具有HBeAg降解酶活性的蚯蚓蛋白及其应用的制作方法

专利名称：具有HBeAg降解酶活性的蚯蚓蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种具有HBeAg降解酶活性的蚯蚓蛋白，以及含有其的药物组合物。本发明还提供了所 述蚯蚓蛋白在制备治疗HBeAg相关性疾病的药物中的应用，所述HBeAg相关性疾病包括乙型肝炎，乙型肝炎引起的肝硬化，以及e抗原阳性和表面抗原阳性的乙型肝炎病毒携带者等。另外，本发明还提供一种分离含有所述蚯蚓蛋白的粗酶提取物的方法及由所述方法制备的蚯蚓蛋白粗酶提取物及其在制备治疗HBeAg相关性疾病的药物中的应用。
背景技术：
乙型肝炎，简称乙肝，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。通过血液与体液传播，具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到I. 89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿。是当前危害人民健康最严重的传染病。多见于儿童及青壮年。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病人可转变为原发性肝癌，这些疾病对病人以及社会的危害更加严重。发病过程一般来说，肝细胞受乙肝病毒入侵后，乙肝病毒本身并不直接引起肝细胞的病变。乙肝病毒只是利用肝细胞摄取的养料赖以生存并在肝细胞内进行复制。病毒复制的表面抗原、e抗原和核心抗原都释放在肝细胞膜上，激发人体的免疫系统来辨认，并发生反应。这种在肝细胞膜上发生的抗原抗体反应可造成肝细胞的损伤和破坏，从而产生一系列临床症状。治疗手段我国多数患者是在围生期或年幼时感染HBV造成免疫耐受,往往形成慢性感染，这些患者需要积极而有效的治疗，否则可能发展为肝硬化甚至肝癌，导致死亡。然而迄今尚无一种可靠的治疗方法能清除或永久抑制HBV的复制，从而终止肝脏的炎症和坏死。慢性乙型肝炎目前的治疗目标是①抑制HBV复制(HBsAg、HBeAg消失)非扩增法检测不出HBV DNA水平；③病情改善，ALT复常肝组织学改善；⑤减少肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞肝癌的发生率。目前用于治疗乙肝的药物主要包括干扰素、核苷酸类似物等抗病毒药物和胸腺肽等免疫调节药物。I.传统干扰素与聚乙二醇干扰素干扰素目前仍是治疗乙型肝炎的一线药物，它具有明确的疗程，疗效好，可使HBsAg消失和抗HBs产生，无耐药性等优点，但是由于同时存在副作用较多、不能使用于失代偿性肝硬化患者、注射治疗麻烦及代价昂贵等缺点而限制了其使用。在美国，很多的医生倾向于选择核苷(酸)类似物治疗慢性乙肝。2.拉米夫定短期用拉米夫定对HBV DNA的抑制作用、HBeAg转阴率、HBeAg血清转换率及血清ALT复常率均优于干扰素，而且服用方便，可以用于失代偿性肝硬化及肝移植前后患者，但是其持续应答率不及干扰素，而且存在一个较突出的耐药性问题，且随着服用时间的延长，耐药性也会逐渐增加。3.阿德福韦酯是一新型核昔(酸)类似物，口服阿德福韦酯是阿德福韦的前体，能有效抑制乙肝病毒复制、改善组织学、延缓疾病进展成肝硬化、肝功能失代偿及肝癌，它的耐药性发生低于拉米夫定，且对拉米夫定耐药者有很好的治疗效果，但是长期服用有一定肾毒性，需定期监测血清肌酐和血磷。4.恩替卡韦是环戊酰鸟苷类似物，我国SFDA去年年底刚批准用于慢性乙型肝炎的治疗。5.其他其他还在进行II、III期临床试验的药物有恩曲他滨、特必夫定、克拉夫定。6.免疫调节治疗免疫调节治疗是治疗慢性乙型肝炎的重要手段之一，目前用于治疗乙型肝炎的免疫调节药物主要是胸腺肽。胸腺肽刺激T细胞，增强非特异性免疫功能，其不良反应小，耐受性好，使用安全，对于有抗病毒治疗指针，但不能耐受或不愿接受干扰 素和核苷酸类似物治疗的患者可选用胸腺肽。乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg) :HBeAg是一种非颗粒分泌型核壳蛋白，是preC蛋白翻译后加工的产物，作为HBV感染的血清标志发现于1973年。随后的研究发现，该抗原并非病毒复制所必须的蛋白，由HBV DNA C区编码，随HBV复制而增加，临床上将其作为判断HBV活动性复制的指标之一。美国健康研究中心2007年发现，慢性乙肝e抗原持续阳性会极大地增加肝硬化和肝癌的危险。他们研究分析了乙肝基因型对HBeAg清除的影响。被调查的阿拉斯加州1158名本地患者，平均年龄在20. 5岁，乙肝基因型为A、B、C、D、F。研究发现，基因型为C的患者HBeAg转阴的可能性比其它基因型更难，且e抗原清除时间更长。其中50%的A、B、D型患者不到20年有e抗原转阴，而C型需要47. 8年。但是，这些HBeAg转阴后，C、F型的HBeAg很快就会回复。因此，乙肝标志物中HBeAg转阴，并产生HBeAb是判断病情趋向和药物疗效的一个重要指标。HBeAg有两个已确认的抗原决定簇第一个位于其N端第84 99位氨基酸残基，为线性表位，第二个表位位于136 145氨基酸残基，为非线性表位，它需要与前C区部分氨基酸残基相互作用才能表现出抗原性。位于前C区-7位的半胱氨酸与C区中61位的半胱氨酸形成二硫键，构成HBeAg区别于HBcAg的独特的二级结构，同时该二硫键还抑制HBeAg形成蛋白质颗粒。虽然HBeAg在HBV生命周期中的生物学功能还存在争议，病毒复制并不需要它，但是HBeAg在肝炎及肝癌患者中还有重要的免疫调节作用。在乙肝病毒标志物(HBV-M)检测中，在DNA检测开始前，HBeAg是活动性HBV复制和感染的标准标记物。e系统的检测尤为重要，它对HBV复制与否的判定、是否具有传染性、以及临床抗病毒治疗效果如何等方面均具有重要价值。蚯蚓俗称地龙，其种类繁多，资源丰富。蚯蚓作为药物使用，在我国已有1200多年的历史。最原始的方法是利用整个鲜蚯蚓或干蚯蚓；随着发展，后来发现蚯蚓的药用价值与其中含有的多种化学成分有关。目前已经分离到多种不同纯度的蚯蚓成分，其中包括纤溶酶、纤溶酶原激活剂、钙调素和钙调素结合蛋白、胆碱酯酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶S0D、促髓系细胞增殖组分、抗微生物蛋白、收缩血管蛋白、溶血蛋白、免疫球蛋白样粘连物和抗肿瘤蛋白、抗菌肽等，取得了较大的进展。近年来在蚯蚓体内发现有一组蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO. I, SEQ IDNO. 2，SEQ ID NO. 3，SEQ ID NO. 4，SEQ ID NO. 5，SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7，SEQ ID NO. 8，SEQ ID NO. 9，SEQ ID NO. 10，SEQ ID NO. 11，SEQ ID NO. 12，SEQ ID NO. 13，SEQ ID NO. 14，SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16。目前的实验证明这组蛋白都是糖基化的丝氨酸蛋白酶，但该组蛋白的其他功能尚不清楚。

发明内容
为此，本发明人进行了大量的试验，并且意外地首次发现，SEQ ID NO. 1-16的蛋白在与HBeAg孵育过程中可迅速将其降解，并通过细胞试验、动物试验也证明它们在体内和体外均具有HBeAg降解酶(下面实施例和附图中还称为“HBeAgase”)活性。因此，在第一个方面，本发明的目的是提供一种蚯蚓蛋白，其具有选自下列 (a)-(b)中的一种序列(a) SEQ ID NO. 1_16任一项所不的氨基酸序列；(b)与(a)中所述的任一种氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列，其中上述氨基酸序列均具有由H43，D91, S188组成的催化三联体，以及所述蚯蚓蛋白具有HBeAg降解酶活性。在第二个方面，本发明提供了一种药物组合物，包括本发明的蚯蚓蛋白作为活性成分，以及一种或多种药用的载体、赋形剂、稀释剂或辅料。在第三个方面，本发明涉及本发明的蚯蚓蛋白或药物组合物在制备治疗或预防HBeAg相关疾病的药物中的应用。在一个优选的实施方案中，所述HBeAg相关疾病选自乙型肝炎、e抗原和/或表面抗原阳性的乙型肝炎病毒携带者、由乙型肝炎引起的肝硬化或肿瘤。在第四个方面，本发明提供了一种蚯蚓蛋白粗酶提取物的制备方法，其包括以下步骤I)将蚯蚓用蒸馏水洗涤、浸泡并在室温下静置10 48小时，以排除体内的泥沙；2)将蚯蚓匀浆、离心，将上清液透析；3)将经透析的上清液经大豆胰蛋白酶抑制剂-亲和层析柱吸附，除去未吸附杂蛋白后，用平衡液从所述层析柱上洗脱所述蚯蚓蛋白粗酶提取物。在第五个方面，本发明提供了一种上述方法制备的蚯蚓蛋白粗酶提取物。在一个优选的实施方案中，本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物包括至少一种具有下列氨基酸序列的蚯蚓蛋白(a)SEQ ID NO. 1_16任一项所示的氨基酸序列；(b)与(a)中所述的任一种氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列，其中上述氨基酸序列均具有由H43，D91, S188组成的催化三联体，以及所述蚯蚓蛋白具有HBeAg降解酶活性。在另一个优选的实施方案中，本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物包括具有以下氨基酸序列的蛋白SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 11，SEQ ID NO. 12，SEQ ID NO. 14，SEQ ID NO. 15。在一个优选的实施方案中，SEQ ID NO. I的丰度为9. 65%, SEQ ID NO. 2为3. 65%, SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12 的丰度为 5. 1%，SEQ ID NO. 14 的丰度为 2. 6%，SEQ ID NO. 15 的丰度为 4. 3%。在第六个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物作为活性成分，以及一种或多种药用的载体、赋形剂、稀释剂或辅料。在第七个方面，本发明涉及本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物或含有该蚯蚓蛋白粗酶提取物的药物组合物在制备治疗或预防HBeAg相关疾病的药物中的应用。在一个优选的实施方案中，所述HBeAg相关疾病选自乙型肝炎、e抗原和/或表面抗原阳性的乙型肝炎病毒携带者、由乙型肝炎引起的肝硬化或肿瘤。
本发明具有以下的有益效果I.本发明的蚯蚓蛋白具有降解HBsAg的酶活性，并且此活性基于氨基酸序列中由H43，D91，S188组成的催化三联体。2.本发明的蚯蚓蛋白的HBsAg降解酶活性对HBeAg的作用位点在141位精氨酸和142位谷氨酸两个氨基酸附近。3.本发明还提供了一种蚯蚓蛋白粗酶提取物的制备方法，基于上面I)和2)的技术启示，本领域技术人员可以根据需要经过有限次的试验就可以制备出含有不同种类、不同组合的本发明的蚯蚓蛋白的蚯蚓蛋白粗酶提取物。4.本发明的蚯蚓蛋白、粗酶组合物以及分别含有它们的药物组合物在对HBsAg相关疾病，诸如乙型肝炎的治疗中，尤其是对慢性乙型肝炎的治疗具有明显的优势，因为其特异性地降解HBsAg，而非针对HBV DNA,并且没有目前临床使用的其他药物的非特异性靶向 作用所引起的副作用。


图I是蚯蚓蛋白SEQ ID NO. I与HBeAg蛋白共同孵育后SDS-PAGE图，其中图IA是HBeAg与不同浓度SEQ ID NO. I在37°C孵育Ih的SDS-PAGE图(M :标准分子量；1 :对照(未加 SEQ ID NO. I 的 HBeAg) ;2_5 :HBeAg 与 SEQ ID NO. I 共同孵育；6 :仅 6 μ M SEQ IDNO. I);图IB是HBeAg蛋白与SEQ ID NO. I在37°C孵育不同的SDS-PAGE图(M :标准分子量；1 :对照(未加 SEQ ID NO. I 的 HBeAg 蛋白)；2 15min ；3 30min ；4 60min ；5 90min ；6 120min ；7 :仅 SEQ ID NO. I)。图2是虫丘蝴蛋白SEQ ID NO. I与HBeAg蛋白共同孵育后的western blotting图，其中I :对照(未加SEQ ID NO. I的HBeAg蛋白);2_5 =HBeAg与SEQ ID NO. I共同孵育；6 仅 6 μ M SEQ ID NO. I。图3是SEQ ID NO. I与HBeAg蛋白共同孵育后的ELISA图，其中I :对照(未加SEQID NO. I 的 HBeAg 蛋白)；2_5 =HBeAg 与 SEQ ID NO. I 共同孵育。图4是图示采用大豆胰蛋白酶抑制剂-亲和层析法串联对氨基苯甲醚亲和层析法分离纯化蚯蚓蛋白粗酶提取物的方法流程的示意图。图5是本发明的分离纯化的蚯蚓蛋白粗酶提取物的8种同工酶native-PAGE图和SDS-PAGE图。其中图5A 8种蚯蚓HBeAg降解酶同工酶的native-PAGE图(I =EfP-O-I ；2 EfP-0-2 ；3 =EfP-I-I ；4 EfP-I-2 ；5=EfP-II-I ；6 EfP-II-2 ；7 =EfP-III-I ；8 EfP-III-2 ；9 :蚯蚓HBeAg降解酶混合组分)；图5B :8种蚯蚓HBeAg降解酶同工酶的SDS-PAGE图(I EfP-O-I ；2 EfP-0-2 ；3 =EfP-I-I ；4 EfP-I-2 ；5 :标准分子量；6 =EfP-II-I ；7 =EfP-11-2 ；8 =EfP-III-I；9 =EfP-II1-2 ；)。图6是图示本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物对HBV转基因小鼠的治疗作用的图。图6A图示ALT的变化；图6B图示AST的变化；图6C图示HBsAg的变化；图6D为病理观察结果。其中A为生理盐水组(10倍)；B为本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物组(10倍)；C为拉米夫定组(10倍)。图7为图示SEQ ID NO. I对H印G 2. 2. 15细胞水平的作用的图。图7A为SEQ IDNO. I对HBsAg和HBeAg分泌的影响；图7B为拉米夫定对HBsAg和HBeAg分泌的影响；
具体实施例方式以下本文将通过具体的实施例来描述本发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的参考书如蛋白质技术手册(汪家政、范明主编，科学出版社)、抗体技术实验指南(沈关心、龚非力等译，科学出版社)、药理实验方法学(第三版，主编徐淑云，人民卫生出版社)、分子生物学实验指导(刘进元，清华大学出版社)、分子克隆实验指南(第三版，黄培堂等译，科学出版社)等以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。定义在本发明中所述的“具有80%以上的同源性”具体指同样来源于蚯蚓的蛋白的氨基酸序列，其与本发明的SEQ ID NO. 1-18的序列具有80%以上，优选85%以上，更优选90%以上，还更优选95%以上，甚至99%以上的同源性，并且最优选地，其与SEQ IDNO. 1-16的序列之间某个位置上的氨基酸残基的差异仅为保守氨基酸置换。本文中所述的“疾病”应从广义上理解，即上述疾病可以是原发性的或继发性的(例如肝炎、肝炎继发性感染、肝炎继发性肾病等)，或是隐性的或显性的(例如肝炎病毒携带者、病毒性肝炎等)，或是并发症和/或合并症(例如，乙型肝炎性肾炎、肝原性糖尿病、肝炎合并溶血、妊娠合并输血性乙肝等)。本文中所述的“HBeAg相关疾病”是指疾病和/或其并发症的发生、发展、进展、恶化；疾病和/或其并发症的预防、缓解、减轻、消退；疾病和/或并发症的诊断、预后、治疗方案选择、治疗反应监测、临床转归等与HBeAg的存在、表达、变化和清除等有密切联系，或相互有因果关系。例如，用于乙肝病毒携带者或活动性乙肝患者HBeAg的转阴；用于HBeAg阳性的肝硬化或肝癌患者的治疗；处于乙肝病毒感染高危(例如，大量输血或有经常病毒携带者接触可能性)的免疫缺陷患者的预防性应用；肝癌治疗中的某个阶段需要控制HBV的活动性；其他类型肝炎患者的预防性应用；用于HBeAg的诊断(例如通过本发明的蚯蚓蛋白的消耗量来间接定量测定HBeAg的含量)等等。因此，尽管本文中在很多地方提到乙型肝炎，但实际上本发明并不限于乙型肝炎，只要在某种疾病的诊断、预防、治疗中HBeAg的存在有一定的临床意义，均适用于本发明。本发明所述的“粗酶提取物”是指将蚯蚓用蒸馏水洗涤、浸泡并在室温下静置10 48小时后，将蚯蚓匀浆、离心，将上清液透析后所得的蛋白溶液为粗酶提取物。本发明发明所述的“催化三联体”是指丝氨酸蛋白酶家族的酶活性部位存在着三个极性残基-His, Asp和Ser,这三个极性残基形成催化三联体(catalytic triad)。具有HBeAg降解酶活性的蚯蚓蛋白在本发明的一个实施方案中，提供一种蚯蚓蛋白，其具有选自下列(a)-(b)中的一种序列(a)SEQ ID NO. 1_16任一项所不的氨基酸序列；(b)与(a)中所述的任一种氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列，优选85%以上，更优选90%以上，还更优选95%以上，甚至99%以上的同源性，并且最优选地，其与SEQ ID NO. 1_16的序列之间某个位置上的氨基酸残基的差异为保守氨基酸置换；其中上述氨基酸序列均具有由H43，D91，S188组成的催化三联体，以及所述蚯蚓蛋白具有HBeAg降解酶活性。 在本发明中，艇蝴选用正蝴科胜蝴属的赤子爱胜蝴(Eisenia foetida),艇蝴蛋白主要分布于环带和胃的部分，特别是肠的前端。
本发明人发现SEQ ID NO. 1-16氨基酸序列的共性是具有共同的功能域H43，D91,S188 (其上编号对应于SEQ ID NO. I氨基酸序列)组成的催化三联体，其中SEQ ID NO. 2-SEQID NO. 10具有85%以上的同源性。另外，从功能上，它们的共同特征是其HBeAg降解酶活性为从HBeAg的C端开始，在141位精氨酸和142位谷氨酸处降解HBeAg(见实施例2和表I)。在本发明的另ー个实施方案中，提供了ー种药物组合物，包括本发明的蚯蚓蛋白作为活性成分，以及ー种或多种药用的载体、赋形剂、稀释剂或辅料。该药物组合物可根据需要由本领域技术人员根据常规制药 方法制成为适当的剂型。在制备包括本发明的药物组合物的剂型过程中，本发明的药物组合物通常与载体和/或赋形剂通过常规的混合、溶解、制粒、制锭研磨、乳化、封装、包埋或冻干等エ艺进行制备，本发明的药物稀释或包封在其中(见Remington' s Pharmaceutical Sciences,第十五版，Hoover, J. Ε·主编，Mack Publishing Co. (2003))。上述剂型可采取任何合适的给药方式，该方式包括局部、经ロ、全身、经鼻、注射、透皮等途径。对于局部给药，本发明的药物组合物可制成溶液、凝胶、油膏、乳膏、悬浮液等。全身制剂包括设计通过注射给药，例如皮下、静脉内、肌肉内、瘤内、鞘内或腹膜内注射的剂型，以及设计用于透皮、透粘膜口腔或肺部给药的剂型。可注射剂型包括本发明的药物组合物在水性或油性媒介中的无菌悬浮液、溶液或乳液。所述剂型还可含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等。注射剂型可以单位剂型提供，例如，在安瓿中或多次剂量容器中，可含有防腐剤。可注射剂型也可选择粉末的形式，在使用前使用合适的媒介物，包括但不限于无菌无热源水、缓冲液、葡萄糖溶液等重新配制。可注射剂型可通过直接静脉内注射、静脉快速滴注给药,或通过加入输注溶液如O. 9%氯化钠注射液或其他相容的输注溶液进行输注给药。对于ロ服给药，本发明的药物组合物可使用药学可接受的赋形剂和/或添加剂通过常规的方式制备成例如锭剂、片剂或胶囊的剂型。用于ロ服给药的液体剂型可采取例如酏剂、溶液、糖浆剂或悬液的形式，或可是粉末，在使用前使用水或其他合适的媒介物进行配制。这种液体剂型可通过常规的方式使用药学可接受的添加剂来进行制备。ロ服给药制剂可被配制成为可控释放剂型，其制备エ艺和方法在本领域中是公知的。优选片剂和胶囊剂型。对于长期药物递送，本发明的药物组合物可制成缓释制剂以便通过植入或肌肉内注射给药。本发明的药物组合物可使用合适的聚合物或疏水材料(例如，在药学可接受的油中形成乳液)或离子交換树脂进行配制。可选的是，可使用制成为贴片透皮递送系统，可缓慢地释放本发明的药物组合物经皮吸收。可使用滲透促进剂来促进本发明的药物组合物的经皮渗透。本发明的药物组合物的各种剂型将由医生根据相关因素来确定具体给药量，这些因素包括被治疗的疾病、选择的给药途径、姆个患者的年龄、体重和患者对治疗的反应情况、患者症状的严重性等。
在本发明的一个实施方案中，涉及本发明的蚯蚓蛋白或药物组合物在制备治疗或预防HBeAg相关疾病的药物中的应用。在一个优选的实施方案中，所述HBeAg相关疾病选自こ型肝炎、e抗原和/或表面抗原阳性的こ型肝炎病毒携帯者、由こ型肝炎引起的肝硬化或肿瘤。本发明中提到的患者可以是任何哺乳动物，优选人类。本领域专业技术人员应该理解的是，本发明的范围并不限于上面所述的内容和具体实施方案。根据本发明所述的内容，对于本领域专业技术人员显而易见的是本发明的蚯蚓蛋白可以单独使用，也可以多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种，甚至更多种本发明的蚯蚓蛋白)一起使用，视具体情况而定。另外，本发明的蚯蚓蛋白还可以与其他药物和治疗方法一起联合使用，可以由本领域技术人员根据相关因素来确定。
蚯蚓蛋白粗酶提取物在本发明的一个实施方案中，提供了ー种蚯蚓蛋白粗酶提取物的制备方法，其包括以下步骤I)选取2月龄、5-8cm长的赤子爱胜蚓(E. fetida)于蒸馏水中清洗，然后将蚯蚓在室温下浸泡于蒸懼水中12h,使其吐尽消化道中的污物。2)将I公斤蚯蚓在(λ 05M Tris-HCl缓冲液中匀浆，于4°C、8000rpm离心30min。取上清，对85%的硫酸铵平衡液于4°C透析过夜。3)以Sepharose_4B (IOml)为载体,经羰基ニ咪唑(800mg)活化后，与大豆胰蛋白酶抑制剂配基偶联，制备亲和载体。制备好的亲和载体装柱，用O. lmol/L NaHCO3缓冲液(pH8. O)平衡柱子。上清液经上亲和层析柱吸附，待流出液的酶活与上柱液一致时，表明吸附已达饱和，用O.Olmol/L NaHCO3缓冲液(pH 8.0)平衡液洗去未吸附杂蛋白，再用以平衡液配制的6mol/L尿素溶液洗脱蚯蚓蛋白酶，对水透析除去尿素，得蚯蚓蛋白酶全组分，冻干保存。4)将处理好的DEAE-Cellulose-52装柱，用O. 01mol/L pH8. O磷酸盐缓冲液平衡；将亲和层析得到的粗酶液对上述平衡液透析，上柱，先用平衡液洗脱，再分别用含有0. 05、
0.U0. 15,0. 20,0. 25,0. 3mol/L NaCl的平衡缓冲液分步洗脱，收集对应各洗脱峰的洗脱液。5)SEQ ID NO. I的蚯蚓蛋白酶可按照中国发明专利ZL02116747. 8中所提供的方法
进ー步纯化，从而得到单ー组分。由此，根据本发明的上述方法得到本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物。在一个优选的实施方案中，本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物包括至少ー种具有下列氨基酸序列的蚯蚓蛋白(a)SEQ ID NO. 1_16任一项所示的氨基酸序列；(b)与(a)中所述的任一种氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列，其中上述氨基酸序列均具有由H43，D91, S188组成的催化三联体，以及所述蚯蚓蛋白具有HBeAg降解酶活性。在另ー个优选的实施方案中，本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物包括具有以下氨基酸序列的蛋白SEQ ID NO. I, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 11，SEQ ID NO. 12，SEQ ID NO. 14，SEQID NO. 15，其中SEQ ID NO. I丰度最高。在此应注意，本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物不限于是从层析柱中洗脱的初始粗酶提取物，可以是经进ー步提纯为单ー组分后另行组合的混合物。
本发明还提供了ー种药物组合物，其包括本发明的蚯蚓蛋白粗酶提取物作为活性成分，以及ー种或多种药用的载体、赋形剂、稀释剂或辅料。该药物组合物可根据需要由本领域技术人员根据常规制药方法制成为适当的剂型。在本发明的另ー个方面，涉及上述蚯蚓蛋白粗酶提取物或含有该蚯蚓蛋白粗酶提取物的药物组合物在制备治疗或预防HBeAg相关疾病的药物中的应用。在一个优选的实施方案中，所述HBeAg相关疾病选自こ型肝炎、e抗原和/或表面抗原阳性的こ型肝炎病毒携带者、由こ型肝炎引起的肝硬化或肿瘤。
实施例下面的实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式解释为限制本发明的范围。因此，为简便起见，下面的实施例仅以本发明的蚯蚓蛋白SEQ ID NO. I和根据本发明的提取方法提取的ー组粗酶提取物来说明，因为本发明公开的其他蛋白与SEQ ID NO. I—祥具有催化HBeAg的催化三联体，因而同样具有降解HBeAg的作用(数据未显示)。同理，本发明提 取的各种粗酶提取物在性质上类似，只不过有可能在各种蛋白的丰度上有所差异，因此其降解HBeAg的作用发生根本的变化。下面实施例中如未特别说明，所有试剂均是市售的。实施例I本发明的蚯蚓蛋白与HBeAg蛋白共同孵育试验实验方法与结果I.取HBeAg(北京华美生科生物技术有限公司)(66.7 μ M)，加入一定浓度的本发明的蚯蚓蛋白(SEQ ID NO. I蛋白)(O 6μΜ)于37°C孵育，分别于15，30，45，60，90，120min取样，同时以空白HBeAg和本发明的蚯蚓蛋白(SEQ ID No. I)(在37°C孵育120min)作为对照。2.将上述孵育样品加入5 X SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10分钟，进行15 %SDS-PAGE，最后以考马斯亮蓝染色。3. SDS-PAGE见图I。结果显示空白HBeAg在37°C孵育120min蛋白质条带无明显变化，HBeAg与本发明的蚯蚓蛋白的孵育产物中蛋白条带迅速降解(见图IA和图1B)。实施例2本发明的蚯蚓蛋白对HBeAg蛋白水解位置的分析实验方法与结果I.将66·7μΜ HBeAg蛋白与本发明的蚯蚓蛋白(SEQ ID No. I) (6 μ Μ)在37。。孵育 60min，将酶解产物进行 15% SDS-PAGE 并转至 PVDF 膜(Millipore，USA)。2.将膜进行考马斯亮蓝染色，将酶解产生的主要条带进行N端测序(仪器为Applied Biosystem Automated Protein Sequencer, Applied Biosystem Inc. ,USA)。3.由测序结果(见表I)分析本发明的蚯蚓蛋白对HBeAg蛋白的作用是从HBeAg蛋白的C端开始，根据酶解片段与原蛋白片段分子量比对，分析本发明的蚯蚓蛋白对HBeAg的作用位点在141位精氨酸和142位谷氨酸两个氨基酸附近。表I. HBeAg蛋白及酶解片段蛋白的N端序列
蛋白片段编号 N端序列 aTMITN
权利要求
1.ー种虫丘蝴蛋白，具有选自下列(a)-(b)中的ー种序列 (a)SEQ ID NO. 1-16任一项所不的氨基酸序列； (b)与(a)中所述的任一种氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列， 其中上述氨基酸序列均具有由H43，D91，S188组成的催化三联体，以及所述蚯蚓蛋白具有HBeAg降解酶活性。
2.如权利要求I所述的蚯蚓蛋白，其特征在于所述HBeAg降解酶活性为从HBeAg的C端开始，在141位精氨酸和142位谷氨酸处降解HBeAg。
3.—种药物组合物，包括至少ー种权利要求I或2所述的蚯蚓蛋白作为活性成分，以及ー种或多种药用的载体、赋形剂、稀释剂或辅料。
4.ー种蚯蚓蛋白粗酶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)将蚯蚓用蒸馏水洗涤、浸泡并在室温下静置10 48小吋，以排除体内的泥沙； 2)将蚯蚓匀浆、离心，将上清液透析； 3)将经透析的上清液经大豆胰蛋白酶抑制剂-亲和层析柱吸附，除去未吸附杂蛋白后，用平衡液从所述层析柱上洗脱所述蚯蚓蛋白粗酶提取物。
5.一种由权利要求4所述的方法制备的蚯蚓蛋白粗酶提取物。
6.如权利要求5所述的蚯蚓蛋白粗酶提取物，其特征在于包括至少ー种或两种以上的如权利要求I或2所述的蚯蚓蛋白。
7.如权利要求5或6所述的蚯蚓蛋白粗酶提取物，其特征在于包括具有以下氨基酸序列的蛋白SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 11，SEQ ID NO. 12，SEQ ID NO. 14，SEQID NO. 15，其中SEQ ID NO. I丰度最高。
8.—种药物组合物，包括权利要求5-7中任意一项所述的蚯蚓蛋白粗酶提取物作为活性成分，以及ー种或多种药用的载体、赋形剂、稀释剂或辅料。
9.权利要求1-3中任一项所述的蚯蚓蛋白或药物组合物，或权利要求5-8中任意ー项所述的蚯蚓蛋白粗酶提取物或药物组合物在制备治疗或预防HBeAg相关疾病的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述HBeAg相关疾病选自こ型肝炎、e抗原和/或表面抗原阳性的こ型肝炎病毒携帯者、由こ型肝炎引起的肝硬化或肿瘤。
11.如权利要求1-3中任一项所述的蚯蚓蛋白或药物组合物，或如权利要求5-8所述的蚯蚓蛋白粗酶提取物或药物组合物在制备诊断HBeAg的试剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种具有HBeAg降解酶活性的蚯蚓蛋白，以及含有其的药物组合物。本发明还提供了所述蚯蚓蛋白在制备治疗HBeAg相关性疾病的药物中的应用，所述HBeAg相关性疾病包括乙型肝炎，乙型肝炎引起的肝硬化，以及e抗原阳性和表面抗原阳性的乙型肝炎病毒携带者等。另外，本发明还提供一种分离含有所述蚯蚓蛋白的粗酶提取物的方法以及由该方法制备的蚯蚓蛋白粗酶提取物及其在制备治疗HBeAg相关性疾病的药物中的应用。
文档编号A61P35/02GK102649814SQ20101059292
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者周园, 赫荣乔 申请人:中国科学院生物物理研究所