专利名称：一种具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及一种从药用植物中获得的具有抗肿瘤作用的提取物和 提取方法。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，药物治疗在恶性肿瘤疗法中占 有重要的地位，其中从中草药中发现新的具有抗肿瘤活性的物质是一个重要的研究方向。胃 it # € M (Macrothelypteris torresiana(Gaud.) Ching) ^J ik M M (Thelypteridaceae)针毛蕨属(Macrothelypteris)植物，又名华南金星蕨。植株高60 150cm，根状茎与叶柄基部均密被鳞片，叶簇生或近生，基部暗棕色，向上为深禾秆色，有光 泽，无毛。叶片三角状长卵形，三回深羽裂，羽片15 20对，下部近对生，向上互生，下部羽 片较大，有短柄，长三角披针形；小羽片无柄，线形，基部一对缩短，下部长往上缩短，深羽裂 几达小羽轴；裂片边缘有钝锯齿，叶脉不明显，叶草质，下面及小羽轴两面疏被灰白色长针 状毛，叶轴及羽轴上面密被刚毛，下面无毛；孢子囊群圆形，细小，每裂片有4 6对，生于小 脉近顶处；囊群盖极小或无。广泛分布于长江以南各省，西至四川，南至云南东北部。
发明内容
本发明的任务是提供一种具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物，同时，本发明还 提供了这种具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物的制备方法。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物，是以普通针毛蕨为原 料，按以下步骤制备的提取物a.以当年生普通针毛蕨根茎为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉；b.将普通针毛蕨原料粗粉用乙醇或甲醇为提取溶剂，加热提取，所用溶剂量与普 通针毛蕨原料粗粉重量比为6 15 1，优选10 1，重复提取1 3次，除去药渣，滤液 在减压条件下浓缩干燥得普通针毛蕨浸膏。c.将所得普通针毛蕨浸膏超声溶解于蒸馏水中，以碱溶液调PH值至5 7，优选 PH值为6，沉淀滤除，得普通针毛蕨滤液；d.将所得普通针毛蕨滤液用大孔树脂的交换柱吸附，以蒸馏水洗脱水溶性物质， 再以50 70%的含水乙醇进行洗脱，洗脱液在减压条件下回收溶剂，浓缩干燥，即得本发 明提供的具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物。上述步骤b中所述的乙醇可以是60 90%含水乙醇，所述的甲醇可以是60 90%含水甲醇。上述步骤c中所述的碱溶液是氢氧化钠或氨水。以本发明提供的具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物为有效成分，加上药学上可 接受的添加剂按常规方法可以制成抗肿瘤药物，如可以制成片剂或颗粒剂。
本发明提供的具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物的制备方法，包括以下步骤(1)以当年生普通针毛蕨根茎为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉；(2)将普通针毛蕨原料粗粉用乙醇或甲醇为提取溶剂，加热提取，所用溶剂量与普 通针毛蕨原料粗粉重量比为6 15 1，优选10 1，重复提取1 3次，除去药渣，滤液 在减压条件下浓缩干燥得普通针毛蕨浸膏。(3)将所得普通针毛蕨浸膏超声溶解于蒸馏水中，以碱溶液调PH值至5 7，优选 PH值为6，沉淀滤除，得普通针毛蕨滤液；(4)将所得普通针毛蕨滤液用大孔树脂的交换柱吸附，以蒸馏水洗脱水溶性物质， 再以50 70%的含水乙醇进行洗脱，洗脱液在减压条件下回收溶剂，浓缩干燥，即得本发 明具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物。上述步骤⑵中所述的乙醇可以是60 90%的含水乙醇，所述的甲醇可以是 60 90%的含水甲醇。上述步骤(3)中所述的碱溶液可以是如氢氧化钠或氨水。本发明提供的普通针毛蕨提取物是从金星蕨科针毛蕨属植物普通针毛蕨 (Macrothelypteris torresiana(Gaud.) Ching)的干燥根茎中提取纯化得到的抗肿瘤有效 部位，试验证明该有效部位对各种肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，对小鼠肿瘤有显著的抑 制作用，体现了很强的体内外抗肿瘤作用，可以作为抗肿瘤药物用于治疗肿瘤疾病。本发明具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物的药效如下(1)体外抗肿瘤活性将本发明提取纯化所得普通针毛蕨提取物配制成四个浓度 梯度的含药培养基，以相同的方法配制阳性对照药五氟尿嘧啶，选用传代后处于对数生长 期的H印G2、Tca-8113、MCF-7、M5、K562肿瘤细胞株，采用MTT法对普通针毛蕨提取物进 行体外抗肿瘤活性研究，结果显示普通针毛蕨提取物对各种肿瘤细胞均显示较强的细胞毒 性，且毒性与剂量成正比，IC50值均与五氟尿嘧啶相当。(2)体内抗肿瘤活性采用移植肿瘤S18tl荷瘤小鼠，以本发明提取纯化所得普通针 毛蕨提取物按一定剂量灌胃给药，阳性对照组为五氟尿嘧啶，阴性对照组为生理盐水等容 量给药，每日2次，连用10天，结果显示普通针毛蕨提取物具有明显的抑制肿瘤作用，且抑 瘤率与给药剂量成正比。实验资料1、本发明普通针毛蕨提取物对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用传代后处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7吹打分散于含10%灭活小牛血清 的培养基中，倒置显微镜下用细胞计数板测定浓度并调整到2X105cellS/mL。在96孔板 中每孔加入该细胞悬液10(^1^，于371 5% CO2的培养箱中培养24h。加入含有普通针毛 蕨提取物的培养液100 μ L，普通针毛蕨提取物浓度为0. 1，1. 0，10. 0，100. 0 μ g/mL。继续于 37°C 5% CO2的培养箱中培养48h，之后每孔加入20 μ L 5mg/mL的MTT溶液继续培养4h，小 心吸除细胞液，每孔加入DMSO 200 μ L以溶解生成的甲臢，并在细胞板振荡仪上振荡IOmin 后用酶标仪在570nm处测定OD值，计算IC5tl值。结果显示，抑制率与药物浓度呈正比，普通 针毛蕨提取物的IC50值(4. 85士0. 11 μ g/mL)低于五氟尿嘧啶(7. 05士0. 37 μ g/mL)，表明 普通针毛蕨提取物对人乳腺癌细胞MCF-7有明显的抑制作用。2、本发明普通针毛蕨提取物对人肝癌细胞H印G2的抑制作用
采用同实验1类似的方法，进行普通针毛蕨提取物对人肝癌细胞H印G2的抑制作 用研究，结果显示，提取物IC5tl值(3.65士0. 19 μ g/mL)低于五氟尿嘧啶(6. 10士0.42 μ g/ mL)，表明普通针毛蕨提取物对人肝癌细胞!fep G2同样具有很强的抑制作用。3、本发明普通针毛蕨提取物0. 5% CMC-Na混悬剂对小鼠实体瘤的抑制作用在无菌条件下，将传代7天的供体动物的腹部用碘酒和酒精消毒后，用无菌注射 器抽取S18tl腹水瘤，用生理盐水稀释成细胞悬液后并计数调整细胞数为IO7个/mL。取雄性 小鼠，体重18. 0-20. 0g，将已调好的细胞悬液接种于小鼠右腋皮下，0. 2mL/只，每只老鼠的 接种瘤细胞数为2X IO6个，24h后随机分为对照组(0. 5% CMC-Na)，五氟尿嘧啶组和普通针 毛蕨提取物0. 5% CMC-Na混悬剂小剂量(15mg/kg)组、中剂量(30mg/kg)组、大剂量(60mg/ kg)组。灌胃给药，每天2次，共10天。末次给药后1天，脱颈处死小鼠，剖瘤称重，计算抑 瘤率。结果显示普通针毛蕨提取物0. 5% CMC-Na混悬剂对S18tl实体瘤的抑制率为56. 35%, 51. 26%和 35. 23%。4、本发明普通针毛蕨提取物羟丙基β -环糊精包合剂对小鼠实体瘤的抑制作用按照实验3类似的方法，采用小鼠右腋皮下接种S18tl实体瘤细胞悬液，随机分为对 照组(羟丙基环糊精)，五氟尿嘧啶组和普通针毛蕨提取物羟丙基环糊精包合剂 小剂量(10mg/kg)组、中剂量(20mg/kg)组、大剂量(40mg/kg)组。灌胃给药，每天2次， 共10天。结果显示普通针毛蕨提取物羟丙基β -环糊精包合剂对S18tl实体瘤的抑制率为 54. 57%,52. 31%和 25. 45%。本发明普通针毛蕨提取物0. 5% CMC-Na混悬剂的制备称取羧甲基纤维素钠于蒸 馏水中，60-65 °C磁力搅拌溶解，配制成0. 5 % CMC-Na溶剂，称取粉碎、过筛的普通针毛蕨提 取物2g加入适量0. 5% CMC-Na溶剂，碾磨均勻，即配制成普通针毛蕨提取物混悬剂。本发明普通针毛蕨提取物羟丙基β -环糊精包合剂的制备称取普通针毛蕨提取 物2g，加入一定体积的无水乙醇中溶解，将溶解后的溶液逐滴滴加到10倍量羟丙基β -环 糊精的水溶液中，55°C恒温搅拌2小时后，冻干即得包合物。20g包合物含普通针毛蕨提取 物2g。
具体实施例方式实施例1本发明普通针毛蕨提取物的制备(1)制备原料粗粉以当年生普通针毛蕨(2009年9月采自江西九江，经九江 森林植物标本馆谭策铭研究员鉴定为蕨类植物门金星蕨科针毛蕨属植物普通针毛蕨 (Macrothelypteris torresiana (Gaud.) Ching))的干燥根茎为原料，洗净，晾干，粉碎，过 40目筛，得原料粗粉待用；(2)溶剂提取将普通针毛蕨原料粗粉用乙醇、甲醇或含水乙、甲醇(60 90% ) 为提取溶剂，加热提取(包括回流)，所用溶剂量与原料重量比为6 15 1，以10倍溶剂 量最佳，可重复提取1 3次，除去药渣，滤液在减压条件下浓缩干燥得普通针毛蕨浸膏，得 率不低于15% (以生药材计算)；(3)将上述所得普通针毛蕨浸膏，超声溶解于水中，以碱溶液(如氢氧化钠，氨水) 调PH值至5 7，以6最佳，沉淀滤除，得普通针毛蕨滤液；(4)树脂分离将上述的普通针毛蕨滤液用大孔树脂的交换柱吸附，以蒸馏水洗脱水溶性物质，再以50 70%的含水乙醇进行洗脱，洗脱液在减压条件下回收溶剂，浓缩 干燥，即得普通针毛蕨提取物，得率不低于2. 5% (以生药材计算)。本发明制备普通针毛 蕨提取物的方法简便，且重现性好。实施例2制备本发明普通针毛蕨提取物普通针毛蕨干燥根茎，粉碎，过筛，加入10倍体积的70%乙醇，90°C回流提取lh， 共提取两次，合并提取液，减压浓缩回收溶剂，真空干燥成普通针毛蕨浸膏。普通针毛蕨浸 膏加蒸馏水超声溶解，溶液用15%氢氧化钠调PH至6，过滤，上清提取液过HPD500大孔树 脂，按照饱和吸附量150mg/g干树脂，以上样液浓度为2. 48mg/ml，吸附流速为lml/min，水 洗体积为5倍柱体积，洗脱剂乙醇浓度为50%，洗脱剂体积为7倍柱体积，洗脱流速为2ml/ min进行普通针毛蕨提取物的纯化，合并洗脱液，减压浓缩，真空干燥即得普通针毛蕨提取 物，得率为2.7%。实施例3片剂制备按照处方，将普通针毛蕨提取物粉碎，过筛，称取20g，加入淀粉、乳糖混合均勻，加 入60%酒精制软材，制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，混勻，压制成1000片，包糖衣，干燥即 得。每片含普通针毛蕨提取物20mg。实施例4颗粒剂制备称取粉碎，过筛处理的普通针毛蕨提取物20g、蔗糖粉、糊精及适量乙醇，搅拌均 勻，制粒，干燥，整粒，分装，成品。每包重5g，含普通针毛蕨提取物20mg。
权利要求
一种具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物的制备方法，包括如下步骤(1)以当年生普通针毛蕨根茎为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉；(2)将普通针毛蕨原料粗粉用乙醇或甲醇为提取溶剂，加热提取，所用溶剂量与普通针毛蕨原料粗粉重量比为6～15∶1，优选10∶1，重复提取1～3次，除去药渣，滤液在减压条件下浓缩干燥得普通针毛蕨浸膏。(3)将所得普通针毛蕨浸膏超声溶解于蒸馏水中，以碱溶液调PH值至5～7，优选PH值为6，沉淀滤除，得普通针毛蕨滤液；(4)将所得普通针毛蕨滤液用大孔树脂的交换柱吸附，以蒸馏水洗脱水溶性物质，再以50～70％的含水乙醇进行洗脱，洗脱液在减压条件下回收溶剂，浓缩干燥，即得具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的乙醇是60 90% 的含水乙醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的甲醇是60 90% 的含水甲醇。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的碱溶液是氢氧化钠 或氨水。
5.一种抗肿瘤药物，其特征在于，它是以普通针毛蕨为原料，按以下步骤制备的提取物a.以当年生普通针毛蕨根茎为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉；b.将普通针毛蕨原料粗粉用乙醇或甲醇为提取溶剂，加热提取，所用溶剂量与普通针 毛蕨原料粗粉重量比为6 15 1，优选10 1，重复提取1 3次，除去药渣，滤液在减 压条件下浓缩干燥得普通针毛蕨浸膏。c.将所得普通针毛蕨浸膏超声溶解于蒸馏水中，以碱溶液调PH值至5 7，优选PH值 为6，沉淀滤除，得普通针毛蕨滤液；d.将所得普通针毛蕨滤液用大孔树脂的交换柱吸附，以蒸馏水洗脱水溶性物质，再以 50 70 %的含水乙醇进行洗脱，洗脱液在减压条件下回收溶剂，浓缩干燥，即得具有抗肿 瘤作用的普通针毛蕨提取物。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于，步骤b中所述的乙醇是60 90% 含水乙醇。
7.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于，步骤b中所述的甲醇是60 90% 含水甲醇。
8.根据权利要求6所述的抗肿瘤药物，其特征在于，步骤c中所述的碱溶液是氢氧化钠 或氨水。
9.一种抗肿瘤药物制剂，其特征在于，它含有权利要求5所述的抗肿瘤药物和药学上 可接受的添加剂。
10.根据权利要求9所述的抗肿瘤药物制剂，其特征在于它是片剂或颗粒剂。
全文摘要
本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的普通针毛蕨提取物，它是以植物普通针毛蕨干燥根茎为原料，经溶剂提取和大孔树脂纯化等提取工艺得到的提取物，本发明优化了提取纯化工艺，最终得到的普通针毛蕨提取物具有明显的体内外抗肿瘤作用。
文档编号A61K36/11GK101933956SQ201010282430
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者吴光华, 熊朝梅, 阮金兰, 魏安华 申请人:华中科技大学