿，水浴锅中回流提取3-4次，提取温度为45～60℃，每次提取时间为30～45min，过滤，合并氯仿提取液，旋转回收至少量，转溶至蒸发皿中，水浴蒸干，置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得多伞阿魏氯仿提取物。其应用为将多伞阿魏氯仿提取物用于抗胃癌。本发明提供的多伞阿魏氯仿提取物质量可控、稳定，制备方法简单，便于大生产和临床使用。多伞阿魏氯仿提取物的应用，为临床治疗肿瘤提供了一种新的选择，为今后继续深入开展这一传统维吾尔药材多伞阿魏的研究和开发利用提供了科学依据。
文档编号A61K36/23GK103230424SQ20131017913
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月15日 优先权日2013年5月15日
发明者盛萍, 姚蓝, 王飒, 詹羽姣 申请人:新疆医科大学