使用编码和分泌神经保护因子和/或抗血管形成因子的包囊细胞治疗眼疾病的制作方法

专利名称：使用编码和分泌神经保护因子和/或抗血管形成因子的包囊细胞治疗眼疾病的制作方法
使用编码和分泌神经保护因子和/或抗血管形成因子的包
囊细胞治疗眼疾病本申请涉及编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞或者任何其它适宜细胞。此类眼疾病包括青光眼和其它视神经病症，视网膜病，特别是色素性视网膜炎(RP)，年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病等。本文所用细胞被包囊于(球形)微囊中，所述微囊优选包括核芯和至少一个表面层，以防止所治疗患者的免疫系统反应。本申请还涉及这些(球形)微囊或者本文定义的用于(眼内)治疗眼疾病的此类因子(用于制备(药物)组合物)以用于治疗此类眼疾病的用途。眼疾病或病症是特别受关注的，因为这些疾病或病症可能导致一些患者严重的视觉损伤并且甚至失明。在那些眼疾病或病症中特别关注的是青光眼和其它视神经疾病，以及视网膜病症。此类视网膜病症可能尤其包括色素性视网膜炎(RP)、黄斑变 性(MD)、年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)、斑点水肿、特别是归咎于其它原因的斑点水肿、视网膜血管阻塞、高血压性视网膜病和糖尿病性视网膜病等。在上文中，色素性视网膜炎(RP)被分类为一组遗传性眼科病症。在色素性视网膜炎症状的进程中，夜盲症通常在视野收缩之前数年甚至数十年。许多患有色素性视网膜炎的人在他们40多岁或50多岁前不会变成法理上的盲人，并在他们的一生中保留一些视力。其它人会由色素性视网膜炎变成完全失明，在一些患者中可早至童年。色素性视网膜炎是遗传性视网膜营养障碍的最常见形式之一，所述遗传性视网膜营养障碍是一组遗传性病症，其特征是感光细胞的进行性丧失、光感受器(视杆细胞和圆锥体)和/或视网膜的视网膜色素上皮细胞(RPE)的异常，其可能导致进行性视力丧失。受影响的个体首先会经历不完全的暗适应或者夜盲(夜盲症)，接着是周围视野的减少(称为视野收缩)，以及，根据特定疾病，在疾病过程后期的中心视觉丧失。色素性视网膜炎与进行性聋一起称为乌谢尔综合征(Usher syndrome)。作为遗传性视网膜变性的一种形式，当发生突变时，据认为有多个基因会引起色素性视网膜炎表型。在1989年，识别了视网膜紫质基因的突变体，所述视网膜紫质是一种色素，其在在低光线条件下启动视觉的视觉转导级联中起主要作用。从那时起，在此基因中已发现100多种突变体，占所有视网膜变性类型的15%。这些突变体的大部分是错义突变体并且通常是遗传性的。此外，视网膜紫质基因编码光感受器外节的主要蛋白质。研究显示，在此基因中的突变体负责约25%的色素性视网膜炎的常染色体形式。此外，自从在1990年首次报道蛋白质的管内区域中的Pro23HiS突变体以来，至今已报道有在与色素性视网膜炎有关的视蛋白质基因中多达150种突变体。这些突变体在整个视蛋白质基因被发现，并且沿着蛋白质的三个区域分布(盘内(intradiscal)区、跨膜区和胞浆区)。除了遗传因素以外，引起色素性视网膜炎的突变还可能归因于生物化学事件例如蛋白质错折叠或者涉及分子伴侣。目前，没有能完全治愈色素性视网膜炎的现有医学治疗疗法。即使用维生素A治疗代表了最常见的治疗法，它可能不可靠地仅仅减少疾病发展，例如通过每天服用例如15000IU维生素A棕榈酸酯。其它治疗法可能涉及视网膜移植、人工视网膜植入、基因治疗、干细胞治疗、营养补充等。
其它形式的视网膜病症可包括黄斑变性(MD)。黄斑变性是一种代表较老成年人 (> 50岁)和高度近视个体的失明的主要原因的医学病症。黄斑变性(MD)的症状通常包括视野中心(斑点)的视力丧失，其原因是在此区域视网膜损伤。黄斑变性可能使其难以或不可能阅读或识别面容，尽管残留有足够的周边视觉以容许日常生活的其它活动。MD的诊断可以例如通过荧光素血管造影术来进行，该方法可识别和定位异常血管过程。此外，光学相干断层扫描和其它新开发的成像技术可用于诊断和 评价对MD治疗的反应。MD的一种形式是所谓的年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)。除青光眼和糖尿病性视网膜病以外，它是西方国家中视力损失和失明的最常见原因之一。年龄相关性黄斑变性的发生通常与黄斑(提供详细中央视觉的视网膜中心区域，称为视网膜小凹)中的特征性浅黄色沉积物有关，所述黄斑称为视网膜色素上皮细胞和下面脉络膜之间的脉网膜小疣。具有这些早期变化(称为年龄相关性黄斑病)的大多数人通常无视觉损伤。然而，这些早期变化可相对地经常发展为晚期ADM。当脉网膜小疣大并且数目众多时而且与黄斑下的色素细胞层中的紊乱关联时该风险是相当高的。与视深度损失有关的晚期AMD通常以两种形式发生干性和湿性AMD。晚期AMD的“干性”形式，亦称为中心地理性萎缩(central geographic atrophy)，通常是由视网膜下面的视网膜色素上皮层(和可能的脉络膜内层) 的萎缩造成的并且通过眼中央部分中光感受器(视杆细胞和圆锥体)丧失而导致视力丧失。可能还有聚集在视网膜和脉络膜之间的细胞碎片(称为脉网膜小疣)。虽然此病症尚无治疗法，含有高剂量抗氧剂、叶黄素和玉米黄素的维生素补充剂已由国家眼科研究所 (National Eye Institute)和其它人所证实可减缓干性黄斑变性的进程，并且在一些患者中，改善了视觉灵敏度。晚期AMD的“湿性”形式亦称为新生血管性或渗出性AMD，代表了更为严重的AMD形式。渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD) (AMD的湿性形式)典型特征在于眼中异常血管生长，其中有缺陷的血管渗漏液体和血液。其可由于从脉络膜毛细血管穿过 Bruch氏膜进入视网膜下间隙的异常血管生长而引起视力丧失，最终导致黄斑下面的血液和蛋白质渗漏。如果不治疗的话，来自这些血管的出血、渗漏和瘢痕形成最终导致对光感受器的不可逆的损伤、黄斑中的瘢痕形成和相对快速的视力丧失。直到今天，对于AMD特别是对于湿性形式的AMD仅有少数治疗法可用。渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)目前通常用眼内治疗法来治疗，并且较少用(另外的)激光凝固法。眼内治疗法包括使用抗血管形成剂，其在直接注入到眼的玻璃体中时可引起异常血管的退化以及视力改善。此类抗血管形成剂，包括有效抑制VEGF的试剂(抗血管内皮生长因子)，被用于预防眼中异常的新生血管的形成，并且能够使已经开始渗漏的血管干涸。不幸的是，这些注射需要两月一次或一月一次频繁地反复进行，并且产生注射相关风险，特别是眼内感染的风险。这些试剂的实例包括Lucentis 、Avastin (结构上接近于Lucentis ) 和Macugen 。在这些抗血管形成剂中，仅有Lucenti s和Macugen是在2009年一月由FDA-批准的。已发现Macugen在新生血管性AMD中具有较低的益处，因此目前使用Lucentis 优于使用Macugen 。在这种情况下，WO02/067971 A2 (Novartis AG, Basel, Switzerland)公开了治疗眼新生血管形成的方法。为此目的，WO 02/067971 A2采用对待治疗的患者直接施用编码内皮抑制素的(腺)病毒载体或者施用产生内皮抑制素的细胞。然而，细胞的施用会导致待治疗患者中不期望的免疫反应。WO 02/067971 A2还建议递送微包囊形式的细胞，然而，并未显示这些微包囊细胞可以有效地生产、防止不期望的免疫反应，并且有效地治疗眼新生血管形成或其它眼疾病。WO 02/067971 A2亦未显示成功地施用此类微包囊细胞给患
者ο其它较常见的视网膜病症包括视网膜血管闭塞。根据最近基于群体的研究，年龄 40+的一般群体中约罹患视网膜血管闭塞，大部分是视网膜静脉闭塞或视网膜动脉闭塞。对于视网膜动脉闭塞，到目前为止尚不能得到循证治疗法。动脉闭塞通常只持续有限的时间，此后动脉重新开放。因此期望有一种治疗法，其有助于损伤的视网膜细胞存活直到动脉重新疏通。在视网膜静脉闭塞的情况下，已经进行了视网膜激光凝固和/或药物眼内施用，以减少黄斑水肿并降低眼内不需要的新生血管形成的风险。此外对于视网膜静脉闭塞，神经保护治疗法被证明有助于细胞存活直到周围症状改善。青光眼是一种异源性的疾病组，其特征是视网膜神经节细胞及其轴突的损失，导致视神经乳头的检眼镜(ophthalmoscopally)典型表象。眼球内压可能升高(例如在所谓的高压青光眼中)，或者其可以统计学上正常的(例如在所谓的常压青光眼中)。根据相对近期的研究，的眼窝脑脊液压如经终板(trans-lamian)筛状对抗压力在一些常压青光眼患者中可能异常地低。青光眼还可能是慢性的(例如在大多数开角青光眼中)，或者它们会急性发作伴有显著疼痛(例如在一些闭角青光眼中)。青光眼的异质性(heterogenitiy) 解释了为何存在不同的治疗方式。其全部都必须降低眼内压。此外，神经保护性或者甚至是神经再生性治疗是必要的，以支撑受损细胞存活或者甚至再生。相当多的其它药剂可大体上用于治疗ADM和其它视网膜病症以及视神经病症。除了为进一步开发新治疗策略的许多实验性研究以外，已有许多1期、2期和3期研究来检测此类新药治疗AMD和提及的其它疾病的临床效果，然而，目前没有有效的治疗法来保护或者更优选再生视网膜组织，包括视神经，小梁网和/或血管细胞，作为如上文所述的长期治疗。尽管用药剂(例如维生素A和维生素A棕榈酸酯)治疗色素性视网膜炎(RP)以及用药物(例如Lucentis 和Macugen )治疗AMD已显示出减缓了这些疾病的进程，但是目前尚无有效的治疗法，因为所有这些治疗策略不能显示对细胞损失具有保护作用。外科手术如视网膜移植或人工视网膜植入仍然在早期实验阶段。同样，有效治疗法例如基因治疗法以及干细胞治疗法、营养补充剂等至今尚未开发到临床阶段。因此，本发明的一个目的是为上文所述眼疾病和病症，特别是视网膜退化所致的眼疾病和病症提供有效的治疗法，所述方法可避免这些问题并且其可提供有效的长期治疗而不需要频繁地反复施用药物和/或没有不期望副作用的风险。本发明的目的是通过所附权利要求解决的。

本发明的目的具体通过使用适用于(眼内)治疗眼疾病的本文所述神的经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体(制备药物组合物)(眼内)治疗本文定义的眼疾病或病症来实现，所述眼疾病或病症优选包括视网膜病，特别是色素性视网膜炎(RP)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性视网膜病变，视网膜血管阻塞和视神经病。更优选地，本发明的目的是通过使用细胞(制备药物组合物)(眼内)治疗本文所定义眼疾病来实现，所述细胞例如间充质干细胞或者间充质基质细胞或任何其它细胞(类型)，其可以在本发明的背景下使用，可以编码和分泌适用于(眼内)治疗本文所述眼疾病或病症的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体，所述眼疾病优选包括视网膜病，特别是色素性视网膜炎(RP)，年龄相关性黄斑变性(AMD)，糖尿病性视网膜病变，视网膜血管阻塞和视神经病，其中所述细胞被包囊于(球形)微囊中，优选防止所治疗患者的免疫系统的反应。在本发明上下文中，术语“编码…的细胞”通常表示“细胞，其被基因工程化为含有或包含编码…的核酸”。通过包埋在本文所述(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞来施用适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体能够避免反复施用此类因子的问题。本文定义的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质可因此通过使含有编码和表达此因子的核酸的细胞经眼内施用给患者。此外，由于这些因子从所移植的细胞中分泌，植入此类细胞可确保体内更长久地提供这些因子。它们在关注的部位直接提供这些因子而不需要反复施用。本领域已知，免疫系统通常会识别外源性细胞并激发免疫反应，以防止此外来物质而保护该生物体。因此，这样能够表达适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体的细胞的植入可因此导致生物体中的免疫反应。这种防御反应在治疗期间会引起大量的且不希望的副作用，并且可导致严重并发症或者甚至所治疗生物体的死亡。避免该问题的一个策略，其也是在本文中要面对的，是使用自体细胞，即得自患者本身的细胞，它们在遗传学上会变为瞬时地表达适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和 /或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体。此操作方法优选限于所治疗的特定患者的细胞。

在本发明上下文中，术语“眼疾病”特别地包括视网膜退化所致的眼疾病和病症，包括，尤其是视网膜病，选自色素性视网膜炎(RP)、黄斑变性(MD)、年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)、视网膜病变、糖尿病性视网膜病变黄斑水肿的由任何其它原因引起的视网膜病，血管内皮和周皮细胞异常、视网膜血管阻塞、青光眼，包括小梁网，以及其它视神经病，包括小梁网改变，和角膜内皮异常等或者与其有关的任何疾病或病症。在这种情况下，本发明上下文中的眼疾病还可以是起因于眼新生血管形成的眼疾病、脉络膜新生血管形成、起因于黄斑变性的脉络膜新生血管形成、顽固性和复发性脉络膜新生血管形成、 组织胞浆菌病和病理性近视所致的脉络膜新生血管形成、血管样纹所致的脉络膜新生血管形成、前部缺血性视神经病、细菌性心内膜炎、先天性黄斑变性(Best氏病)，鸟枪弹样视网膜脉络膜病变，脉络膜血管瘤，脉络膜痣，脉络膜无灌注，脉络膜骨瘤，脉络膜破裂， 无脉络膜，慢性视网膜剥离，视网膜缺损，脉网膜小疣，内源性念珠菌属眼内炎，视网膜色素性上皮细胞的外乳头状错构瘤，黄点状眼底，原发性，黄斑裂洞，恶性黑色素瘤，膜增生性肾小球肾炎(II型)，金属性眼内异物，牵牛花椎间盘综合征，多发性消散性白点综合征(MEWDS)，锯齿缘处新生血管形成，手术显微镜痛，视神经乳头凹陷，光凝固，斑点状内脉络膜病，风疹，肉状瘤病，匐行性或地图状脉络膜炎，视网膜下液引流，倾斜椎间盘综合征，弓形虫性(Taxoplasma)视网膜脉络膜炎，结核病，或伏格特-小柳-原田三氏综合征 (Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)，糖尿病性视网膜病所致新生血管形成，非糖尿病性视网膜病，静脉分支闭塞，中央视网膜静脉闭塞，早产儿视网膜病，虹膜发红，新生血管性青光眼，黄斑旁毛细血管扩张症，镰状红细胞视网膜病，伊尔斯病(Eale’ disease)，视网膜脉管炎，脑视网膜血管瘤病，放射性视网膜病，视网膜冷冻创伤，色素性视网膜炎，视网膜脉络膜缺损，单纯疱疹性角膜炎所致角膜新生血管形成，角膜溃疡，角膜成形术，翼状胬肉 (pterigyia)或创伤。本发明上下文中的眼疾病优选不包括眼的肿瘤疾病或者成胶质细胞瘤。用于提供上述发明方案的细胞优选被包囊在(球形)微囊中以防止所治疗患者的免疫系统反应，所述细胞编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体。在本发明上下文中，这种(球形)微囊优选包括(球形)核芯(即，所述核芯可以是球形的或者不是球形的)以及至少一个表面包裹层，其中 所述(球形)核芯包括或组成为典型交联聚合物和细胞(的混合物)，所述细胞例如间充质干细胞或间充质基质细胞或者任何其它细胞(类型)，其可以在本发明上下文中使用并且编码和分泌如本文定义的优选适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护或抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体；和 所述至少一个表面包裹层包括或组成为典型交联聚合物。 优选地，所述(球形)微囊不是仅由不具有本文定义的任何表面包裹层的核芯构成，因为仅有此表面包裹层优选提供这些(球形)微囊施用后例如注射或植入到(宿主器官的)施用位置后的有效免疫屏障。包含本文所用的编码和分泌神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体的细胞的(球形)微囊通常构成一定的粒子大小，本文称为(球形)微囊总直径。通常，用于本文的(球形)微囊总直径可以有相当大的变化， 这取决于具体的治疗和施用方式。在本发明上下文中，治疗严格限于本文定义的眼疾病和病症。由于所述治疗通常是通过使本文所用(球形)微囊局部施用于特定施用位置例如通过注射或植入而发生的，施用方式可能会限制本文所用(球形)微囊总直径，例如受注射管的直径限制。本文所用(球形)微囊总直径进一步通过(球形)微囊的核芯直径以及至少一个表面包裹层的厚度来确定，两种直径通常至少部分地相互依赖并且当然影响(球形) 微囊总直径。为了治疗如本文定义的眼疾病，本申请的发明人出乎意料地发现，可以使用的 (球形)微囊总直径(粒子大小)为约120 μ m至约800 μ m,优选约120 μ m至约700 μ m，更优选总直径约150 μ m至约650 μ m,再更优选总直径约165 μ m至约600 μ m。特别地，(球形)微囊总直径(粒子大小)约120 μ m至约300 μ m,更优选总直径约150 μ m至约250 μ m， 再更优选总直径约165 μ m至约225 μ m,最优选总直径约180 μ m至约200 μ m,例如约180、 185、190或200μπι是有利的。构成此总直径的(球形)微囊通常保留于所治疗的眼中选择的注射位置，并且不会迁移到周围组织中。这样就可以在治疗期间以足够长的时间在注射位置提供适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体的连续表达，以提供由这些因子产生的整个范围的有益效果。在(球形)微囊(或本文定义的(球形)核芯)的上述上下文中，术语“球形”以其最广泛的含义理解。球形粒子优选理解为具有类似球体的形状，而该形状可以是对称或不对称的，例如(球形)微囊和/或其核芯可以具有椭球体形状。在较低优选的实施方案中，根据本发明使用的所述微囊或核芯可能不是在上述含义内的球形，但是可以具有任意的形状，例如在该微囊的表面上有突出或侵入片段，或者可以呈纤维(特别是空心纤维)或片(特别是扁平或弯曲片)的形式。无论本公开内容如何提及“球形”微囊或核芯，“非球形”微囊或核芯同样是可以提供、制备或使用的。然而，根据优选的实施方案，(球形)微囊是球形微囊或者是椭球形微囊。优选地，(球形)微囊不是“非球形”微囊。更优选地，(球形)微囊不是呈纤维(特别是空心纤维)或片(特别是扁平或弯曲片)的形式。如本文定义的 ，本文所用(球形)微囊优选包括(球形)核芯(即核芯可以是球形的或者不是球形的)，其中所述(球形)核芯包括或组成为交联聚合物和细胞(的混合物)，所述细胞例如间充质干细胞或间充质基质细胞或者任何其它细胞(类型)，其可用在本发明上下文中并且编码和分泌如本文定义的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体。在本发明上下文中，(球形)微囊的(球形)核芯的典型交联聚合物形成将可用在本发明上下文中的细胞包埋在其空腔中的支架结构，所述细胞例如间充质干细胞或间充质基质细胞或者任何其它细胞(类型)。这些细胞可以被单个地或者通常以聚集体形式例如为约10至约10，000个细胞，例如约10至约500，约10至约1，000或约10至约10，000个细胞的聚集细胞(的群)包埋在该支架结构中。优选地，(球形)核芯包括交联聚合物和本文定义的包埋的细胞的均勻分布。优选地，包括支架结构和本文定义的包埋的细胞的核芯是根据下文所述方法制备的。在这种情况下，当为根据本发明的应用而制备(球形)微囊时，极其关键的是将可用在本发明上下文中的(球形)微囊的包囊细胞例如间充质干细胞或间充质基质细胞、自体细胞或任何其它细胞(类型)完全地包埋在聚合物基质中。可用在本发明上下文中的(球形)微囊的包埋的细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞或者如本文定义的任何其它细胞(类型)可以以约IXlO4至约1X108、1X109 或IXIOki的浓度，优选以约1X105、约IX IO6或约IX IO7个细胞/ml交联支架聚合物至约5 X IO8个细胞/ml交联支架聚合物的浓度(或者甚至约1 X IO9或1 X IO10个细胞/ml交联支架聚合物)，更优选以约1X105、约IXlO6或约IXlO7个细胞/ml交联支架聚合物至 1 X IO8个细胞/ml交联支架聚合物的浓度以及最优选以约1 X 105、约1 X IO6或约2 X IO7个细胞/ml交联支架聚合物至6 X IO7个细胞/ml交联支架聚合物的浓度存在于所述核芯中。在本发明上下文中，根据本发明使用的(球形)微囊的核芯通常具有不超过本文定义的(球形)微囊总直径的直径(粒子大小)。通常，根据本发明使用的(球形)微囊的核芯的直径为约50 μ m至约220 μ m,优选的直径为约100 μ m至约200 μ m,同样优选的直径为约115 μ m至约185 μ m，更优选的直径为约130 μ m至约170 μ m，再更优选的直径为约 145 μ m至约 155 μ m,例如约 120、125、130、135、140、145、150 或 155 μ m。特别优选地，根据本发明使用的(球形)微囊的核芯的直径优选比本文定义的(球形)微囊总直径小约1至约 80 μ m，更优选比本文定义的(球形)微囊总直径小约15至约70 μ m，最优选比本文定义的 (球形)微囊总直径小约30至约60 μ m。换言之，根据本发明使用的(球形)微囊的核芯的直径可具有大小为约50μπκ约60μπκ约70μπκ约80μπκ约90μπκ约100 μ m、约110 μ m、 ^ 120 μ m、^ 125 μ m、^ 130 μ m、^ 135 μ m、^ 140 μ m、^ 145 μ m、^ 150 μ m、^ 155 μ m、 约 160 μ m、约 165 μ m、约 170 μ m、约 175 μ m、约 180 μ m、约 185 μ m、约 190 μ m、约 195 μ m、约 200 μ m、约205 μ m、约210 μ m、约215 μ m，或者甚至约220 μ m，或者可以包括选自上述具体值的任意两个的任何范围本文定义的(球形)微囊的核芯包括本文定义的编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体的细胞。可以在本发明上下文中用于所述(球形)核芯的、位于该核芯周围的此类细胞例如间充质干细胞或间充质基质细胞或者任何其它细胞(类型)或者突出在所述支架结构外的细胞可能引起免疫问题，因为免疫系统会将这些微囊识别为外来组分，并因此这些微囊将会受到免疫系统的攻击。尽管这些作用可通过降低初始溶液中的细胞浓度来避免，但是本发明通过增加核芯的细胞部分来改变微囊的效能。核芯中的细胞浓度越高，则所得待移植的微囊的总体积越小，即在注射位置该微囊会更为有效。为了避免当使用(球形)微囊的(球形)核芯中高浓度的细胞时的免疫问题，本发明提供了施用于(球形)核芯上的至少一个表面包裹层。 这种表面包裹层使免疫反应不会发生，即使细胞在非常接近于核芯周围的位置，因为这些细胞由于作为屏障的表面包裹层的原因而不易接近宿主的免疫系统。这种表面包裹层通常由本文定义的交联聚合物构成而不含有任何细胞。根据一个特别优选的实施方案，前文定义的(球形)核芯用至少一个或者多于一个的表面包裹层例如1、2、3、4、5、5-10个或更多表面包裹层，更优选1、2或3个表面包裹层，最优选仅一个表面包裹层包裹。通常，每一表面包裹层构成在核芯周围均勻的厚度。根据本发明使用的(球形)微囊的表面包裹层的厚度几乎可以任意地变化，并且通常范围为约1至约80 μ m,更优选范围为约15至约70 μ m, 最优选范围为约20至约40 μ m，例如约30 μ m。本文所用(球形)微囊的(球形)核芯(和任选的(球形)微囊的至少一个表面包裹层)包括或组成为交联聚合物(的混合物)。在这种情况下，本领域已知并且适用于包囊的任何药学可接受的(可交联的)聚合物均可用于形成(球形)核芯以及，各自独立地， 形成根据本发明定义的(球形)微囊的至少一个表面包裹层。优选地，使用这样的聚合物， 其一方面在其交联状态是可渗透的以用于从外面供应氧和养分，并且另一方面能够使通过来自微囊的核芯细胞编码和分泌的肽扩散进入患者的组织或体液。此外，交联聚合物防止身体免疫系统的成分通过基质的侵入。例如，可以使用聚合物例如合成、半合成和天然水溶解性(生物)聚合物，例如来自天然的聚合物，例如选择的蛋白质或以蛋白质为基础的聚合物(例如胶原、白蛋白等)、聚氨基酸(例如聚-L-赖氨酸、聚-L-谷氨酸等)、多糖及其衍生物(例如羧甲基纤维素、纤维素硫酸酯、琼脂糖、藻酸盐包括褐藻的藻酸盐(例如海带目 (Laminarales)JjCHg (Ectocarpales)、岩藻目(Fucales)物种的)、角叉藻聚糖、透明质酸、肝素和相关的葡糖氨基硫酸盐、葡聚糖及其衍生物、壳聚糖及其衍生物)。也可以使用合成聚合物，例如脂肪族聚脂(例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基丁酸酯类等)、聚酰胺、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈、热塑性聚氨酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚四氟乙烯等。此外，相应地本文可以使用嵌段聚合物，即由两种或多种前述聚合物组合得到聚合物。此类嵌段聚合物可以由本领域技术人员根据期望的性质例如孔径、交联状态、毒性、 处置、生物相容性等来选择。上述聚合物的任一种被定义为在本发明上下文中的“化学上不同的聚合物”，即这些聚合物的每一种通常不会与任何其它上述聚合物显示相同摩尔质量和结构。相反，“化学上相同的聚合物”表示所述聚合物显示出相同的摩尔质量和结构。
最后，上述聚合物的混合物亦包括在本文中，其中包含在此混合物中的聚合物的量可以由本领域技术人员根据期望的性质例如上文所述的性质来选择。在此方面，如果所得聚合物混合物的总摩尔质量与混合物的单个聚合物的相应的摩尔百分数与另一聚合物混合物相同的话，则聚合物的混合物可以认为是与另一聚合物混合物在化学上是相同的 (“化学上相同的聚合物”)。优选地，本文所用(球形)微囊的(球形)核芯(和任选的(球形)微囊的至少一个表面包裹层)的交联聚合物(的混合物)包括或者组成为藻酸盐。如果根据本发明用作用于形成(球形)核芯和/或至少一个表面包裹层的聚合物，由于其生物相容性和交联性质，藻酸盐是特别有利的。根据化学上的观点，藻酸盐是得自通过两种酸的杂聚区分离的 β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸的均聚组的阴离子型多糖。藻酸盐是水溶性的并且在单价阳离子例如钠或钾的存在下形成高粘度溶液。交联水不溶性水凝胶是在单一藻酸盐链与二 _、三-或多价阳离子(例如钙、钡或聚赖氨酸)相互作用时形成的。优选地，纯化的藻酸盐(例如根据DE 198 36 960，其具体公开内容通过引用并入本文)用于包囊，更优选在生理盐水溶液中的藻酸钾或藻酸钠。此类藻酸盐通常具有约20kDa至约10，OOOkDa的摩尔质量，更优选约IOOkDa至约1，200kDa的摩尔质量。用于形成根据本发明使用的(球形)微囊的核芯和/或至少一个表面包裹层的藻酸盐可以以溶液提供，更优选以水溶液提供，例如，0.2% (w/v)的所用藻酸盐的藻酸盐水溶液的粘度范围为约2至约50mPa s，更优选范围为约3至约IOmPa S。如果根据本发明使用藻酸盐，则富含α-L-古罗糖醛酸的那些是优选的。换言之，含有至少50% α-L-古罗糖醛酸(和低于50% β-D-甘露糖醛酸)的藻酸盐是优选的。更优选地，所用的藻酸盐含有50%至70% α-L-古罗糖醛酸以及30和 50% β-D-甘露糖醛酸。适用于制备根据本发明使用的(球形)微囊的藻酸盐可以通过从某些藻类包括但不限于褐藻类例如海带目、水云目、岩藻目等以及产生藻酸盐的其它种类的藻类提取获得。藻酸盐可从新鲜藻类材料或干燥材料中根据本领域技术人员已知的制备藻酸盐的任何方法分离到。 就选择的聚合物以及选择的浓度而言，如本文定义的用于制备本文所用(球形) 微囊的(球形)核芯交联聚合物以及本文定义的和/或用于制备(球形)微囊的至少一个表面包裹层的交联聚合物可以相同或不同。根据第一实施方案，用于制备(球形)核芯和至少一个表面包裹层的交联聚合物可包含相同或不同浓度的化学上相同的聚合物。优选地，存在于(球形)核芯和至少一个表面包裹层中的聚合物使用选自上文定义的任一聚合物的非交联聚合物溶液制备。在此聚合物溶液中，非交联聚合物通常以约0.1% (w/v)至约8% (w/v)的非交联聚合物浓度，更优选以约0.1% (w/v)至约4% (w/v)的非交联聚合物浓度，再更优选以约0.5% (w/v)至约2. 5% (w/v)的非交联聚合物浓度以及最优选以约(w/v)至约2% (w/v)的非交联聚合物浓度存在。如果使用上文公开的藻酸盐作为用于制备本文所用(球形)微囊的(球形)核芯和本文定义的交联聚合物和/或来制备(球形)微囊的至少一个表面包裹层的聚合物，则用于制备(球形)核芯的聚合物溶液的浓度以及用于制备(球形)微囊的至少一个表面包裹层的聚合物溶液的浓度可以相互独立地选自0. 1至4% (w/v)的非交联聚合物浓度，优选0.4至2% (w/v)的非交联聚合物浓度。两种溶液的藻酸盐浓度可以相同。或者， 可以使用不同的藻酸盐浓度来制备根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯和至少一个表面包裹层。优选地，用于制备(球形)核芯和/或至少一个表面包裹层的非交联聚合物包括化学上相同的聚合物，更优选用相同浓度，例如用含有本文定义的聚合物的本文定义的浓度。在这种情况下，术语“％ (W/V)”是指非交联聚合物的浓度并且通常基于一定量的干燥形式的聚合物对聚合物溶液例如在使非交联聚合物溶解于适宜溶剂中(在交联之前)之后的总体积来确定。然而，如果适用的话，上述浓度还可以改为表示为相应于“％ V/V”浓度，例如如果使用在标准条件下(室温、常压等)以液体聚集状态存在的聚合物。根据第二实施方案，用于制备(球形)核芯和至少一个表面包裹层的交联聚合物可包含相同或不同浓度的的化学上不同的聚合物。从而，对于(球形)核芯和至少一个表面包裹层来说相互独立地分别选择如本文定义的浓度和聚合物。此外，聚合物还可以选自本文定义的聚合物，包括例如天然聚合物、合成聚合物以及聚合物的组合，即嵌段聚合物。用于核芯或至少一个表面包裹层的聚合物在性质上的不同也可以是由于使用的不同分子量的聚合物和/或由于相同聚合物的不同交联等。 在(球形)微囊包含一个以上的表面包裹层时，在至少一个表面包裹层的每一层中的聚合物可以相同或不同，即每一表面包裹层的交联聚合物可包含相同或不同浓度的化学上相同或不同的聚合物，例如，如本文定义的，根据本发明使用的(球形)微囊可包含由本文定义的任一聚合物组成的至少一个表面包裹层以及由如本文定义的聚阳离子例如聚氨基酸例如聚-L-赖氨酸、聚-L-谷氨酸等组成的另外的外表面包裹层。同样，用于不同表面包裹层的聚合物的性质的不同可以是由于所用聚合物的分子量不同和/或由于相同聚合物的不同交联等。本文所用(球形)微囊的(球形)核芯还包含细胞。此类细胞通常选自干细胞或基质细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细，或者选自可用在本发明上下文中的任何其它细胞(类型)，此类细胞编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体。此类细胞通过可以通过用核酸或者更确切地具有含有编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的核酸的载体转染细胞获得，如下文所定义的。适用于本文所用(球形)微囊(球形)核芯的细胞可以选自(未分化的)干细胞， 包括全能的、多向的或多能的干细胞。用于本上下文的干细胞优选包含胚胎干细胞或得自外胚层、中胚层或内胚层的干细胞，或者成体干细胞例如(人)间充质干细胞或间充质基质细胞(MSC，hMSC)(例如得自人骨髓或者得自脂肪组织的)、造血干细胞、表皮干细胞、神经干细胞和未成熟成纤维细胞，包括来自皮肤的成纤维细胞(成肌纤维细胞)等。这些(未分化的)干细胞通常能够进行对称的干细胞分裂，即产生相同复本的细胞分裂。干细胞保持转化成任何细胞类型的能力。此外，干细胞能够不对称地分裂，产生干细胞复本以及不同于干细胞复本的另一细胞，例如，分化的细胞。适用于本文所用(球形)微囊的(球形)核芯的如本文定义的干细胞特别是间充质干细胞或间充质基质细胞可另外产生支持编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片断或变体的效果的一组内源性营养因子。对于这种间充质基质细胞的旁分泌细胞保护机制的生物活性因子可以是例如细胞因子GRO、IL-6、IL-8、MCP-I以及生长因子VEGF、⑶NF和神经营养因子-3。根据一个特别优选的实施方案，(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞因此会分泌内源性蛋白质或肽作为以治疗水平通过胶囊释放的选自VEGF、IL6、IL8、GDNF, NT3和MCPl等的旁分泌因子。本文所用(球形)微囊的核芯可以替代地含有选自(分化的)细胞的细胞，例如， 可得自以上干细胞或基质细胞的，例如，结缔组织族的细胞，例如，(成熟的)成纤维细胞、 软骨细胞(软骨细胞)、骨细胞(成骨细胞/骨细胞、破骨细胞)、脂肪细胞(脂细胞)或平滑肌细胞，或者包括淋巴样祖细胞的血细胞或由其得到的细胞，例如，NK细胞、T-细胞、 B-细胞或树状突细胞，或者通常的骨髓样祖细胞或由其得到的细胞，例如，树状突细胞、单核细胞、巨噬细胞、破骨细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、巨核细胞或红细胞，或者巨噬细胞，神经元细胞包括星形胶质细胞、少突神经胶质细胞等，或者上皮细胞，或者表皮细胞。这些分化的细胞通常能够进行对称细胞分裂，即产生分化的母细胞的相同复本的细胞分裂。此外，在某些情况下，这些分化的细胞能够不对称分裂，产生母细胞的相同复本和不同于该母细胞的另一细胞，即比该母细胞更进一步分化的细胞。或者，在某些情况下，本文定义的分化的细胞能够例如通过添加选择性分化因子进一步分化而不需要细胞分裂。此外，根据本发明使用的包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞可以是得自待治疗患者自身(自体细胞)的细胞，或者可以得自同种异体细胞(例如得自体外培养的建立的细胞系，例如HEK293细胞、hTERT-MSC细胞等)。由于根据本发明使用的使(球形) 核芯包埋在(球形)微囊中的表面包裹层中，其容许使用同种异体细胞而不会由待治疗患者激发任何不期望的免疫反应。根据本发明使用的包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞还可以是本文定义的(分化的和/或未分化的)细胞类型的组合。根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯可以含有，例如，人间充质干细胞或人间充质基质细胞，其中这些细胞的一部分可以在体外或体内 分化成如本文定义的细胞类型，例如脂肪细胞(适用于移植到脂肪组织) 等。因此，各种细胞类型(例如得自特定的干细胞类型)可以被分配在核芯中，例如分享共有细胞系。总之，根据本发明使用的适用于制备(球形)微囊的(球形)核芯的细胞可选自未分化的或分化的细胞。根据一个实施方案，本文定义的未分化的细胞可以是优选的。此类未分化的细胞可提供有利的性质，例如根据本发明使用的(球形)微囊的长效作用，例如延长表达和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体的能力，例如由于此类未分化的细胞的较久的生存期。在一个替代实施方案中，本文定义的分化的细胞可优选用于制备根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯，因为它们通常不再会增殖并因此不会在根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯内导致不期望的细胞增殖。细胞的特异性分化可根据本领域已知方法由本领域技术人员在体外通过添加选择性分化因子到前体细胞中来进行。优选地，细胞是以这样的方式分化，即包埋在根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的大多数细胞(或至少90%，更优选至少95%以及最优选至少99% )属于相同细胞类型。特别地，如本文定义的间充质干细胞可以在体外分化成例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞如脂细胞、神经元样细胞如脑细胞等，并相应地应用于本文。关于是未分化的还是分化的细胞用于制备如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯，其可取决于所治疗疾病的具体需求，例如患病位置、施用方式、用于植入的所选组织等。适宜细胞的选择可以由本领域技术人员评估这些标准来进行。 此外，适用于制备如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯的细胞可以是永生化或非永生化细胞，优选永生化细胞。如果使用永生化细胞，这些细胞优选保持它们如上文讨论的对称和/或不对称细胞分化的能力。根据本发明，当细胞超过正常细胞(即非永生化细胞)的2倍生存期时，细胞被定义为永生的。正常二倍体细胞在体外的最大生存期会因细胞类型(例如胎儿对成人细胞)和培养条件而改变。因此，体外培养的正常细胞的最大生存期为大约60-80群体倍增数。例如，角质化细胞可以分化约80次，成纤维细胞在50 次以上，淋巴细胞约20次。正常骨髓基质细胞可具有30-40群体倍增数的最大生存期。优选地，用于制备根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯的细胞系可以连续生长超过350群体倍增数，并且可以仍然保留年幼细胞的正常生长速度特征。使用于制备如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯的细胞永生化的方法是本领域公知的，并且因此可在本文中使用(参见例如WO 03/010305或WO 98/66827，其通过引用并入本文)。一种示例性方法(根据WO 03/010305)包括例如下列的步骤a)根据本领域技术人员已知的标准常规细胞培养方法培养细胞，例如，干细胞，特别是得自人骨髓(例如(人)间充质干细胞(MSC，hMSC))的干细胞；b)用包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因或其变体的至少一个片断的逆转录病毒载体转导所述细胞培养物，其方式是bl)培养包装细胞系(例如PA317细胞、PG13细胞、Phenix等)，其中所述包装细胞系是其中产生逆转录病毒载体的细胞，b2)构建逆转录病毒载体(例如得自Moloney鼠白血病病毒等)，其中所述逆转录病毒载体包含人末端着丝粒复本(hTRT)基因或其变体的至少一个片断，更优选hTERT cDNA 片断，例如得自 pGRN145 (Geron Corporation)的 3452 碱基对 EcoRI 片断，b3)用所述逆转录病毒载体转染所述包装细胞系，b4)用所述转染的细胞转导所述包装细胞系，优选通过使细胞与逆转录病毒载体离心，b5)用步骤b4)的包装细胞转导根据以上步骤a)的培养细胞，所述细胞包含所述逆转录病毒载体。c)获得永生化细胞系，其中所述永生化细胞系与步骤a)的细胞相比具有基本上相同的特征和性质。结果，得自人端粒亚单位(hTRT)基因的插入的多核苷酸序列可以被转录并翻译以产生功能端粒酶。本领域技术人员理解，由于密码简并，许多多核苷酸序列将编码相同的端粒酶。此外，端粒酶变体被包含在内，其具有与野生型端粒酶序列基本相同的序列，并且保留了野生型端粒酶多肽(例如得自野生型端粒酶多肽中氨基酸的保守替换)的功能。包埋在根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞通常被工程化为编码和分泌或者自然地编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体。在本发明上下文中，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体可以选自显示神经保护和/或抗血管生成作用或者其它对于眼疾病而言的积极效果(例如抗细胞调亡作用)的本领域技术人员已知的任何蛋白质或肽。在这种情况下，术语“神经保护作用，，优选是指神经系统中的机理，其保护神经元避免例如本文定义的疾病所致的编程性细胞死亡或退化。因此，“神经保护因子”优选是一种化合物，更优选肽，其保护神经元免于编程性细胞死亡或退化，优选通过使用神经系统内的机理，更优选在本文定义的眼疾病的情况下。使用如本文定义的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体，优选如本文定义的神经保护因子的眼内药物治疗的神经保护方面，或者更准确地说细胞保护方面可以几乎对任何侵袭视网膜包括视神经(视网膜的延伸)、角膜内皮(在进行性角膜内皮营养障碍或其它病症的情况下)和前房角中的小梁网(例如升高的水体液外流阻力的位置，其导致眼内压升高并因此导致高压青光眼)的病症都有效果。这种细胞保护治疗法的目标在于防止或至少减缓眼功能所需的细胞的损失。所述治疗法的神经保护方面/作用对于糖尿病性视网膜病可能是特别重要的，因为糖尿病视网膜微血管病所致视网膜细胞损失是糖尿病性视网膜病眼的视觉性能降低的最重要原因。眼内细胞保护治疗法还可包括角膜内皮和毛细管周皮细胞，在试图为血液流注而保持这些毛细管开放，或者使它们重新开启以改善到视网膜组织的受损血液供应时，它们特别地受糖尿病病程影响。此外，术语“抗血管形成作用”优选是指抑制血管形成即新血管生长的机制。因此， “抗血管形成因子”优选是一种化合物，更优选肽，其抑制血管形成，例如新血管的生长，优选在本文定义的眼疾病的情况下。适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体可以直接被施用，通过如本文定义的载体编码，或者经由包埋在本文所述的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞来施用。如果如本文定义的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文所定义的其片段或变体经由包埋在本文所述的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞来施用，则包埋在(球形)微囊的(球形) 核芯中的细胞通常被转染，然后用编码此适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体的核酸序列制备(球形)核芯。这种转染能够使细胞表达并分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、 抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体。根据一个特别优选的实施方案，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体可选自本文定义的抗血管形成因子或者其片段或变体。优选地，所述抗血管形成因子是本文定义的内皮抑制素(Endostatin)或者其片段或变体。内皮抑制素是天然存在的胶原XVIII 的20-kDa C-末端分解产物。据报道其用作抗血管形成剂，类似于血管抑制素和血小板反应蛋白。内皮抑制素是一种广谱的血管形成抑制剂，并且可干扰生长因子例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF-2)和血管生长因子(VEGF)的前-血管形成作用。根据另一优选的实施方案，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体可选自本文定义的神经保护因子或者其片段或变体。优选地，所述神经保护因子可选自本文定义的 GLP-I肽或GLP-I-融合肽或者本文定义的其片段或变体。根据一个优选的实施方案，所述神经保护因子可选自GLP-I肽或者本文定义的其片段或变体。神经保护(并且优选抗细胞凋亡)因子GLP-I位于充分研究的胰高血糖素基因上，其编码前胰高血糖素原(参见例如White，J. W.等人.，1986NucleiCACid Res. 14(12)4719-4730)。前胰高血糖素原分子作为一种高分子量前体分子是在胰脏α细胞以及空肠和结肠L细胞中合成的。前胰高血糖素原是一种180氨基酸激素原并且其序列除了胰高血糖素外还含有相关结构的两个序列胰高血糖素样肽-I(GLP-I)和胰高血糖素样肽-2 (GLP-2)。在前胰高血糖素原分子中，在GLP-I和GLP-2之间是17氨基酸肽序列(或者更确切地说是15氨基酸序列加C-末端RR切割位点)，插入肽2 (ΙΡ2)。ΙΡ2序列(位于前体分子中的GLP-I和GLP-2之间)在体内在GLP-I的氨基酸37之后正常进行蛋白质水解裂解。根据细胞以及环境，前胰高血糖素原组件因此分裂成不同 的肽，包括GLP-I (1-37)，一种未加工形式的37氨基酸肽。通常，此过程发生在胰脏和肠中。GLP-I (1-37)序列可进一步被蛋白质水解处理成活性GLP-I (7-37)，31氨基酸处理形式或其变性产物GLP-I (7-36) 酰胺。因此，名称GLP-I (7-37)表示所讨论的片断，当从母体肽GLP-I的N-末端开始计算时，包含始于(并且包括)编号7至(并且包括)编号37的氨基酸残基。GLP-I (7-36)、 GLP-I (7-36)酰胺和GLP-I (7-37)的氨基酸序列在式I (SEQ ID NO 25)中给出His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-A Ia-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X (I)当X是NH2时其表示GLP-I (7-36)酰胺，或者当X不存在时其表示GLP-I (7-36)， 并且当X是Gly-OH时其表示GLP-I (7-37)。GLP-I是一种胃肠激素，并且是最有效的内源性促胰岛素剂，其作用包括刺激 β-细胞中的腺嘌呤核苷酸环化酶和蛋白质激酶活性。在生理学上，其与来自上消化道的胃抑制多肽一起发挥肠降血糖素激素降低血糖水平的作用。相应地，对摄食响应而分泌的 GLP-I具有多种作用，例如对共同起调节血糖作用的胃、肝、胰脏和脑。因此，胰高血糖素样肽GLP-I (7-36)酰胺及其非酰胺化类似物GLP-I (7-37)由于它们对碳水化合物代谢的有效作用以及其治疗糖尿病包括2型糖尿病的有效应用而产生相当大的兴趣。其它神经保护性质仅显示于冠心病的治疗中。根据本发明的一个实施方案，GLP-I肽因此可选自任何已知的GLP-I肽序列，例如如本文定义的。在这种情况下，GLP-I肽可由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞来分泌，所述细胞因此可优选在制备(球形)核芯之前用如本文定义的编码GLP-I肽的核酸序列来转染，使得这些细胞表达并分泌GLP-I肽。优选地，本文应用的可由包埋在(球形)微囊中的细胞编码和分泌的GLP-I肽可选自包含(wt) GLP-I的氨基酸7-35的肽以及与此肽具有至少80%、90%、95%或者甚至99%同一性的肽。通常，GLP-I肽可选自(i)包含 (wt)GLP-l的氨基酸1-37的肽，(ii)包含(wt)GLP-l的氨基酸7-35,36或37的肽，(iii) GLP-I (7-36)酰胺以及(iv)与任意这些肽包括修饰的肽具有至少80%、90%、95%或者甚至99%同一性的肽。在这种情况下，“修饰的GLP-I肽”将表示任何GLP-I变体或GLP-I片段，包括组合，例如变体的片段，其保留(wt)GLP-l的生物学功能。变体和片段归类为未修饰的GLP-I序列的修饰，例如GLP-I (7-35,36或37)。在本发明的含义中，任何变体或片段均具有功能，例如能够发挥与未修饰的(GLP-I)肽相同或相似的生物活性。术语“活性”是指(例如一种或多种生物活性包括受体结合、受体活化、GLP-I的已知的作用的发挥，例如其能够减少由局部缺血或氧缺乏引起的损伤以及与现有技术描述的GLP-I的作用有关的上文所述心脏组织的可能死亡的活性，其可以在与如本文定义的天然存在的GLP-I肽及其任何片段或变体相同的条件下相比。优选地，如本文定义的GLP-I的肽的变体或片段具有 GLP-I (7-35,36或37)的至少25%活性，更优选本文定义的GLP-I (7-35,36或37)的至少 50% (生物)活性，再更优选60、70、80或90% (生物)活性以及最优选至少95或99 % (生物)活性。生物活性可通过标准分析法测定，其优选例如使用用于2型糖尿病等的动物模型等来测定作为肠降血糖素激素降低血糖水平的活性。根据一个特别优选的实施方案，如本文定义的可以通过包埋在(球形)微囊的 (球形)核芯中的细胞来编码的GLP-I肽或GLP-融合肽肽在其N-末端不包括天然存在的本文定义的(天然的)GLP-I (1-37)序列的氨基酸1至6。再更优选地，如本文定义的该GLP-I 肽或者下文定义的GLP-融合肽在其N-末端不包括本文定义的天然GLP-I (1-37)序列的天然存在的氨基酸1、2、3、4、5和/或6。该条件优选是指如本文定义的GLP-I肽，例如选自包含GLP-I的氨基酸7-35、36或37的肽，GLP-I (7-36)酰胺以及与这些肽的任一个的同一性至少80%、90%、95%或者甚至99%的肽，包括修饰的肽和含有此GLP-I肽的融合GLP-I 融合肽。然而，该条件不排除如本文定义的GLP-I肽或者如本文定义的GLP-I融合肽包含 N-末端(或C-末端)序列修饰或与其融合的其它氨基酸或肽，例如信号肽序列和/或引导肽序列等，然而区别于wt GLP-I的氨基酸1至6的序列。在另一优选实施方案中，连接到其同系物的GLP-I (7-35,36或37)的N-末端的任何氨基酸与天然存在的GLP-I (7-35, 36或37)的6位的氨基酸不一致。根据另一优选的实施方案，(直接)连接到其同系物的 GLP-l(7-35、36或37)的N-末端的任意氨基酸与天然GLP-1，优选以其GLP-I的天然顺序， 与天然的GLP-I的天然存在的氨基酸6，天然存在的氨基酸5和6，天然存在的氨基酸4、5 和6，天然存在的氨基酸3、4、5和6，天然存在的氨基酸2、3、4、5和6，或者天然存在的氨基酸1、2、3、4、5和6不一致。根据一个特别优选的实施方案，连接到其同系物的GLP-I (7-35, 36或37)的N-末端的任何氨基酸与前胰高血糖素原的序列不一致。天然GLP-1，特别是GLP-I (7-36)，在体内经受短的半衰期，并因此限制了在一般的治疗性治疗中的应用，在此一般的治疗性治疗中要严格避免频繁施用，或者需要长期施用。GLP-I在血浆中通过DPP-IV(二肽基肽酶IV)在残基8和9之间在数分钟内迅速降解， 产生失活的NH2-末端截短代谢物GLP-I (9-36)。另外，天然GLP-I通常会经历肾脏排泄。这些因素产生了问题，因为对于此肽，GLP-I (7-36)或者NH2-末端截短代谢物GLP-I (9-36)， 在体内是活性部分，并且不论其生理效应是由天然GLP-I还是其片段发挥治疗应用。作为结果并且由于其在体内迅速降解，天然GLP-I或其片段可用作用于短期代谢对照的适宜工具，例如有可能用于急性眼疾病患者的加强监护病房。为了避免这种快速降解，已经进行了各种尝试来合成天然存在的GLP-I的稳定的 (对抗被DPP-IV降解)类似物(例如GLP-I (7-37))。特别地，第8残基，其在体内是Ala，被另一残基例如 Gly、Ser 或 Thr 替换(Burcelin, R.等人· (1999)Metabolism 48，252-258)。 GlyS或G8类似物已被广泛测试，二者作为合成的分子，以及通过基因工程化来分泌突变体多肽的细胞系来产生的(Burcelin, R.，等人.(1999)，Annals of the New York Academy of Sciences 875:277-285)。各种其它修饰已被引入到例如GLP-1 (7-37)中，以增强其体内稳定性而不会折损其生物活性。这种方法通过使GLP-I的稳定来对抗被DPP-IV降解，例如通过另外施用具有 GLP-I肽的DPP-IV抑制剂来防止半衰期短的问题发生。另外施用具有GLP-I肽的DPP-IV 抑制剂是复杂的，并且通常不会产生期望的长期治疗，因为DPP-IV抑制剂仅在体外系统中有效应用。此外，需要GLP-I的患者仍然要在长时间内，即与他或她罹患要治疗的疾病一样长的时间内，或者更严重的是在整个生命期内，接受一剂或多剂GLP-I或其类似物或变体。 这意味着，反复施用药物变成必需的。然而，施用到眼中可能是痛苦的并且会产生注射相关的眼内感染或者眼内结构的机械损伤的风险。此外，GLP-I在体内相对短的半衰期需要在短间隔内再施用药物。由于这是一种侵入性的过程，GLP-I的剂量应由医生来施用。它们不能由患者自己施用，因为损伤圆锥形晶状体(导致白内障)或视网膜(导致视网膜剥离) 的风险将是高得不可接受的。此外，药物的反复眼内施用还可能与对圆锥形晶状体和视网膜的医源性损伤的累积风险有关，并且经常反复施用时还与感染的累积风险有关。因此非常期待开发显著减少必要的反复施用的次数的操作方法和技术。因此，根据一个替代实施方案，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体可以是选自GLP-I融合肽或者本文定义的其片段或变体的神经保护因子。本文使用的GLP-I融合肽可以由包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌。在这种情况下，包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞通常在制备所述核芯之前用编码GLP-I融合肽的核酸序列转染，使得这些细胞编码、表达并分泌GLP-I融合肽。如本文定义的GLP-I融合肽具有至少两个组件，例如组件(I)和(II)，组件(I)和 (III)，或者组件(I)、(II)和(III)，显示出如本文定义的GLP-I的生物活性，并且同时，通常通过C-末端延伸赋予GLP-I融合肽的组件(I)稳定性。如本文定义的GLP-I融合肽的组件(I)通常含有如上文定义的GLP-I肽的序列，优选与SEQ ID NO=I具有至少80%，更优选至少85%并且再更优选至少90%序列同一性的序列。SEQ ID NO 1表示GLP-I (7_37) 的天然氨基酸序列(31个氨基酸长度)，其在哺乳动物中严格保守的。根据一个特别优选的实施方案，如本文定义的GLP-I融合肽的组件(I)含有与SEQ ID NO :1相同的序列，或者缺少SEQ ID NO 1的氨基酸36和/或37的序列。GLP-I融合肽的组件(II)，其可由包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞来编码和分泌，(或者更为普遍的包括融合肽的片段或变体的任何GLP-I肽)， 通常含有具有至少9个氨基酸的肽序列。GLP-I融合肽通常在其组件(II)中具有9至30， 优选9至20，最优选9至15个氨基酸的序列长度。一般而言，与较长的序列相比，组件(II) 中的较短的序列由于它们对GLP受体优良的结合活性而优选。组件(II)的序列，尽管不是必须的，可优选是中性的，或者可在PH7时具有负电荷。GLP-I融合肽的组件(II)还可在其序列中含有至少一个脯氨酸残基。脯氨酸残基是形成四聚体氨基酸序列的β-翻转内的共有氨基酸。因此，GLP-I融合肽的组件(II)可形成翻转样结构。翻转结构是一种典型的蛋白质或肽的二级结构组件。其通常通过四个氨基酸的伸展来形成，其使肽或蛋白质的主链方向的方向反向。如果存在于GLP-I融合肽中，则脯氨酸残基通常位于GLP-I融合肽的组件(II)中出现的四聚体翻转序列基序的2或3位，优选位于2位。GLP-I融合肽的组件(II)，其可通过包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形) 核芯中的细胞编码和分泌，(或者更为普遍地，包括融合肽的片段或变体的任何GLP-I肽) 可含有选自下列的序列基序VAIA、IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE, AADX, AXDX和XADX，其中X表示任何氨基酸(天然存在的或者修饰的非天然氨基酸)。这些四聚体基序可以位于组件(II)的序列中的任何地方。在一个特别优选的实施方案中，本发明融合肽组件(II)是通过选自AA、XA、AX、RR、RX和XR的其N-末端序列基序连接到组件⑴ 的C-末端的肽序列，其中X表示任何氨基酸(天然存在的或修饰的非天然氨基酸)。可通过包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的作为GLP-I融合肽的组件(II)特别优选的是含有相应于人或鼠IP-2的部分序列的序列 SEQ ID NO 48 =X1X1DFPX2X2X3X4的肽序列，其中各个X1通常相互独立地选自任何天然存在的氨基酸，优选精氨酸(R)或丙氨酸(A)，更优选丙氨酸(A)，或者可以不存在；其中各个&通常相互独立地选自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，并且其中各个X3和X4通常相互独立地选自任何天然存在的氨基酸，优选丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T) 或缬氨酸(V)。X4也可以不存在。可通过包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的作为GLP-I融合肽的组件(II)再更优选的是含有根据SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI)、SEQ ID NO :27(DFPEEVAI)、SEQ ID NO 28 (RDFPEEVA)或 SEQ ID NO :29 (RRDFPEEV)、SEQ ID NO: 30 (AADFPEEVAI)、SEQ ID NO 31 (ADFPEEVA)或 SEQ ID NO 32 (AADFPEEV)的序列的肽序列 (全部肽序列以单字母代码给出)，或者是与SEQ ID NO :22、27、28、29、30、31或32具有至少80%序列同一性的序列。SEQ ID N0:22是全长IP-2(插入肽2)序列的部分序列，其含有 15个氨基酸长的全长IP-2序列的10个N-末端氨基酸。IP-2是本文所用组件(II)的优选实例。相应地，本文定义的GLP-I融合肽的组件(II)中含有的其它更强烈优选的序列是 IP-2的更长的部分氨基酸序列，例如存在于人中的14个N-末端氨基酸序列(SEQ ID N0 23 (RRDFPEEVAIVEEL))或其鼠复本(SEQ ID NO :24 (RRDFPEEVAIAEEL))，或者序列(SEQ ID NO 33 (AADFPEEVAIVEEL))或(SEQ ID NO :34 (AADFPEEVAIAEEL))，或者与 SEQ ID NO :23、 24、33或34具有至少80%序列同一性的序列。作为包含在GLP-I融合肽的组件(II)中的元件最最优选的是具有天然存在的IP-2序列的全部15个氨基酸的全长IP-2序列(SEQ ID NO 2 (RRDFPEEVAIVEELG)，人，或者 SEQ ID NO 3 (RRDFPEEVAIAEELG)，鼠，或者 SEQ ID NO 35 (AADFPEEVAIVEELG)，或者 SEQ ID NO 36 (AADFPEEVAIAEELG))，或者与 SEQ ID NO :2、3、 35或36具有至少80%序列同一性的序列。在本发明范围内还有IP2的全部哺乳动物亚型 (哺乳动物中IP2的天然变体)。可以提供包括在组件(II)中的序列的一个以上的复本， 例如IP2的2个、3个或更多个复本或者IP2的片段或变体。相应地，通过包埋在本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽优选含有、包含或组成为序列SEQ ID NO 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAA KEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG)，即无任何连接子序列通过其C-末端连接到鼠IP2的 GLP-I (7-37)；或者序列 SEQ ID NO 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIV EELG)，即无任何连接子序列通过其C-末端连接到人IP2的GLP-I (7-37)；或者序列SEQ ID NO 37 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIAEELG),即无任何连接子序列通过其 C-末端连接到 IP2 的 GLP-I (7-37)；或者序列 SEQ ID NO 38 (HAEGTFTSDVSSYLEG QAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG)，即无任何连接子序列通过其C-末端连接到IP2的 GLP-I (7-37)；或者序列 SEQ ID NO 39 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAE ELG)，SEQ ID NO 40(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIAEELG), SEQ ID NO: 41(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG), SEQ ID NO. 42(HAEGTFTSDVSS YLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFP), SEQ ID NO 43 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEE VA), SEQ ID NO 44(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELGRRHAC), SEQ ID NO 45 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVEELG),SEQ ID NO 46(HAEGTFTSDV SSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG), SEQ ID NO 47 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWL VKGRGAADAAAAVAIVAALG)或者 SEQ ID NO 48 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEE VAIVEELGRRHAC)，即无任何连接子序列通过其C-末端连接到IP2序列的特定类似物或其变体的GLP-I (7-37)。与SEQ ID NO :8、12以及37至48具有至少80%序列同一性的其变体或片段同样可用于本文。本文中优选的GLPl-融合肽还包括序列SEQ ID N0:13、14、19和 20。不受任何理论的束缚，本发明的发明人断定，GLP-1(7_35、36或37)的不稳定性， 例如如果在体内通过包埋在植入的根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞分泌进入患者外围组织，原因在于其未保护的3-维结构。蛋白质酶可分解GLP-I (7-35、 36或37)肽并在体内迅速消除其生理活性。通过使肽序列连接到GLP-l(7-35、36或37)的 C-末端，其结构获得针对酶降解的稳定性。如果另外的C-末端肽序列(包含在根据本发明的融合肽的组件(II)中的)向后折叠，例如由于存在通过其一级结构并给组件(II)提供刚性而形成的翻转结构元件，则可以增加这种稳定性的获得。由于其优选包含翻转结构元件的C-末端肽延伸，发现如本文定义的GLP-I融合肽改善了对DPP-IV失活的抵抗力。所述C-末端肽在作用于其靶细胞中的受体之前不会从GLP-l(7-35、36或37)序列分解，或者其在体内经酶分解而形成GLP-I (7-35,36或37)。与在GLP-I受体的位置结合的 GLP-I肽的确切形式无关，如本文定义的GLP-I肽发挥其作为有效的神经保护化合物的功能。GLP-I肽序列被认为由于形成β-翻转元件的一级结构而适合于如本文定义的GLP-I 融合肽的组件(II)，所述GLP-I肽序列可容易地通过适当的例如分光光度法，例如圆二色谱法，或本领域技术人员已知的其它方法来识别。可通过包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的 GLP-I融合肽的组件(II)和组件(I)可以直接连接或者通过连接子序列连接。优选地，两组件相互直接连接。在它们通过连接子(或者间隔区)连接的情况下，所述连接子优选是肽连接子。所述肽连接子通常具有1-10个氨基酸，优选1-5，再更优选1-3个氨基酸的长度，在某些情况下所述连接子序列可能甚至更长，包含11-50个氨基酸。所述肽连接子可以由不同的(天然存在的)氨基酸序列组成。优选地，所述肽连接子将在连接的组件之间引入一些结构柔性。结构柔性是例如通过具有在连接子序列内含有不同的甘氨酸或脯氨酸残基，优选至少30%，更优选至少40%并且再更优选至少60%脯氨酸和甘氨酸残基的肽连接子来实现的。与特定序列无关，肽连接子可优选是免疫学上无活性的。可通过包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽可以另外含有组件(III)。通常，组件(III)包含至少四个氨基酸残基，优选至少10个另外的氨基酸残基，更优选至少20个或者最优选至少30个。就功能而言，组件(III)将进一步增强本文定义的GLP-I肽的稳定性。期望组件(III)不干扰GLP-I融合肽的生物学功能，其大约与GLP-I (7-37)的生物活性相当。通常而言，如本文定义的组件 (I)的任何C-末端延伸，不论它是如本文定义的组件(II)、组件(III)还是组件(II)和 (III)的组合，均会增强组件(I)的稳定性，所述组件(I)即如上文定义的GLP-I肽，例如 GLP-I (7-35,36或37)或本文定义的其片段或变体。优选地，如本文定义的GLP-I融合肽的组件(III)包含任意哺乳动物组织的GLP-2 的同种型的N-末端序列的至少4个，优选至少10个，更优选至少20个另外的氨基酸残基 (在哺乳动物中GLP-2的其它天然存在的变体)，例如显示于SEQ ID NO :4和5中的鼠或人同种型。GLP-2出现在胰高血糖素原中，并且还与碳水化合物代谢有关。在本发明的情况下， 术语“GLP-2肽”优选是指GLP-2 (1_33、34、或35)，而“修饰的GLP-2肽”将表示任何GLP-2 片段或变体，或者GLP-2(l-33、34或35)的片段或变体。变体或片段归类为未修饰的序列例如GLP-2(l-33、34或35)的变体。由于具有包括在组件(I)中的生物活性序列(GLP-1 肽)，组件(III)还可包含GLP-2的天然存在形式的变体或片段。另选地，组件(III)还可包含GLP-I (7-37)的(N-末端)序列的至少4个，优选至少10个，更优选至少20个另外的氨基酸残基，相应地包括全部哺乳动物同种型或者一如本文公开的一其全部功能片段或变体。通常而言，组件(III)可含有GLP-I肽或修饰的GLP-I肽的任何形式，其公开于本文中适用于GLP-I融合肽的组件(I)。在进一步备选方案中，组件(III)还可含有GLP-I (7-37) 和GLP-2的嵌合形式。嵌合形式可通过使GLP-I (7-37)和GLP-2 (或者片段或变体)相互偶联并且通过随后将作为组件(III)的嵌合形式引入到GLP-I融合肽中来制备。优选地， 嵌合形式由GLP-I (7-37)的部分序列和GLP-2的部分序列连接在一起组成。例如，嵌合形式可包括GLP-I的N-末端5-30氨基酸以及GLP-2的C-末端5_30氨基酸，或者相反， 例如GLP-I (7-37)的氨基酸7或8至22、23、24、25、26、27或28以及GLP-2的从位置15、 16、17、18、19、20、21、22、23或24到例如C-末端的氨基酸序列。如果分别地包含GLP-2或 GLP-I (7-37)的天然存在形式的修饰作为组件(III)，则组件(III)优选分别含有SEQ ID NO :1、4或5的序列，或者具有与SEQ ID NO :1、4或5的任一个至少80%序列同一性的序列。在另一实施方案中，可由包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽的组件(III)可含有多个序列，如上文针对组件(I)、(II) 或(III)所述的。例如组件(III)可含有GLP-I (7-37)和/或GLP-2的至少2个，优选2、 3或4个复本，或者与SEQ ID NO :1、4或5具有至少80%序列同一性的序列的至少2个复本。此外，组件(III)可含有如上文公开的GLP-I (7-37)或GLP-2的嵌合形式的一个以上的复本，例如与GLP-I (7-37)和/或GLP-2或者与至少80%序列同一性的其变体一起最终形成嵌合体形式的组合。由包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽还可包含2个或更多个，优选2个组件(III)，其例如可以(1)通过其N-末端连接到组件(I)或(II)的C-末端，和(2)通过其C-末端经连接子或直接地连接到组件⑴的N-末端。如果提供2个组件(III)，它们可以相同或不同。根据一个优选的实施方案，可由包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽可以包含以上组件(I)、(II)和(III)。含有全部这些组件的具体实施方案优选选自SEQ ID NO 6 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (鼠)-RR-GLP-I (7-37 )-C，在本文亦称为鼠 CMl)，SEQ ID NO :7(N-GLP-l(7-37)-IP2(鼠)-RR-GLP2-C，在本文亦称为鼠 CM2)，SEQ ID NO 10 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (人)-RR-GLP-I (7-37) -C,亦称为人 CMl)， 以及 SEQ ID NO 11 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (人)-RR-GLP-2-C)，在本文亦称为人 CM2)，或者与 SEQ ID NO :6、7、10或11或者其片段或变体具有至少80%序列同一性的序列。在前述序列中，术语“N”和“C”表示这些融合肽的N-和C-末端。全部的序列SEQ ID N0:6、7、10和11 在IP2(组件(II))的C-末端含有RR-连接子(2个精氨酸残基)，其还可另选被放弃。在根据SEQ ID N0:6、7、10或11的每一个实施方案中的组件(I)是GLP-I (7_37)，而(在连接到组件(II)的C-末端的这些实施方案中的每一个中的)组件(III)是GLP-I (7-37)或者GLP-2。在这种情况下优选的GLPl-融合肽可进一步包含序列SEQ ID NO :15、16、17、18 和26。在本发明另一优选的实施方案中，可由包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽除了组件(I)外还含有组件(III)(无本文定义的任何组件(II))，其连接到组件(I)的C-末端和/或组件(I)的N-末端。优选地， 组件(III)位于组件(I)的C-末端。与组件(III)是连接到组件(I)的N-末端(通过其 C-末端)还是连接到组件(I)的C-末端(通过其N-末端)无关，偶联可以是直接的或者间接地经由连接子序列连接。关于连接子序列，其是指用作连接GLP-I融合肽的组件(I) 和组件(II)的连接子的GLP-I融合肽的以上公开内容。在本发明的一个另外优选的实施方案中，可由包埋在如本文定义的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽除了组件(I)和(II)外还含有组件 (III)，其连接到组件(II)的C-末端和/或连接到组件(I)的N-末端。优选地，组件(III) 位于组件(II)的C-末端。与组件(III)是连接到组件(I)的N-末端(通过其C-末端) 还是连接到组件(II)的C-末端(通过其N-末端)无关，偶联可以是直接的者间接地经由连接子序列连接。关于连接子序列，其还是指用作连接GLP-I融合肽的组件(I)和组件
(II)的连接子的GLP-I融合肽的以上公开内容。可由包埋在根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I融合肽，除了融合蛋白质的组件的上述组合的任一种(即组件(I)和(II)，组件(I)和(III)或者组件(I)、(II)和(III))外，可进一步包括载体蛋白质，特别是转铁蛋白或白蛋白，作为组件(IV)。这样的组件(IV)可直接地或者使用本文定义的连接子连接到GLP-I融合蛋白质的组件的上述组合的任一种即组件⑴和/或(II)，组件⑴和/或
(III)或者组件⑴、(II)和/或(III)的N-和/或C-末端。在本发明的一个具体实施方案中，如本文定义的可通过包埋在本文所用(球形) 微囊(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I (融合)肽含有作为组件(I)和/或(III) 的修饰的GLP-I肽，其包括下式II的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Gl u-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36_Xaa37,其中Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys，而 Gly 是特别优选的；Xaal6 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys> Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys, Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或者酰胺或者不存在；Xaa37 是Gly、Ala、Glu、Pr0、LyS、酰胺或者是不存在，其中，如果在治疗如本文定义的眼疾病时，如本文定义的GLP-I (融合)肽通过包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的细胞编码和分泌以施用于有需要的患者，则优选选择这些氨基酸，或者其中Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基_组氨酸、2-氨基-组氨酸、3-羟基-组氨酸、高组氨酸、N-乙酰基-组氨酸、 α -氟甲基_组氨酸、α -甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4_吡啶基丙氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile、LyS、Aib、(1_ 氨基环丙基)羧酸、(1_ 氨基环丁基) 羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(ι-氨基环辛基)羧酸，而Gly是特别优选的；Xaal6是Val或Leu ；Xaal8是Ser,Lys或Arg ；Xaal9是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly、Glu 或 Aib ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ； Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys> Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly 或 Aib ；Xaa36 是 Arg、 Gly或Lys或者酰胺或者不存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或者是不存在，其中如果如本文定义的GLP-I (融合)肽在治疗如本文定义的眼疾病时是直接提供给有需要的患者，则优选选择这些氨基酸。在本发明的再另一个具体的实施方案中，如本文定义的且如通过包埋在本文所用 (球形)微囊(球形)核芯中的细胞编码和分泌的GLP-I (融合)肽的组件(I)和/或(III) 含有包括下式III的氨基酸序列的修饰的GLP-I肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22 -Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys, ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或者是不存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在，其中，如果在治疗如本文定义的眼疾病时，如本文定义的GLP-I (融合)肽通过包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的细胞编码和分泌以施用于有需要的患者，则优选选择这些氨基酸，或者其中Xaa7是 L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、-羟基-组氨酸、高组氨酸、N-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、LyS、Aib、(1_氨基环丙基)羧酸、 (1-氨基环丁基)羧酸、(ι-氨基环戊基)羧酸、(ι-氨基环己基)羧酸、(ι-氨基环庚基) 羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；Xaal8是Ser、Lys或Arg ；Xaa22是Gly、Glu或Aib ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys> Glu或Arg ；Xaa35是Gly或Aib ；Xaa36是Arg或Lys、酰胺或者是不存在；Xaa37是Gly、 Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在，其中，如果在治疗如本文定义的眼疾病时，如本文定义的GLP-I (融合)肽直接提供给有需要的患者，则优选选择这些氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，使用GLP-I (融合)肽，其可以通过包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的细胞编码和分泌，其中组件(I)和/或(III)含有修饰的(修饰的)GLP-I 肽，其选自 GLP-I (7-35)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37) 或其变体、类似物或衍生物。还优选的是在其组件(I)和/或(III)中包含修饰的GLP-I肽的GLP-I (融合)肽，所述修饰的GLP-I肽在8位具有Aib残基，或者在所述GLP-I肽的7位具有氨基酸残基，在治疗如本文定义的眼疾病时，如果如本文定义的GLP-I (融合)肽直接提供给有需要的患者，则所述氨基酸残基优选选自D-组氨酸、脱氨基_组氨酸、2-氨基-组氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸、N-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。在另一特别优选的实施方案中，使用GLP-I (融合)肽，其可以通过包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的细胞编码和分泌，其中如本文由式II和III定义的 GLP-I (融合)肽的组件⑴和/或(III)的两个实施方案可以与对于GLP-I (融合)肽的以上给出的公开内容组合。换言之，通式II和III可以例如与对于组件(II)、连接子、制备方法等的以上给出的公开内容组合。如本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，优选如上文定义的GLP-I融合肽的组件(I)，以及它们的片段和变体优选被保护以对抗上文所述的蛋白质水解分解，更优选对抗 DPP-IV。相应地，如本文定义的这样的GLP-I肽或GLP-I融合肽以及它们的片段和变体，特别是GLP-I融合肽，可含有抗DPP-IV的GLP-I的序列，例如GLP-1 (7-35,36或37)(在GLP-1 融合肽作为组件⑴和/或(III)的一部分的情况下)。在这种情况下，肽对二肽基氨基肽酶IV的降解的抗性可以例如通过以下降解分析法来测定在合适缓冲液中在ρΗ 7-8(缓冲剂，不是白蛋白)下使多份的肽在37°C下与一份纯化二肽基氨基肽酶IV培养4-22小时。通过添加三氟乙酸终止酶反应，再使肽降解产物分离并使用HPLC或LC-MS分析来定量。进行此分析的一种方法是将混合物施加到Zorbax300SB-C18 (30nm孔，5 μ m颗粒)150 X 2. Imm 柱中，并以0. 5ml/min流量洗脱，使用乙腈在0. 三氟乙酸中的线性梯度(0% -100%乙腈，经30min)。肽和其降解产物可以通过它们在214nm(肽链)或280nm(芳族氨基酸)的吸收来监测，并通过它们的峰面积的积分来定量。降解模式可通过使用LC-MS来测定，其中可以测定分离峰的MS谱。在给定时间处完整/降解化合物百分数用于评估肽DPP-IV稳定性。在上文中，当在给定时间基于完整化合物百分数其比GLP-I (7-37)的未修饰肽序列稳定10倍时，如本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽，优选如上文定义的GLP-I融合肽的组件(I)及其片段和/或变体被定义为DPP-IV稳定的。因此，DPP-IV稳定的GLP-I肽或GLP-I融合肽，优选如上文定义的GLP-I融合肽的组件(I)，优选比例如GLP-I (7-37)稳定至少10倍，更优选至少20倍。可通过本领域技术人员已知的任何方法来评价稳定性，例如将DPP-IV添加到待测肽溶液中并通过测定肽的例如经历一段时间的降解(参见上文)， 通过例如分光法、蛋白质印迹分析法和抗体筛选法等测定。并行地，GLP-I肽或GLP-I融合肽，优选如上文定义的GLP-I融合肽的组件⑴及其片段和/或变体被定义为一种化合物，其通过例如与其天然受体(GLP-1受体)结合而发挥GLP-I (7-37)的效用。优选地，如本文定义的GLP-I (融合)肽或GLP-I融合肽及其片段和/或变体具有与GLP-I受体的结合亲和力，其相当于天然存在的GLP-I肽的结合亲和力的至少10%，优选至少50%。结合亲和力可通过任何合适的方法测定，例如表面等离子体共振等。此外，优选的是如本文定义的GLP-I (融合)肽或GLP-I融合肽及其片段和/或变
26体通过其与它的向细胞传递信号的细胞外受体结合而引起细胞内cAMP的形成。根据另一优选的实施方案，如本文定义的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，或者GLP-I融合肽的单一组件，特别是组件(I)、(II)和(III)和/或如上文所述的整个GLP-I融合肽可选自这些肽或蛋白质序列的修饰的形式。各种修饰的形式，特别是上文所述整个GLP-I融合肽的修饰的形式，可以通过包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的细胞编码和分泌，或者可以直接用于眼疾病的治疗。这些修饰的形式公开于下文，并且更详细地描述，并且包含例如适用于(眼内)治疗眼疾病的以上神经保护因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白质或蛋白质样物质或者GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)和(III)和/或上文所述整个GLP-I融合肽的片段、变体等。在这种情况下，这些肽或蛋白质的片段和/或变体可以与其天然肽或蛋白质在天然的、非-修饰的氨基酸序列的整个长度上具有至少40 %、50 %、 60%,70%,80%,优选至少90%，更优选至少95%以及最优选至少99%的序列同一性。这同样可以适用于各自的(编码的)核酸序列。如本文定义的术语“序列同一性“通常是指序列比较如下。为了确定两个氨基酸序列的同一性百分数，可以将所述序列为最佳比较的目的而对齐(例如可以在第一氨基酸序列的序列中引入空位)。然后可以比较在相应氨基酸位置处的氨基酸。当在第一序列中的一个位置被与第二序列中相应位置处的相同氨基酸占据时，则所述分子在此位置相同。 两个序列之间的同一性百分数是由两个序列共享的相同位置的数量的函数，例如当提及特定的肽与确定长度的参比多肽具有特定的同一性百分数时，所述同一性百分数是相对于所述参比肽的。因此，与100个氨基酸长的参比多肽相同50%的肽可以是一个50个氨基酸多肽，其与参比多肽的50个氨基酸长的部分完全相同。其还可以是100个氨基酸长度的多肽，在它的整个长度上与参比多肽有50%相同。当然，其它多肽将符合相同标准。两个序列的同一性百分数的这种确定可使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的、非限制性的实例是Karlin等人(1993)，PNAS USA，90 :5873_5877的算法。将这种算法引入NBLAST程序，所述程序可用于识别与本发明的氨基酸序列具有期望同一性的序列。为了获得比较目的的空位比对，可以使用如Altschul等人(1997)，Nucleic Acids Res, 25 3389-3402中所述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的缺省参数(例如，NBLAST)。所述序列可进一步使用Genetic Computing Group's GAP (总体对齐程序)的第9版本，使用缺省(BL0SUM62)矩阵(值_4至+11)进行比对，其中空位打开罚分为-12 (对于空位的第一零值)而空格延伸罚分为_4(在空位中每一另外的连续零值)。对齐之后，通过将匹配的数表示为所要求保护的序列中的氨基酸数的百分数来计算同一性百分数。两个氨基酸序列的同一性百分数的所述测定方法可以相应地适用于核酸序列。在本发明的情况下，适用于(眼内)治疗眼疾病的抗血管形成因子、神经保护因子、任何其它蛋白质或蛋白质样物质的“片段”，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、 (II)或(III)等的片段，和/或上文所述整个GLP-I融合肽的片段通常是指这些肽或蛋白质的任一片段。通常，这样的片段包括一个短肽，其保留了期望的生物活性，特别是天然肽或蛋白质的期望的生物活性，例如如本文定义的抗血管形成因子、神经保护因子、其它蛋白质或蛋白质样物质的期望的生物活性，单个组件(I)、(II)或(III)等的期望的生物活性，和/或上文所述整个GLP-I融合肽的期望的生物活性，就其氨基酸序列(或其编码的核酸序列)而言，与天然肽或蛋白质的氨基酸序列(或其编码的核酸序列)相比所述片段是在 N-末端、C-末端和/或序列内截短的。这种截短可因此发生于氨基酸水平或者相应地发生于核酸水平上。对于例如适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/ 或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体，生物功能性片段可以容易地通过从肽分子的任一端除去氨基酸(在肽或氨基酸水平上)并针对如本文定义的其生物学性质测试所得肽或蛋白质来鉴别。可替代地，用于一次从天然肽或蛋白质的N-末端和/或C-末端除去一个或多个氨基酸的蛋白酶可以用于确定保留期望的生物活性的片段。最后，片段可能是由于在肽末端处的氨基酸和/或位于肽序列内的氨基酸的剔除。此外，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子任何其它蛋白质或蛋白质样物质的“变体”，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等的变体，和/或上文所述整个GLP-I融合肽的变体优选包含蛋白序列或其编码核酸序列(或其片段)，其中天然蛋白质或肽序列的氨基酸被交换。从而，可以产生适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质(的变体)， GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等(的变体)，和/或上文所述整个GLP-I融合肽(的变体)，其具有与在一种或多种突变体中的天然蛋白质或肽序列不同的氨基酸序列，所述突变体例如一种或多种取代的、插入的和/或剔除的氨基酸。优选地，与适用于(眼内)治疗眼疾病的全长的天然神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等，和/或上文所述整个GLP-I融合肽相比，这些变体具有大致相同或改善的生物活性。如本文定义的这种变体可以通过编码所合成的变体的DNA序列中的突变来制备。剔除、插入和取代的任意组合也可包含于适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的变体，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III) 等的变体，和/或上文所述整个GLP-I融合肽的变体中，条件是最终获得的变体具有期望的生物活性。显然，在编码变体肽的DNA中制备的突变体必须不改变读码框并且优选不会产生可产生二级mRNA结构的互补区域。相应地，与适用于(眼内)治疗眼疾病的天然的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III) 等，和/或上文所述整个GLP-I融合肽相比，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子的变体、抗血管形成因子的变体或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的变体，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等的变体，和/或上文所述整个GLP-I融合肽的变体，也可以含有侧面连接氨基酸序列的N-/或C-末端或者甚至两个末端的另外的氨基酸残基。例如，这样的变体可包含含有侧面连接GLP-I肽或GLP-I融合肽的氨基酸序列的N-/ 或C-末端或者甚至两个末端的另外的氨基酸残基的如本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽。只要得到的GLP-I肽或GLP-I融合肽保留它对于蛋白酶的耐受性或稳定性以及其发挥如本文定义的能力，人们就可以通过常规实验法确定任何此类侧面连接残基是否影响核芯肽的基本性质，例如通过其对于GLP-I已知的有益效果。术语“基本组成为”，当指如本文定义的具体的GLP-I肽时，是指可以存在不影响具体GLP-I肽的基本性质的另外的侧面连接残基。这一术语通常不理解为在该具体序列中的取代、缺失或添加。
适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的“变体”，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等的 “变体”，和/或上文所述整个GLP-I融合肽的“变体”，还可以指与其天然序列相比包含保守氨基酸取代的分子。来源于相同类型的氨基酸相互交换的取代称为保守取代。特别地，这些是具有脂肪族侧链、带正电荷或负荷的侧链、在侧链中为芳香基团的氨基酸，或者是其侧链可以进入氢桥的氨基酸例如具有羟基功能的侧链的氨基酸。这意味着，例如具有极性侧链的氨基酸被另一具有类似极性侧链的氨基酸取代，或者例如，特征为疏水侧链的氨基酸被另一具有类似疏水侧链的氨基酸取代。插入和取代是可能的，特别是在对三维结构不引起修饰或者不会影响结合区域的那些序列位置。通过插入或缺失对三维结构修饰可以容易地例如使用 CD 谱(圆二色谱)来确定(Urry，1985，Absorption，Circular Dichroism and ORD of Polypeptides,在 Modern Physical Methods in Biochemistry 中，Neuberger 等人·(编)，Elsevier, Amsterdam)。适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的变体，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等的变体， 和/或上文所述整个GLP-I融合肽的变体，因此还可以指基本上与适用于(眼内)治疗眼疾病的整个神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等，和/或上文所述整个GLP-I融合肽或其片段相似的分子。此类变体肽可以使用本领域公知的方法方便地制备。当然，这样的变体具有适用于(眼内)治疗眼疾病的天然抗血管形成因子、神经保护因子、其它蛋白质或蛋白质样物质，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等，和/或上文所述整个 GLP-I融合肽所已知的类似的有益作用。所述有益作用是，例如对于GLP-1，象相应天然存在的GLP-I肽那样，其大幅度减小由局部缺血或缺氧引起的损伤以及心脏组织的可能死亡的活性。可以包含于适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的变体，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或 (III)等的变体，和/或上文所述整个GLP-I融合肽的变体中的保守氨基酸取代的类型，可以基于不同种属的同源蛋白质/肽之间的氨基酸变化的频率分析。基于这样的分析，保守取代可以在本文中定义为在以下5组之一内的交换I.小的、脂肪族的、非极性的或弱极性的残基:Ala, Ser, Thr，Pro, Gly ；II.极性的、带负电荷的残基及其酰胺Asp，Asn, Glu, Gln ；III.极性的、带正电荷的残基His，Arg，Lys ；IV.大的、脂肪族的非极性残基:Met, Leu, lie, Val, Cys ；V.大的芳香族残基:Phe, Try, Trp0在前述组内，以下取代基被认为是“高度保守的”:Asp/Glu、His/Arg/Lys, Phe/ Tyr/Ti^Met/Leu/Ile/Val。半-保守取代定义为在以上组(I)-(IV)的两个之间交换，它们限于包含以上(I)、(II)和(III)的超级组(A)，或者限于包含以上(IV)和(V)的超级组(B)。取代不限于遗传编码的或者甚至天然存在的氨基酸。在上述含义中同源氨基酸残基的优选组的优选的保守氨基酸取代特别地包括，但不限于體酸
隨残
Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met
Ser,Thr,Gly,Asn
Arg, Gin, Lys, Glu, His
He, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Gly, Ala5(Thr), Pro
Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Gly, Thr5Pro, Ala
Met, Tyr, Phe, He, Leu, Val
Ala, (Thr), Pro, Ser, Gly
Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie
Trp, Met, T^r, He, Val, Leu, Phe
Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr
Ser, Thr, Cys
Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Glu, Lys, Asn, His, (Thr), Arg, Gln
Gin, Asp, Ser, Asn
Glu, Gin, His, Arg, Lys
Glu, Asn, Asp
Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, GIu
Phe, He, Val, Leu, Met
TrpTrp 此外，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的变体，GLP-I融合肽的单一组件特别是组件(I)、(II)或(III)等的变体，和/或上文所述整个GLP-I融合肽的变体，还可含有氨基酸取代，例如意图是改善溶解度(用亲水氨基酸取代疏水氨基酸)。在一个特别优选的实施方案中，可由如本文定义的包埋在(球形)微囊的(球形) 核芯中的细胞编码和分泌的如本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽包括GLP-I肽(出现在 GLP-I融合肽的组件⑴和/或(III)中)，所述GLP-I肽的特征为在GLP-I肽的位置7、8、 11、12、16、22、23、24、25、27、30、33、34、35、36或37有一个或多个取代。例如，对于以下名称，[Arg34-GLP-1 (7-37)]表示其中在34位天然存在的赖氨酸被精氨酸取代的GLP-I类似物。具体地，如本文定义的GLP-I肽或者GLP-I融合肽的组件⑴和/或(III) 与 GLP-I (7-35、36、37 或 38)的变体相应，包括例如 Thrl6-Lysl8-GLP_1 (7-37)， 以及 Lysl8-GLP-1(7-37)、Arg34_GLP_l(7-37)、Lys38-Arg26-GLP_1(7-38) -OH、 Lys36-Arg26-GLP-1 (7-36) , Arg26，34-Lys38-GLP-1(7_38)、Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、Arg26, 34-Lys38-GLP_l (7-38)、Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、 Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38)、Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38)、 Arg34-Lys38-GLP-1 (7-38)、Ala37-Lys38-GLP_1 (7-38)和 Lys37_GLP_l (7-37)。更一般来讲，本文所述的任何GLP-I变体(特别是根据式II或III)可以通过在38位添加Lys残基而被修饰。如果如上文所述的GLP-I肽或GLP-I融合肽在眼疾病的治疗中直接施，则如本文定义的的GLP-I肽或者GLP-I融合肽的组件(I)和/或(III)可另外与GLP-I (7_35，36，37 或 38)的变体包括 Gln9-GLP-1 (7-37)、D-Gln9-GLP_1 (7-37)、乙酰基-Lys9-GLP_1 (7-37)相应。在本发明的一个特别优选的实施方案中，如本文定义的GLP-I肽或GLP-I融合肽(就组件⑴或(III)而言)是/含有(修饰的)GLP-I肽，其选自GLP-I (7-35)、 GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37)或者其片段或变体。适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或变体，在由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的情况下，可以为体外对照目的而从表达它的细胞中(并因此从微囊中)分离，例如使用常规分离技术。因此细胞可以在适宜的条件下例如包括载体和营养物，在体外生长，分泌的蛋白质，即适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，和/或如上文所述的GLP-I 融合肽或者其片段或变体，在由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的情况下，从细胞外培养基中回收。用于转染到细胞中的基因工程化的(载体)序列因此优选包括信号(肽)序列(参见下文)，其允许如本文定义的神经保护因子或抗血管形成因子的分泌(参见下文)。在这种情况下，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或变体，在由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的情况下，可以自然地内源性地与信号序列融合，或者可以通过基因工程方法在引入到细胞中的编码核酸序列转染之后与信号序列融合。在一种替代方案中，编码这些肽的基因工程化的基因序列不
31包括此类信号肽序列，从而细胞内表达的肽通常将不会被分泌，并且可以通过涉及细胞溶解的过程从细胞中回收。在此类方法中，编码的序列可包括纯化标签，其能够从培养基中有效提取产物肽；标签可以被分解以释放分离的本文定义的神经保护或抗血管形成因子。然而，这一替代方案通常与根据本发明使用的(球形)微囊的细胞无关，所述细胞被植入到患者中并需要体内将表达和分泌的如本文定义的神经保护或抗血管形成因子递送至周围组织中。根据一个优选的实施方案，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或变体，在由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的情况下，可以由载体编码，其中此载体通常是适用于此目的的载体。更优选地，如果此载体序列例如在降解时从细胞中被释放，则此载体不是病毒载体，优选不是腺病毒载体，以避免任何由于病毒序列所致的副作用。如果未另外说明，任何上述实施方案和特征可相互组合。如上文所述的，适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质，和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或变体，可通过包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌。根据一个进一步特别优选的实施方案，包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞可以被进一步修饰或基因工程化为另外分泌选自抗细胞凋亡因子、生长因子、VEGF和促红细胞生成素(EPO)、抗血小板因子、抗凝血因子、抗凝血药、抗血管形成因子或任何其它因子的因子，例如适用于(眼内) 治疗眼疾病的蛋白质或蛋白样物质，例如多肽如睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质衍生的神经营养因子(⑶NF)、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、NT3、营养素(nurturin)、成纤维细胞生长因子(FGF)、ATF、凝血酶敏感素的片段、其变体等，例如FGF 类,例如酸性 FGF (aFGF)、碱性 FGF (bFGF)、FGF-I 和 FGF-2。根据一个具体的实施方案，编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的或者如本文定义的其片段或变体的包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞可以被基因工程化为另外分泌促红细胞生成素(EPO)。促红细胞生成素(也称为ΕΡ0、红细胞生成素(印oetin)或普罗克里特 (procrit))是一种以多种形式出现的大约34，000道尔顿分子量的酸性糖蛋白激素，包括 α、β、ω等。促红细胞生成素刺激红血细胞生成。其产生于肾中并刺激在骨髓和其它地方中的定型的红细胞前体的分裂和分化。通常，当身体在健康状态下，促红细胞生成素以非常低的浓度存在于血浆中，其中组织从存在数量的红细胞中接受充足的氧合作用。这种正常的低浓度足以刺激通过老化而正常丧失的红血细胞的置换。当循环中血细胞的氧运输减少时，循环中的促红细胞生成素的量在例如缺氧的条件下增加。缺氧可以由通过出血而大量失血、红细胞过量接触辐射而破坏、因高海拔或长时间意识不清导致氧摄取减少、或者各种形式的贫血或局部缺血而引起。在应对组织经历缺氧负荷时，促红细胞生成素会通过刺激骨髓中原始前体细胞转变成前成红细胞而增加红血细胞产生，所述前成红细胞接着发育成熟，合成血红蛋白并以红血细胞的形式释放到循环中。当循环中的红血细胞数大于正常组织氧需求的需要时，循环中的促红细胞生成素降低。促红细胞生成素可通过包埋在(球形)微囊中的细胞以一定浓度和一定持续时间表达(或者可以被提供)，所述浓度或持续时间不会诱发红血细胞形成或者另外地，增加受试者中的血细胞比容，例如在约IpM至低于1000 μ M之间，包括低于900 μ Μ、低于700 μ Μ、低于500 μ Μ、低于300 μ Μ、低于100 μ M或低于50μΜ。在其它实施方案中，促红细胞生成素是以受试者体重的函数施用。促红细胞生成素通常以约lU/kg至10，000U/kg受试者体重的浓度提供，包括低于7，500U/kg、5，000U/kg、 2500U/kg、1000U/kg、750U/kg、500U/kg、250Ug/kg、100Ug/kg、50U/kg、2OT/kg、10U/kg、5U/ kg或lU/kg。在这种情况下，促红细胞生成素血清浓度正常地在5-50mU/ml的范围内。对于罹患如本文定义的眼疾病或病症的患者，优选罹患如本文定义的视网膜病或与其相关的其它病情的患者，促红细胞生成素优选地以50-100U/kg的浓度提供，这取决于症状、体重、 性别、动物种类等。通常假定优选维持血浓度在约l-100mU/ml间的治疗选项。根据另外一个具体实施方案，编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体的包埋在(球形)微囊的核芯中的细胞可以被基因工程化为另外分泌VEGF。根据另一具体实施方案，编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、 抗血管形成因子、任何其它蛋白质或蛋白质样物质和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者如本文定义的其片段或变体的包埋在(球形)微囊的核芯中的细胞可以被基因工程化为另外分泌抗细胞凋亡因子。此类因子可包括但不限于APC(具有半胱天冬酶募集域的细胞凋亡抑制剂)、Bcl-2、Bcl-xL、Che-l/AATF、丛生蛋白、胰岛素、Mcl-l、NF-kB-依赖性抗细胞凋亡因子、血清素、生存素等。此外，作为针对本领域已知的细胞凋亡因子的抑制因子并因此被认为是抗细胞凋亡因子的任何因子因此被包括在内。此类因子优选被核酸编码并通过编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子、任何其它蛋白质或蛋白质样物质和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或变体的细胞分泌。在这种情况下，这种抗细胞凋亡因子可以直接针对下列细胞凋亡因子或细胞凋亡相关蛋白质的至少一个，包括 AIF，Apaf 例如 Apaf-I、Apaf-2、Apaf-3，oderAP0-2 (L)，AP0-3 (L)，凋亡酶，Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-xs,bik, CAD,钙蛋白酶，半胱天冬酶例如半胱天冬酶_1，半胱天冬酶_2，半胱天冬酶_3，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-7，半胱天冬酶_8，半胱天冬酶_9，半胱天冬酶-10，半胱天冬酶-11，ced-3，ced-9, c-Jun, c-Myc, crm Α,细胞红素 C，CdRl，DcRl，DD, DED, DISC, DNA-PKcs, DR3, DR4, DR5, FADD/M0RT-1，FAK, Fas (Fas-配体 CD95/fas (受体))，FLICE/MACH, FLIP,胞衬蛋白，fos, G-肌动蛋白，Gas-2, 凝胶溶素,粒酶 A/B，I CAD, ICE, JNK，核纤层蛋白 A/B，MAP, MCL-I, Mdm-2, MEKK-I, M0RT-1, NEDD, NF-KB, NuMa, p53，PAK-2，PARP，穿孔蛋白，PITSLRE, PKC δ，pRb，早老素，prICE，RAIDD, Ras, RIP，鞘磷脂酶，来自单纯性疱疹的胸腺嘧啶核苷激酶(thymidinkinase), TRADD, TRAF2, TRAIL-Rl, TRAIL-R2, TRAIL-R3，转谷氨酰胺酶等。包埋在根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞，其编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或者如本文定义的GLP-I融合肽， 可以进一步编码和分泌另外的因子，例如本文定义的抗细胞凋亡剂VEGF等。为了这些目的，如本文定义的神经保护因子或抗血管形成因子或其片段或变体以及其它任选的因子由至少一个核酸序列编码，所述核酸序列通常在制备(球形)微囊的(球形)核芯之前转染到细胞中。这些核酸序列可以天然地存在于细胞中或者可以通过细胞转染技术在制备(球形)微囊之前引入细胞中。根据本发明，可以使用任何合适的核酸序列。
根据一个实施方案，编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体如内皮抑制素、GLP-I肽或者如本文定义的GLP-I融合肽以及如本文定义的任选的另外的因子如抗细胞凋亡剂、VEGF 等的核酸序列可选自任何核酸，更优选选自适合于编码(至少一种)肽或蛋白质的任何核酸，即编码核酸，例如编码DNA，例如选自基因组DNA、cDNA、DNA寡核苷酸，或者编码RNA，例如选自(短)RNA寡核苷酸、信使RNA (mRNA)等。在本发明的情况下，mRNA通常是一种RNA， 其由若干结构元件组成，例如任选的5’ -UTR区域，位于编码区之前的上游位置的核糖体结合位点，任选的3’-UTR区域，其可在是聚-A尾(和/或聚-C-尾)之前。mRNA可以以单-、 二-或者甚至多顺反子RNA的形式出现，即携带一种、两种或多种如上文所述的蛋白质或肽的编码序列的RNA。二 -或者甚至多顺反子mRNA形式的这种编码序列可以通过至少一个 IRES序列来分离。所述至少一个核酸序列还可以是核糖体RNA (rRNA)、转移RNA (tRNA)或病毒RNA(vRNA)。此外，所述至少一个核酸序列可以是环状或线性核酸，优选线性核酸。此外， 所述至少一个核酸序列可以是单链或双链核酸序列(由于两个单链核酸的非共价连接，其也可以视为是上述含义范围内的核酸)或者部分双链或部分单链核酸，其至少部分地自我互补(这些部分双链或部分单链核酸两者通常由较长的和较短的单链核酸形成，或者由两个长度大约相等的单链核酸形成，其中一个单链核酸与另一单链核酸部分互补，并且二者因此在此区域形成双链核酸，即部分双链或部分单链核酸)。由于遗传密码的简并，多个核酸序列可编码适用于(眼内)治疗眼疾病的这种神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或者如本文定义的GLP-I融合肽以及本文定义的任选的另外的因子例如抗细胞凋亡剂、VEGF等。根据本发明的一个优选的实施方案，如本文定义的用于转染细胞的核酸序列可包含如上文定义的任何核酸序列，优选如本文定义的适用于转染细胞的核酸序列，其可编码(a)适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和 /或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素或GLP-I肽，特别是整个GLP-I氨基酸序列(GLP-1 (1-37)或者功能性GLP-I (7-35,36或37)(变体)序列或者任何其它GLP-I肽，包括如本文定义的GLP-I融合肽，编码(b)任选根据(a)的GLP-I序列的N-末端处的蛋白质酶分解序列，以及任选编码(b)上游区的信号肽序列，以及(c)任选编码如上文所述的其它因子。优选地，该信号(肽)序列是选自下文定义的序列。相应地，所得到的氨基酸序列可由信号肽序列、任选的蛋白质酶分解序列以及生物学有效的因子，即适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体，例如内皮抑制素、GLP-I肽或本文定义的GLP-I融合肽 (和任选的本文定义的其它因子，例如抗细胞凋亡剂、VEGF等)(从N-至C-末端)组成。 从而，信号肽序列和蛋白质酶分解序列优选地是与宿主细胞(中天然存在的序列)是异源性的，并且在GLP-I (5-37,6-37或7_37)及其如上文定义的变体的情况下优选不同于以上条件的定义范围内的天然GLP-I的氨基酸1至6。如本文定义的核酸序列可以包含在载体中。相应地，包埋在根据本发明使用的 (球形)微囊的(球形)核芯中的细胞可以含有包含如本文之前定义的核酸的载体。此载体可用于转染如本文定义的细胞以制备根据本发明使用的(球形)微囊。通常，此载体，特别是表达载体含有至少一个如本文定义的核酸序列，编码元件(a)和任选的如上文所述的(b)和/或(C)，并且必要时，本文所述的另外的元件，例如适用于直接表达编码元件(a)和任选的如上文所述的(b)和/或(c)以及任选的编码其它因子例如抗细胞凋亡因子、VEGF 等的元件。本文使用的一类载体利用DNA元件，所述DNA元件提供得自动物病毒(例如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或SV40等)的自主复制的染色体外质粒。本文使用的第二类载体依赖于使期望的基因序列整合到宿主细胞染色体中。适合于在将细胞包埋在根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯之前转染细胞的此类载体通常通过将至少一个核酸序列编码元件(a)和任选的如上文所述的(b) 和/或(c)例如适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽以及任选的如本文定义的其它因子插入到适宜的(空)载体中来制备。这样的适合的(空)载体是本领域技术人员已知的，并且综述于例如“Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P. H.等人· Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN O 444 904018)中。适合的(空)载体还将包括本领域技术人员已知的任何载体，例如质粒， 噬菌体，病毒例如SV40、CMV、杆状病毒(Baculo virus)、腺病毒(Adeno virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、转位子、IS-元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线状或环状DNA。为了整合到哺乳动物细胞中，通常使用线状DNA。优选地，用于本发明的载体类型与具体宿主细胞要求相符。本发明的核酸序列和载体可以插入其中的适宜的商业上可用的表达载体包括PSP0RT、 pBluescriptllSK、杆状病毒表达载体pBlueBac和原核生物表达载体pcDNAII，所有这些均可得自 Invitrogen Corp. , San Diego, CA0适用于在将细胞包埋在根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯之前转染细胞的如本文定义的载体，通常将如上文定义的核酸序列与其它调控元件组合，所述调控元件例如控制编码的氨基酸序列的表达。这样的调控元件例如是1)对身体的组织或区域特异性的；幻构成性的；幻葡萄糖响应性的；和/或4)可诱导的/或调节的。本文的调控元件优选选自调节序列和复制起始区(如果载体是自主复制的)。本发明范围内的调节序列是对转录的表达和/或编码核酸序列的翻译有影响的本领域技术人员已知的任何组件。 调节序列除了启动子序列之外还包括所谓的增强子序列，其可由于RNA聚合酶和DNA之间相互作用增强而导致表达增加。本发明载体的其它调节序列是转录调节和翻译起始信号， 所谓的“终止子序列”等或其部分序列。通常，任何天然存在的启动子可以包含在适用于转染可用于制备本文所用(球形)微囊细胞的表达载体中。这种启动子可选自任何真核、原核、病毒、细菌、植物、人或动物例如哺乳动物的启动子。合适的启动子包括，例如，细胞巨化病毒启动子、IacZ启动子、gal 10 启动子禾口 AcMNPV 多面体启动子、诸如 cos-、tac-、trp-、tet-、trp—tet—、lpp-、 lac-、lpp-lac-、laclq-、T7_、T5_、T3_、gal-、trc-、ara-、SV40-、SP6、I-PR-或 I-PL-启动子的启动子，有利地是在革兰氏阴性菌中发现的。此外，启动子可得自革兰氏阳性启动子例如amy和SP02，酵母启动子，例如ADCl、MFa、AC、P_60、CYCl、GAPDH或哺乳动物启动子例如细胞巨化病毒(CMV)启动子，包括哺乳动物肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结合蛋白启动子、哺乳动物肌钙蛋白I(TNNI2)启动子或哺乳动物骨骼α-actin(ASKA)启动子的肌肉特异性启动子，或者肝型丙酮酸盐启动子，特别是运行(-183至+1 或(-96至 +12) (Thompson，等人· J Biol Chem, (1991). 266 :8679-82. ；Cuif，等人·，Mol Cell Biol,CN 102438647 A
说明书
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(1992) · 12 =4852-61)的片段；斑点 14 启动子(S14，-290 至 +18) (Jump,等人·，J. Biol Chem, (1990) · 265 :3474-8)；乙酰基-CoA 羧化酶(0 ‘ Callaghan,等人·，J. Biol Chem, (2001) · 276 16033-9)；脂肪酸合酶(-600 至 +65) (Rufo,等人·，J Biol Chem, (2001) · 28 28)；和葡萄糖-6-磷酸酶(大鼠和人)(Schmoll，等人·，FEBS Left, (1996). 383 :63-6 ； Argaud,等人·，Diabetes, (1996). 45 :1563-71)，或者来自 CaM-Kinasell、巢蛋白、L7、 BDNF、NF、MBP、NSE、β -球蛋白、GFAP、GAP43、酪氨酸羟化酶、红藻氨酸-受体-亚基1、谷氨酸-受体-亚基B的启动子，或人泛激素启动子B(ubiB人)、人铁蛋白H启动子(FerH)等。 特别优选的启动子是来源于人或哺乳动物的。最后，可以有利地使用合成的启动子。包含在一种本发明载体中的启动子序列还可以为体外控制目的而诱导，以容许表达的调节(例如在生长培养基中存在或缺乏营养素或其它诱导物)。一个实例是得自λ噬菌体plac5 的lac操纵子，其可通过IPTG诱导。最后，如本文定义的启动子可以与如上文定义的核酸序列连接，例如编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体，例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽和任选的如本文定义的另外的因子例如抗细胞凋亡剂、VEGF等的，使得所述启动子位于编码核酸序列的GLP-I的5’ “上游”。优选地，使用人启动子，例如人泛激素启动子B (人ubiB)或者人铁蛋白H启动子(FerH)。用于由上文定义的核酸序列编码的肽的上调节表达的增强子序列优选是本文定义的载体或表达载体的另一组成。这样的增强子序列通常位于该载体的非编码的3’区域。 用于如本文定义的载体的增强子序列可以得自任何真核、原核、病毒、细菌、植物、人或动物例如哺乳动物宿主，优选与相应的本文定义的启动子结合。本发明中最有用的增强子元件是葡萄糖响应性、胰岛素响应性和/或肝特异性的那些。增强子元件可包括CMV增强子(例如，与泛激素启动子(Cubi)连接的)；一种或多种葡萄糖响应性元件，包括肝脏丙酮酸激酶 (L-PK)启动子(-172至-14 的葡萄糖响应性元件(GlRE)；以及具有增强的响应性的修饰的形式(Cuif 等人·，同上；Lou,等人·，J. Biol Chem, (1999) · 274 :28385-94)；具有辅助 L3 盒(-172 至-126)的 P-PK 的 GlRE (Diaz Guerra，等人·，Mol Cell Biol, (1993). 13 7725-33 ；具有辅助L3盒的响应性增强的GlRE的修饰的形式；S14(_1448至-142 的碳水化合物响应性元件(ChoRE)，以及在较低葡萄糖浓度时活化的变体(Shih and Towle, J Biol Chem, (1994) · 269 :9380-7 ;Shih，等人·，J Biol Chem, (1995) · 270 :21991-7 ；以及 Kaytor，等人.，J Biol Chem, (1997). 272 :7525-31 ；具有 S14 (-1467 至-1422)的邻近附属因子位置的ChoRE [等人.，同上]；醛缩酶(+1916至+2329) (Gregori等人..，J Biol Chem, (1998) · 273 :25237-43 ；Sabourin,等人·，J. BiolChem, (1996) · 271 :3469-73 ；和脂肪酸合成酶(-7382至-6970) (Rufo,等人.，同上.)，更优选胰岛素响应性元件例如葡萄糖_6_磷酸酶胰岛素响应性元件(-780至-722) [Ayala等人·，Diabetes, (1999). 48 :1885-9 ；和肝脏特异性增强子元件，例如凝血酶原(940至-860) [Chow等人·，J Biol Chem, (1991)266 18927-33;和 α-1-小球蛋白(-2945 至-2539) [Rouet 等人.，Biochem J, (1998). 334 577-84)，肌肉特异性增强子例如哺乳动物MCK增强子、哺乳动物DES增强子和脊椎动物肌钙蛋白IIRE(TNI IRE，下文称为FI拙)增强子。最后，还可以包括SV40增强子序列。增强子元件可进一步与如本文定义的启动子一起使用，用于由如本文定义的核酸序列编码的肽的上调节表达，例如，这样的启动子/增强子组合包括例如细胞巨化病毒(CMV)启动子和CMV增强子，与泛激素启动子(Cubi)连接的CMV增强子，组肝特异性增强子元件组，其包括与它们的相应的启动子组合使用的人血清白蛋白[HSA]增强子、人凝血酶原[HPrT]增强子、α -1小球蛋白[Α1ΜΒ]增强子和基因内醛缩酶增强子，或者与选自CMV 启动子或HSA启动子的启动子组合使用的HSA增强子，选自与CMV启动子组合使用的人凝血酶原[HPrT]和α-1小球蛋白[Α1ΜΒ]的增强子元件，选自与α-1-抗胰蛋白酶启动子组合使用的人凝血酶原[HPrT]和α-l小球蛋白[Α1ΜΒ]的增强子元件等。此外，适用于转染可用作根据本发明使用的(球形)微囊的组成的细胞的如本文定义的载体可含有转录和/或翻译信号，优选由适当的宿主识别的转录和/或翻译信号，例如转录调节和翻译起始信号。转录和/或翻译信号可得自任何真核、原核、病毒、细菌、植物，优选人或动物，例如哺乳动物宿主，优选与本文定义的相应启动子相关。因此可以使用许多种不同的转录和翻译调节序列，这在宿主细胞识别与编码本文所定义的肽相关的转录调节和翻译起始信号的程度上取决于宿主的性质，如上文定义的肽例如适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体，例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，和任选的本文定义的另外的因子的核酸序列。与编码核酸序列的天然存在的GLP-I邻近的5’ 区域可以被保持，并用于本发明载体中的转录和翻译调节。这一区域通常会包括与转录和翻译的启动有关的那些序列，例如TATA盒、帽化序列、CAAT序列等。特别地，这一区域将有至少约150个碱基对长度，更特别地，约200bp，很少超过约1至21Λ。可以选择能够控制表达或活化的适用于如本文定义的载体的转录启动调节信号， 使得可以调节编码如上文定义的肽例如适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体，例如内皮抑制素、GLP-I肽或GLP-I融合肽以及任选的如本文定义的另外的因子的核酸序列的表达。一种这样的可控调节技术是使用温度敏感的调节信号，以便通过改变温度来抑制或启动表达。另一种可控调节技术是使用对某些化学物质敏感的调节信号。这些方法优选是在体外操作中使用，例如当制备必需的构造时。此外，本文可使用转录启动调节信号，其容许在体内控制表达的抑制或活化，而没有任何其它来自细胞外的方式，例如在包囊细胞中获得瞬时表达。这样的转录和/或翻译信号包括，例如转录终止调节序列如终止信号和多腺苷酸化区域。此外，转录终止调节序列可以位于含有编码如上文定义的肽例如适用于 (眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体，例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽和任选的本文定义的另外的因子的核酸序列的如本文定义的载体的非编码3’区域。合适的终止序列可包括例如牛生长激素、SV40、IacZ, EFl α和AcMNPV多面体多腺苷酸化信号。适用于转染可用于制备根据本发明使用的(球形)微囊的细胞的表达载体，还可以包括其它序列以用于最佳地表达编码如上文定义的肽例如适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽和任选的本文定义的另外的因子的核酸序列。这样的序列包括编码信号(肽)序列的那些，即其编码为分泌的蛋白质进入或穿过膜提供通道的位于N-末端的肽序列；其为表达产物提供稳定性；以及限制性酶识别序列，其为被限制性内切核酸酶分解提供位置。所有这些物质均是本领域已知的并且是商业可得的(参见，例如，0kayama(1983)，Mol. Cell. Biol.，3 :280)。如本文定义的，“信号序列”是一种信号(肽)序列，其通常包括位于一上述关于 GLP-I的氨基酸1至6的条件定义范围内的一表达的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体或者其它要分泌即穿过细胞膜的因子的N-末端的约8至30个氨基酸。这样的信号(肽) 序列可包括通常与野生型GLP-I前体蛋白质相关的信号(肽)序列(即，全长胰高血糖素原前体分子的信号(肽)序列)以及通常不与其相关的信号(肽)序列，即与野生型GLP-I 前体蛋白质是异源性的。如本文定义的“信号(肽)序列”可以例如是信号肽序列或引导序列(例如分泌信号(和引导)序列)。此外，如本文定义的信号(肽)序列优选提供由蛋白酶例如信号序列蛋白酶分解前体肽。在通过蛋白酶从前体肽分解信号序列时，产生了例如适用于(眼内)治疗眼疾病的生物活性神经保护因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽以及任选的如本文定义的另外的因子。这样的信号(肽)序列通常包含编码由用于分解的蛋白质酶识别的分解位点的区域。或者，编码由用于分解的蛋白质酶识别的分解位点的区域可以被引入到信号(肽)序列中。此外，编码由用于分解的蛋白质酶识别的分解位点的另外的(一种或多种)序列可以被加入到信号(肽)序列中。可以由如本文定义的载体编码的信号(肽)序列的实例包括得自分泌的蛋白质例如GLP-I或除GLP-I以外的如细胞因子、凝固因子、免疫球蛋白、分泌酶或激素(包括脑下垂体腺嘌呤核苷酸环化酶活化的多肽(PACAP)/胰高血糖素超家族)和血清蛋白质的信号 (肽)序列。例如，如本文定义的信号(肽)序列可得自分泌的基质金属蛋白酶(MMP)例如基质降解酶引导序列，得自分泌的人碱性磷酸酶(SEAP)、艾塞那肽原(pro-exendin)例如艾塞那肽原-4(pr0exendin-4)引导序列、毒蜥素原(pro-helodermin)、前葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)、前胰岛素样生长因子(IGFl)、前胰高血糖素原、α-1抗胰蛋白酶、胰岛素样生长因子1、人因子IX、人淋巴细胞毒素A (Genbank登记号ΒΑΑ00064)或人丛生蛋白 (Genbank登记号ΑΑΡ88927)。如本文定义的信号(肽)序列的具体实例是包括用于通过信号肽酶、弗林蛋白酶或其它激素原转化酶(例如，PC3)前体分解的信号编码区域。例如，通过弗林蛋白酶(亦已知为PACE，参见美国专利No. 5，460，950)、其它枯草杆菌蛋白酶(包括 PC2、PC1/PC3、PACE4、PC4、PC5/PC6、LPC/PC7IPC8/SPC7 和 SKI-1 ；Nakayama, Biochem. J.，327 :625-635(1997))；肠激酶(参见美国专利No. 5，270，181)或糜蛋白酶分解的信号可以被引入到本文定义的信号(肽)序列中。这些文献的各自的公开内容通过引用并入本文。弗林蛋白酶是一种普遍存在的表达的蛋白酶，其位于转运高尔基氏体中并在分泌前处理蛋白质前体。弗林蛋白酶在其共有识别序列Arg-X-Lys-Arg或Arg-X-Arg-Arg、(Lys/ Arg) -Arg-X- (Lys/Arg) -Arg 和 Arg-X-X-Arg，例如 Arg-Gln-Lys-Arg 的 COOH-末端处分解。 这些氨基酸序列是通过蛋白质酶弗林蛋白酶前体分解的信号。因此，异源性信号序列亦可由信号序列编辑的共有序列(例如，由由信号肽酶分解的分泌的蛋白质编辑的共有序列) 合成得到。除了如本文定义的调节序列外，如本文定义的自主复制载体通常包含复制起始区。合适的复制起始区包括，但不限于，例如ColEl、pSC101、SV40、pMPI(ori pMPI)和M13 复制起始区等。
优选地，适用于表达如上文定义的肽例如适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽和任选的如本文定义的另外的因子的如本文定义的载体可以另外地(被基因工程化为)包含自杀基因。在本发明的情况下，“自杀基因”在施用特定物质时，优选能够通过杀灭包含在(球形)微囊的(球形) 核芯中的自杀基因包裹细胞来终止本文所用的(球形)微囊的治疗。换言之，适用于本发明的自杀基因可通过施用外源性活性剂来活化，所述外源性活性剂通常不会存在于人或动物体内。在此情况下，典型地自杀基因引发引起细胞发生细胞凋亡事件的级联。另选地，适用于本发明的自杀基因可代谢施用的外源性非毒性前药，所述前药通常不会存在于人或动物体内。外源性非毒性前药的代谢优选使前药对细胞具有毒性。自杀基因可以包含在相同的载体上，所述载体编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/ 或其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，或者另选地包含在第二载体上。此外，自杀基因可通过任何种类的控制和调控元件来调节，例如本文提及的作为表达载体的组分的控制和调控元件例如启动子、增强子等，或者通过它们的天然存在的控制和调控元件来调节。优选地，根据本发明选择自杀基因，其允许任何上述控制机理，例如选自下列的自杀基因胞嘧啶脱氨基酶(⑶)、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(UPRTase)、HSV胸苷激酶(HSV-Tk)、可通过添加四环素诱发的自杀基因例如细菌Tet阻遏蛋白(TetR)等。作为一个具体的实例，可以使用胞嘧啶脱氨基酶(CD)。胞嘧啶脱氨基酶(CD)通常存在于各种有机体中，并且能够使5-氟胞嘧啶 (5-FC)转化成5-氟尿嘧啶(5-FU)，其是一种常用的化学治疗剂。5-氟尿嘧啶(5-FU)对有机体有高毒性，而其前药5-氟胞嘧啶(5-FC)对细胞无毒性。5-氟尿嘧啶(5-FU)随后通过细胞激酶而被磷酸化，并且能够消除细胞RNA合成。因此，前药5-氟胞嘧啶(5-FC)是一种用于诱导特异性细胞自杀的优良工具。此外，5-氟-dUMP作为抗叶酸剂并抑制胸苷酸合成酶，所述胸苷酸合成酶在脱氧核糖核甘酸的从头合成路径中催化dUMP甲基化成dTMP。因此，可以实现在细胞中抑制DNA合成。还优选地，可以使用HSV-I胸苷激酶(ATP 胸苷_5_磷酸转移酶，(HSVltk))及其相应的前药更昔洛韦(GCV)。鸟苷类似物GCV被特异性地磷酸化并抑制DNA合成的延伸，由此导致细胞自杀。在这种情况下，HSV-I胸苷激酶在细胞内将非毒性前药更昔洛韦转化成毒性产物，从而在不希望的细胞增殖的情况下使转染的细胞破坏。因此，给用含有退化细胞的GLP-I CellBeads 治疗的患者全身施用更昔洛韦会导致转染的细胞破坏。如本文定义的载体，或者另选地，编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽和任选的如本文定义的另外的因子的裸核酸到用于制备如本文定义的(球形)微囊的合适细胞中的转染可以通过本领域技术人员已知的任何方法来实现(参见例如Maniatis等人.Q001)Molecular Cloning =A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。 如果载体被转染到如本文定义的合适细胞中，则载体优选以携带GLP-I肽编码核酸的质粒DNA的形式存在。质粒DNA优选是环状质粒DNA。适宜的转染方法包括，但不限于，例如电穿孔技术，包括改良的电穿孔技术(例如核转染)、磷酸钙技术例如磷酸钙共沉淀方法、DEAE-葡聚糖法、脂质转染法例如传递-介导的脂质转染法等。优选地，以携带如本文定义的载体使用改良的电穿孔技术(例如核转染)来进行转染。如本文定义的载体，或者另选地，编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽和任选的如本文定义的另外的因子的核酸可以进一步被复杂化，例如用至少一种合成聚合物或天然聚合物例如聚氨基酸转染，或者可以与其共轭。至少一种聚合物成分可以共价偶联到如本文定义的载体，或者另选地共价偶联到编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体的核酸。在本发明含义中 “共轭”表示“化学偶联”。“化学偶联”欲意表示通过共价或非共价键合偶联。虽然也可以使用共价键合，然而对于转染目的而言优选非共价键合。从而，可以通过没有共价连接的复合体使聚合物成分连接到融合肽，例如通过氢键或者静电性、疏水性等相互作用。(为转染目的)用于偶联如本文定义的载体或者另选地偶联编码适用于(眼内) 治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体的核酸的本文所用聚合物可以是生理学可接受的聚合物，其包括溶解于水溶液或者悬浮液并且在以药学有效量施用该融合肽时对哺乳动物无负面影响例如副作用的聚合物。对根据本发明使用的生理学可接受的聚合物无特别的限制。所述聚合物可以是合成性质的或者可以是天然存在的聚合物(例如蛋白质)。更一般地，与如本文定义的载体或者另选地编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体的核酸一起使用的合成聚合物优选选自烯烃二醇类，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟基烷基甲基丙烯酰胺、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯例如聚羟基乙烯甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、多糖、聚([α]_羟基酸)、聚乙烯醇、聚膦腈、聚噁唑啉、聚N-丙烯酰基吗啉)、聚乙烯基乙基醚、聚乙烯缩醛、聚乳酸羟基乙酸、聚乳酸、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸、聚氨酯 (polyurethyne)、聚唾液酸、三醋酸纤维素、硝酸纤维素以及前述任意的组合。本发明还提供了一种制备根据本发明使用的(球形)微囊的方法。这些(球形) 微囊优选根据两个或多个方法步骤来制备。根据方法步骤1)，如上文所述制备核芯。根据方法步骤幻，通过一个或多个表面包裹层将根据方法步骤1)制备的核芯包裹。其它任选的步骤可包括重复方法步骤幻以制备另外的表面包裹层。优选地，对于每一个这样的另外的表面包裹层进行与方法步骤幻相同的步骤。其它任选的步骤可包括在制备球形微囊后洗涤的步骤。通常，上文公开的核芯根据用于制备根据本发明使用的(球形)微囊的方法步骤 1)制备。这样的核芯由交联聚合物以及编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽和任选的如本文定义的另外的因子的细胞组成，所述细胞已根据上文公开的方法转染。根据方法步骤1)，通常优选以如本文为(球形)核芯定义的浓度例如IXlO5至多6X107细胞/ml聚合物溶液来制备聚合物的可溶解形式例如藻酸盐的可溶解形式(例如在生理盐水溶液中的藻酸钾或藻酸钠)以及上文定义的细胞的混合物(混悬液)。作为一种典型的技术，同基因细胞/聚合物混悬液(例如细胞/藻酸盐混悬液)可通过空气注射喷嘴来压缩，所述喷嘴由三个通道组成，它们环绕一个共同中心以三个同心环同轴设置内部通道、中间通道和外部通道(气圈)。用于内部通道的优选的中空针具有 50 μ m至最多2，000 μ m的内径。中间通道通常具有60 μ m至4，000 μ m的内径，而外部通道 (气圈)优选具有IOOym至5，000μπι的内径。仅仅内部通道和外部通道(气圈)被用于方法步骤1)，以制备根据本发明使用的(球形)微囊的核芯。因此，仅仅由两个通道(内部通道和外部通道)组成的喷嘴亦可用于方法步骤1)。通常，如果使用具有三个通道的空气注射喷嘴，则中间通道没有物料流过。细胞/聚合物溶液的混悬液通常以 ομ Ι/min至 5ml/min的速度压缩通过内部通道，在通道出口处产生液滴，液滴因外部通道(气圈)提供的具有典型的0. 51/min至101/min的速度的空气流而掉落。含有细胞和未交联聚合物溶液的液滴落到含交联剂的溶液(沉淀浴)中，其通常位于空气注射喷嘴出口下面约4cm至约60cm的距离。液滴在下落期间优选变圆，从而得到基本呈球状的几何形状。交联剂引起聚合物的离子化交联，且最初形成的球状(水不溶性)微囊的核芯具有如本文定义的(球形)核芯的直径。(球形)微囊的核芯的直径取决于用于方法步骤1)的所选择的通道的大小和几何形状。如果藻酸盐用作聚合物，则含有交联剂的溶液(沉淀浴)优选由二价阳离子例如钙或钡离子(5-100mM)或者其它二价或多价阳离子组成。此外，沉淀浴优选含有缓冲物质(例如ImM-IOmM的组氨酸)和氯化钠(例如290m0smol 士 50m0smol)。如果使用除藻酸盐以外的其它聚合物，则本文可以使用本领域已知的其它适宜的交联剂和缓冲剂。方法步骤1)提供由交联聚合物和本文定义的细胞组成的(球形)微囊的核芯。在方法步骤1)之后，任选的方法步骤可包括洗涤步骤。例如，根据本发明使用的(球形)微囊的核芯用生理盐水溶液或者任何其它合适的洗涤溶液洗涤，并且如果适用的话，使所述核芯在硫酸钠溶液中培养，优选在根据US 6，592，886的硫酸钠溶液中培养，其公开内容通过引用并入本文。从沉淀浴和/或洗涤浴中分离根据本发明使用的(球形)微囊的核芯通常使用离心或者任何其它合适的方法来进行。根据方法步骤幻，由方法步骤1)制备的根据本发明使用的(球形)微囊的核芯由基本为交联聚合物的表面包裹层包裹。相应地，将步骤1)制备的(球形)微囊的核芯加至上文公开的不包含细胞的含有未交联聚合物的聚合物溶液中。优选地，所述聚合物以其未交联形式以本文定义的浓度提供。通常，将含有聚合物溶液和(球形)微囊的核芯的混合物以例如15μ Ι/min至2ml/min，优选10 μ 1/min至5ml/min的速度压缩通过上述空气注射喷嘴的内部通道。同时，使没有细胞的纯未交联聚合物溶液，优选包含约0. 至约4% (w/v)聚合物的溶液，例如无任何细胞的藻酸盐溶液，以通常的15μ Ι/min至aiil/min，优选 10 μ 1/min至5ml/min的速度压缩通过中间通道。从而，在中间通道的末端形成含有核芯和未聚合聚合物的表面的微滴。这些微滴由于通过外部通道(气圈)提供的通常具有0.51/ min至101/min的速度的空气流而掉落。(球形)微囊的核芯的聚合物浓度、加入了(球形) 微囊的核芯的聚合物溶液以及表面包裹层的聚合物浓度可以不同(参见上文)。含有(球形)微囊的核芯的微滴(根据方法步骤2制备)落入含有本文定义的交联剂(沉淀浴)的溶液中。在下落过程中，微滴优选变圆至大约球体几何形式。交联剂产生类似于方法步骤 1)的聚合物的离子交联键。从而，形成具有本文定义的直径的水不溶性(球形)微囊，更优选(球形)微囊总体直径(粒径)约100 μ m至约200 μ m,更优选总体直径约115 μ m至约 185 μ m,再更优选总体直径约130 μ m至约170 μ m,最优选总体直径约145 μ m至约155 μ m， 例如约150 μ m。方法步骤2)获得的(球形)微囊的总体直径取决于用于本文的所选择的通道的大小和几何形状。为了制备如本文定义的具有一个以上表面包裹层的(球形)微囊， 即含有如本文定义的核芯以及2、3、4、5、5-10个或更多个表面包裹层的(球形)微囊，方法步骤2)可以根据需要经常重复。这些其它的表面包裹层在上述直径范围内定义。在方法步骤2、之后，可以接着进行一个或多个本文定义的任选的洗涤步骤。根据另一个方面，本发明还提供了治疗动物优选哺乳动物的眼疾病的方法。这种治疗方法可因此用于人医学或兽医学领域。在本发明的情况下，术语哺乳动物通常包括任何动物和人，优选选自但不限于人和(哺乳)(非人)动物，包括例如猪、山羊、牛、猪、狗、 猫、驴、猴、猿或啮齿类动物包括小鼠、仑鼠和兔、奶牛、兔、绵羊、狮子、美洲虎、豹、大鼠、猪、 水牛、狗、懒猴、仑鼠、豚鼠、扁角鹿、马、猫、小鼠、豹猫、薮猫等。这种治疗通常通过给有需要的患者施用如本文定义的(球形)微囊来进行的，特别是通过施用如本文定义的编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或变体的细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞或者可在本发明的情况下使用的任何其它细胞(类型)，其中这些细胞被包囊于如本文定义的(球形)微囊中以防止所治疗患者的免疫系统反应。此外，这种治疗可通过施用包含如本文定义的(球形)微囊的(药物)组合物特别是如本文定义的编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或变体的细胞例如间充质干细胞或间充质基质细胞或可用在本发明上下文中的任何其它细胞(类型)来进行，其中这些细胞被包囊于如本文定义的(球形)微囊中以防止所治疗患者的免疫系统反应。优选地， (球形)微囊以及它用于本发明方法的所有组分，例如核芯或表面包裹层的聚合物基质的聚合物等是如本文定义的。此外，这种治疗还可通过直接施用适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或GLP-I融合肽来进行，其全部如本文定义。上述根据本发明的治疗方法可用于人和兽医目的。本文定义的治疗方法优选包括眼疾病特别是视网膜退化所致眼疾病和病症的治疗或预防，除此之外还包括视网膜病，选自色素性视网膜炎(RP)、黄斑变性(MD)、年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)、其它原因引起的斑点水肿、视网膜血管阻塞、糖尿病性视网膜病，青光眼和其它视神经病等，以及与其相关的病情的治疗或预防。使用如本文定义的(球形)微囊或者包含这些(球形)微囊)或适用于(眼内) 治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的(药物)组合物治疗或预防眼疾病或病症或与其相关的疾病优选会产生上文所述适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等的有益效果。例如，GLP-I的有益效果是已知的， 例如由于其DPP-IV蛋白质酶稳定性而没有反复施用GLP-I肽的需求和/或没有对抗例如植入的GLP-I表达同种异体细胞的不希望的免疫反应的风险，其强烈地减小由局部缺血或缺氧引起的损伤和心脏组织的可能死亡的活性，。内皮抑制素、胶原XVIII的分解产物的已知有益效果包括其显著减少血管形成的能力。此外，如本文定义的(球形)微囊或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或变体的细胞的“安全和有效量”将在给药医生的知识和经验范围内，随待治疗的特定眼疾病或病症以及待治疗患者的年龄和身体状态、病情的严重性、治疗的持续时间、伴随治疗的性质、所用的具体的药学可接受的载体和类似因素而变化。如本文定义的，眼疾病或与这样的眼疾病有关的任何疾病或病情的治疗或预防的方法包括给有需要的患者施用如本文定义的(球形)微囊，或者施用包含所述(球形)微囊的(药物)组合物，或者施用适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、 GLP-I肽或GLP-I融合肽。“有需要的患者”通常是动物，优选哺乳动物。更优选地，“有需要的患者”选自但不限于，人类和动物，包括例如猪、山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿或啮齿类动物包括小鼠、仑鼠和兔。在上文治疗方法的情况中的施用通常是通过施用“安全和有效”量的活性剂例如 (球形)微囊，即编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或如本文定义的任何其它蛋白质或蛋白质样物质例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或变体的如本文定义的(球形)微囊的细胞或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或GLP-I融合肽来进行的。如本文使用的， “安全和有效量”是指如上文定义的活性剂的量，其足以显著诱发本文提及的眼疾病或病症积极改变。然而，同时，“安全和有效量”小到足以避免严重的副作用，即在利益和风险之间容许有明确的关联性。这些限制的确定通常是在明确的医学判断范围内。在本发明的情况下，表述“安全和有效量”优选表示适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的量，或者表示编码和分泌如本文定义的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或变体的如本文定义的(球形)微囊的细胞的量，其适用于发挥本文定义的神经保护和/或抗血管形成因子或者其片段或变体的已知的有益效果。在上文中，编码和分泌如本文定义的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、 抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I 融合肽等或者其片段或变体的如本文定义的(球形)微囊的细胞，通常以约0.2yg/天/ ml (球形)微囊的浓度分泌如本文定义的例如GLP-I肽和/或内皮抑制素。因此，剂量范围可以例如是适用于(眼内)治疗眼疾病的分泌的生物活性的神经保护因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如GLP-I肽和/ 或内皮抑制素，为每天约0. 01 μ g至20mg的范围(甚至还考虑I-IOOmg的更高量的范围)， 例如每天约0. 01 μ g至IOmg的范围，优选每天0. 01 μ g至5mg的范围，并且再更优选每天约0. 01 μ g至Img的范围，以及最优选每天约0. 01 μ g至500 μ g的范围。如果适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽在没有细胞情况下直接施用，这也是可适用的。在上文治疗方法的情况中的施用通常是通过提供包囊在如本文定义的(球形)微囊中的细胞，或者如本文定义的(球形)微囊，或者含有这种(球形)微囊的(药物)组合物，或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，给待治疗患者的特定施用位置来进行的。这样的特定施用位置通常是眼，例如眼内施用，优选待治疗患者的眼的受侵袭区域，更特别地是特定的组织或区域，例如视网膜、虹膜， 更优选地，离虹膜2-3mm，例如在结膜和巩膜被轻微扰乱之后，在眼的玻璃体腔中。相当重要的是认识到眼中的玻璃体腔可以用作用于治疗眼内疾病的药物贮库。由于眼是身体体积的 10000分之一，如果不是施用到眼内的话，则药物必须以10000倍高的剂量全身给药以在理论上在需要起效的位置即视网膜或其它眼内结构中达到相同浓度。这将会产生全身副作用的巨大风险。例如，眼内给予较小剂量的25mg的结晶甾体(去炎松)是全身给予1/4千克的等效剂量。这样的剂量相当于患者存活剂量。此外，直接眼内施用药物避免血-视网膜屏障的问题，这一问题限制药物在视网膜组织中的利用率，尽管其可通过视网膜血管输送。 然而，由于视网膜血管壁中相对紧密的连接，药物通常不能完全离开血管并渗透进入视网膜组织。在这种情况下，同样非常重要的是，药物的反复眼内施用还可能伴有晶状体和视网膜的医源性损伤的累积风险，并且当太频繁地反复施用时会伴有感染的累积风险。因此，非常希望开发如根据本发明完成的可显著减少必要的反复施用的次数的操作法和技术。产生药物的细胞植入到眼中，被保护这些细胞避免被免疫攻击的结构所覆盖，其防止细胞离开它们的“笼子”，并且其同时容许细胞的营养和产生的药物的释放进行物质交换，可以与产生药物的织物最小化和转位进入眼中相比较。另选地，包囊在如本文定义的(球形)微囊中的细胞，或者如本文定义的(球形)微囊，或者含有该(球形)微囊的(药物)组合物， 或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或GLP-I融合肽或者其片段或变体可以被施用到眼的前房或后房，例如，施用到房水或玻璃体中。另选地， 可以在视网膜下进行注射，例如通过在视网膜后注射。本发明的情况下的施用位置进一步包括例如眼内施用、眼或视网膜的任何表面、 虹膜或其组织或者周围区域，它们可以通过注射或植入而被治疗，但不限于此。另选地，编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I 融合肽的细胞还可以被植入到前房、晶状体囊状袋(例如，内障外科后)、视网膜下间隙和脉络膜周隙。细胞的植入可通过注射或者任何其它外科手术或非外科操作来执行，使细胞引入到眼的内部，其定义为巩膜内部的全部容积。施用位置可以进一步包括适用于本文所述眼疾病的治疗的任何空腔。施用如本文定义的(球形)微囊，特别是包裹在如本文定义的(球形)微囊中的编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或如本文定义的任何其它蛋白质或蛋白质样物质例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或变体的细胞，或者含有这种(球形)微囊的(药物)组合物到如本文定义的特定施用位置，或者施用适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的 GLP-I融合肽，可以使用不同的施用模式进行。包裹在如本文定义的(球形)微囊中的细胞， 或者如本文定义的(球形)微囊，或者含有这种(球形)微囊的(药物)组合物，或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，可以例如全身或局部施用。全身施用的途径通常包括经皮途径或胃肠外途径，包括静脉内(例如通过外周静脉注射)、皮下和/或动脉内注射，例如通过门静脉、到胆管、或者肌内、腹膜内或鼻内。局部施用的途径通常包括例如眼内施用途径以及局部、经皮、肌内、皮下、贲门内、 心肌内和/或心包注射。更优选地，包裹在如本文定义的(球形)微囊中的细胞，或者如本文定义的(球形)微囊，或者含有这种(球形)微囊的(药物)组合物，或者适用于(眼内) 治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，可以通过皮内、皮下或肌内途径施用。为了注射的目的，包裹在如本文定义的(球形)微囊中的细胞，或者如本文定义的(球形)微囊，或者含有这种(球形)微囊的(药物)组合物，或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，可以被配制成适宜的形式，例如通过添加适宜的药用载体，例如以在液体药物组合物、凝胶等的形式。可以适用于任何前述眼疾病或病症的治疗的其它施用方式包括使包裹在如本文定义的(球形)微囊中的细胞，或者如本文定义的(球形)微囊，或者含有这种(球形)微囊的(药物)组合物移植进入或移植到本文定义的施用位置。对于移植目的，包裹在如本文定义的(球形)微囊中的细胞，或者如本文定义的(球形)微囊，或者含有这种(球形) 微囊的(药物)组合物可以被配制成适宜的形式，例如通过添加适宜的药用载体，例如以凝胶、胶囊、片剂等的形式。施用通常可以以单次施用、在同一天内多次施用、数周或数月期间单次施用、或者数周或数月期间多次施用来进行。包裹在如本文定义的(球形)微囊中的细胞，或者如本文定义的(球形)微囊，或者含有这种(球形)微囊的(药物)组合物，或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，可以通过介入方式直接递送到如本文定义的施用位置，例如使用导管引导到受侵袭区域以及通过注射将这种(球形)微囊植入到施用位置。植入还可使用外科途径方法或非外科过程来进行。根据一个特别优选的实施方案，(球形)微囊，特别是编码和分泌适用于(眼内) 治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或变体的如本文定义的细胞，或者包含这种(球形)微囊的(药物)组合物，或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，可以例如通过如上文已定义的注射来施用。特别优选的，通过使用适宜的注射针来进行注射，例如具有12至^G，更优选18至22G尺寸的注射针。根据另一特别优选的实施方案，(球形)微囊，特别是编码和分泌适用于(眼内) 治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质例如内皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或变体的如本文定义的细胞，或者包含这种(球形)微囊的(药物)组合物，或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、 GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，可以例如优选通过使用外科装置例如解剖刀、注射针来移植本文定义的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质而施用。本发明进一步包括如本文定义的包含编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质例如内皮抑制素、 GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的细胞的(球形)微囊，或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，用于制备产品例如(药物)组合物或药盒的用途，以用于在动物中，优选如本文定义的哺乳动物如人类中，治疗眼疾病或病症或与其相关的疾病或病症。在这种情况下，本发明的药物组合物可用于人医学或兽医学领域。本发明进一步包括编码适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的细胞，或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，在制备(如本文定义的(球形)微囊，优选制备产品例如(药物)组合物或药盒的用途，以用于在动物中，优选如本文定义的哺乳动物例如人类中，治疗眼疾病或病症或与其相关的疾病或病症。如果使用细胞， 则为此目的所使用的细胞优选是如本文定义的编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞或可用在本发明上下文中的任何其它细胞(类型)，其中这些细胞被包囊于(球形)微囊中以防止所治疗患者的免疫系统反应。本发明另一方面是含有如本文定义(球形)微囊的(药物)组合物，所述(球形) 微囊包含编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者如本文定义的其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I 肽或如本文定义的GLP-I融合肽的细胞，或者包含适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或本文定义的GLP-I融合肽。这种(药物)组合物可以施用给罹患上述眼疾病或病症的患者，优选以本文定义的方式施用于如本文定义的施用位置。含有如本文定义的包含编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、 抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的细胞，或者含有适用于(眼内)治疗眼疾病
46的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽作为“活性成分”的(球形)微囊的(药物)组合物的制备通常是本领域公知的，例如美国专利4，608，251 ;4，601，903 ； 4，599，231 ；4, 599，230 ；4, 596，792和4，578，770所示例的，它们全部通过引用并入本文。通常，(药物)组合物被制备成可注射的液体溶液或混悬液，优选含有水(水性制剂)或者可以被乳化。术语“水性制剂”定义为包含至少50% w/w水的制剂。同样，术语 “含水溶液”定义为包含至少50% w/w水的溶液，术语“含水混悬液”定义为包含至少50% w/w水的混悬液。对于到如本文定义的施用位置的肌内、静脉内、表皮或皮下注射或者任何其它注射，细胞或者如本文定义的(球形)微囊或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、 抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽，或者如上文定义的药物组合物，将是胃肠外可接受的含水溶液形式，其是无热原的并且具有适宜的PH、等渗性和稳定性。液体(药物)组合物通常包括液体载体例如水。优选地，液体载体将包括生理盐水溶液、葡萄糖乙醇或其它糖溶液，或者可以包括二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇或其组合。其它实例包括其它等渗载体，如生理盐溶液，例如林格氏溶液或乳酸林格氏溶液。如果本发明的(药物)组合物包含细胞或者如本文定义的(球形)微囊或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的含水溶液以及例如缓冲剂，则所述(球形)微囊或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽通常以0. lmg/ml或以上的浓度存在于(药物) 组合物中，并且所述(药物)组合物通常具有约2. 0至约10. 0，优选约7. 0至约8. 5的pH。有可能的是，在本发明(药物)组合物中可以存在其它成分。这样的其它成分可包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、PH缓冲剂(例如磷酸盐或柠檬酸盐或马来酸盐缓冲剂)、防腐剂、表面活性剂、稳定剂、渗透压调节剂、熬合剂、金属离子、油脂性载体、蛋白质 (例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和/或两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。由本领域技术人员根据包埋在根据本发明使用的(球形) 微囊的(球形)核芯中的细胞的具体需求或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的具体需求来选择此类成分，即这些成分不是细胞毒性的并且确保细胞存活。此外，此类成分可以使可由包埋在根据本发明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的细胞编码和分泌的适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体稳定。关于缓冲剂，优选选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、 赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)_氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(h印es)、N，N_ 二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂中的每一种构成本发明的一个替代实施方案。所有在如本文定义的(药物)组合物中的上述添加剂的应用是本领域技术人员公知的，特别是关于它们的浓度范围。为方便起见，可参见Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。含有包含如本文定义的编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、 抗血管形成因子和/或如本文定义的任何其它蛋白质或蛋白质样物质的细胞或者包含适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体例如内皮抑制素、GLP-I肽或如本文定义的GLP-I融合肽的(球形)微囊的本发明(药物)组合物一般优选以如本文定义的方式施用以供治疗。这样的施用优选与剂型相匹配，并且优选包含安全和有效量的活性成分，例如如本文定义的细胞或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质或者其片段或变体，即被认为是安全但治疗上有效的量。与本发明(药物)组合物(或者如果需要的话，单独地)一起施用的如本文定义的细胞或者适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的量取决于所治疗的受试者和疾病，包括，例如患者疾病的严重性。适合的剂量范围取决于在预定时间期间直接提供的或者由(球形)微囊(包含在本发明(药物)组合物中)分泌的如本文定义的适用于(眼内)治疗眼疾病的生物活性的神经保护因子、抗血管形成因子或其它蛋白质或蛋白质样物质的量并且通常以本文定义的每天大约1至数百微克(本文定义的神经保护和/或抗血管形成因子和/或任何其它适宜的因子)。本发明可进一步包括上述实施方案和特征的组合，只要未另外说明，并且将不限于这些具体定义的单个实施方案。附图本发明在附图中作进一步说明。然而，并不意味着将本发明范围限定于以下所示附图中的内容。

图1 表示对示例性构建体a-m (亦参见实施例1)的概况，所述构建体可包含在用于制备根据本发明使用的(球形)微囊的细胞中。图2 描绘了 hTERT-MSC和HEK293细胞中的不同GLP-I构建体以及瞬时转染后活化GLP-I的瞬时表达的结果(也参见实施例2)。仅有边缘活化GLP-I水平可见于单体GLP-I 构建体#103和#317 (仅具有GLP-I (7-37)的一个复本)。在hTERT-MSC和HEK293细胞中的二聚体GLP-I构建体#217中(具有GLP-I (7-37)作为组件(I)和作为组件(III))中观察到表达中的巨大增长。图3 表示来自分泌GLP-I的细胞的细胞培养上清液的蛋白印迹分析(也参见实施例幻。泳道1 溶解于模拟转染的hTERT-MSC细胞的上清液中的1 OOng合成的 GLP-I (7-37)；泳道2 来自构建体#217的分泌二聚体GLP-I的hTERT-MSC细胞(克隆 79TM217/13)的上清液；泳道3 来自构建体#217的分泌二聚体GLP-I的AtT20细胞(克隆 81-A-217/3)的上清液；泳道M 预先染色的蛋白质标记[kDa])。结果显示，如本文定义的含有GLP-I (7-37)和C-末端附件(图3的2和3)的肽由自转染的细胞系分泌并且可使用抗-GLP-I抗体检测，所述抗体结合到GLP-I (7-37)的中间分子表位。图4 描述了用根据本发明使用的GLP-I肽进行的血浆稳定性实验(体外)。因此，使 HEK293 细胞用构建体(1)#103GLP-1 (7-37)、(2)#317GLP-1 (7_37)_IP2-延长有 IlAA 和(3)#217GLP-l(7-37)-IP2-GLP-l(7-37)瞬时转染。HEK293细胞是基因构建体的有效宿主(也参见实施例4)。图5 描述了分泌由构建体 #217GLP-1 (7-37)-IP2-GLP-1 (7-37)产生的 GLP-1 肽 CMl的稳定转染的hTERT-MSC细胞克隆79TM217/18K5的上清液进行的血浆稳定性动力学 (体外)，并以合成的GLP-I (7-37)作为对照。结果得自三个独立的实验。活化GLP-I使用 GLP-I (活化的)ELISA 测定(Linco)。图6:显示了用于下文所示肽的蛋白印迹。给出以下值SEQ ID NO 1 (IDlsyn)，对应于 GLP-1 (7-37)，31 个氨基酸，3. 3kD;SEQ ID NO :8(ID8syn, CM3)， 对应于 LP-I (7-37)-IP2，46 个氨基酸，5. IkD ；SEQ ID NO :7(ID7rec, CM2)，对应于 GLP-I (7-37) -IP2-RR-GLP2，83 个氨基酸，9. 4kD ；SEQ ID NO 6 (ID6syn, CMl)，对应于 GLP-I (7-37) -IP2-RR-GLP1 (7-37)，79 个氨基酸，8. 7kD (也参见实施例 5)。图7 说明了生物分析细胞系111CH0349/18中GLP-I受体介导的cAMP增加的剂量响应曲线。由构建体 #217 GLP-I (7-37)-IP2-GLP-1 (7-37)产生的分泌 CMl 的 79TM217/18K5 细胞的连续稀释的条件培养基进行刺激。在亲代hMSC-TERT细胞系中未发现有可检测的 cAMP响应。由5个独立的实验制图。检测到在cAMP生物分析中产生一半最大效用的肽剂量(ED50)为353pM(也参见实施例6)。图8 描绘了用于瞬时和稳定基因表达的示例性载体。所述载体由两个分离的转录单元组成，一个用于感兴趣的基因(GOI)，一个用于自杀基因HSV胸苷激酶和抗性基因灭菌素的融合。对于第一转录单元，使用人泛激素B启动子，对于第二转录单元，使用人铁蛋白启动子(也参见实施例9)。图9 说明了在细胞预先永生化之后用于如本文定义的(球形)微囊的细胞的表征。从图9A可以看出，永生化细胞像它们的未永生化复本那样仍然能够分化成脂肪细胞、 骨细胞和软骨细胞(左、右)。如使用CD 44和CD166表位标记的流式细胞仪计量法显示的， 永生化细胞具有成纤维细胞性形态并且就大小和粒度而言与人类MSC更具同质性，其是本文使用的原代细胞的特征。永生化细胞表达与它们的未永生化复本相同的CD标记(参见图 9B)。图10 表示C-末端延长的GLP-I类似物CMl的抗细胞凋亡效能。通过分别以 10 μ g/ml和100 μ g/ml的终浓度添加蛋白质生物合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)，在RIN-5F 细胞中诱导细胞凋亡。不同浓度的大肠杆菌重组产生的二聚体GLP-I融合肽CMl的存在产生细胞存活力的显著(P < 0. 01)增加，其在24小时孵育期之后定量。图11 是使用用于治疗眼疾病特别是黄斑变性(MD)的编码和分泌GLP-I的(球形)微囊的本发明概念的示意图。细胞，例如间充质干细胞、间充质基质细胞或同种异体细胞，被包囊在薄的选择性可渗透的藻酸盐基质形成的编码和分泌GLP-I的(球形)微囊中。 藻酸盐基质对于供应给包囊细胞的氧和营养物质以及由细胞编码和分泌的GLP-I或GLP-I 融合肽是可渗透的。另一方面，免疫系统的细胞和成分不能通过上文所述的屏障。左使用编码和分泌GLP-I的(球形)微囊的本发明概念的示意图。含有细胞的核芯珠(奶油色) 被纯藻酸盐层(灰色)包围。右体外编码和分泌GLP-I的(球形)微囊。图12 表示植入编码和分泌GLP-I和内皮抑制素的根据本发明的微囊(本文也称为GLP-I和内皮抑制素细胞珠)的家兔的体重发育。图13 显示了在第3天从右眼分离的珠(CB-087GLP-1细胞珠)。
图14 显示了在第3天从左眼分离的珠(CB-102内皮抑制素细胞珠)。图15 显示了在第14天从右眼分离的珠(CB-087GLP-1细胞珠)。图16 显示了在第14天从左眼分离的珠(CB-102内皮抑制素细胞珠)。图17 显示了在第56天从右眼分离的珠(CB-087GLP-1细胞珠)(PJ 碘化丙啶 (propidium iodate))。图18 显示了在第56天从左眼分离的珠(CB-102内皮抑制素细胞珠)(PJ 碘化丙啶)。图19 显示了在第3、14和56天在玻璃体液中的GLP-1浓度。图20 显示了最多在第56天在房水中的GLP-I浓度。图21 显示了最多在第56天在房水中的内皮抑制素浓度。图22 显示了在第3、14和56天在玻璃体液中的内皮抑制素浓度。图23 显示了 GLP-I和内皮抑制素细胞珠治疗的家兔得到的视网膜上的TUNEL染色。图M 显示了 GLP-I和内皮抑制素细胞珠治疗的家兔得到的视网膜上的TUNEL染色。图25 显示了 GLP-I和内皮抑制素细胞珠治疗的家兔得到的视网膜上的TUNEL染色。图沈显示了 GLP-I和内皮抑制素细胞珠治疗的家兔得到的视网膜上的TUNEL染色-重复分析。图27 显示了 GLP-I和内皮抑制素细胞珠治疗的家兔得到的视网膜的自发荧光-重复分析。
实施例本发明在所附实施例中作进一步的说明。然而不是要将本发明的范围限制于如下所示的实施例的内容。实施例1遗传构建体的构建GLP-I (7-37) cDNA的编码序列是如图Ia所示在包括Hincll和EcoRl位置的序列中以合成方式合成的。另外合成图Ib所示的cDNA，包括GLP-I (7-37)的编码序列、IP2以及Sfol、EcoRl和Xbal的限制位点，如图Ib所示。为了使GLP-I引导到分泌途径，使用基质降解酶3的异源信号序列(登记号NM_005940)。因此，编码基质降解酶信号和引导序列的cDNA是从人RNA扩增的逆转录酶PCR，并与图Ia或图Ib的构建体一起使用以分别形成示于图Ic和图Id的构建体。图Ia构建体的Hincll/EcoRI片段被克隆到图Id的序列的SfoI位置，以形成图 Ie构建体。类似地，使图Id的EcoIU片段克隆到真核表达质粒的EcoIU位置，以产生图If 所示的构建体。为了形成图Ig所示的构建体，图Ib所示的构建体的HincIIAbaI片段被反复地克隆到图Id所示的构建体的SfoIAbaI位置。图Ih显示了一种合成的、密码子优化的序列，其编码与编码人GLP-I (7-37)、IP2和GLP-2 (1-35)的序列融合的缩短的内源性内含子序列中断的编码基质降解酶引导和信号序列。图Ih构建体的DNA序列是SEQ ID NO16，而SEQ ID NO :15还显示了翻译的肽的序列。还合成了图Ii和Ij中的序列。然后将这些序列用于通过将图Ij的Nael/BssHII 片段克隆到图Ih的Nael/BssHII线性化序列来形成图Ik的构建体。图Ik构建体的DNA 序列是SEQ ID N0:14，而SEQ ID NO 13还显示了翻译的肽的序列。图11的构建体是通过图Ih的序列的BssHII消化和再连接形成的。图11构建体的DNA序列是SEQ ID NO :18， 而SEQ ID NO :17还显示了翻译的肽的序列。图Im的构建体是通过将图Ii的序列的Afel/ BssHII片段克隆到图Ih的Afel/BssHII线性化序列中来形成的。图Im构建体的DNA序列是SEQ ID N0:20，而SEQ ID NO 19还显示了翻译的肽的序列。以上构建体可由本领域技术人员使用常规技术来制备。实施例2哺乳动物细胞的转染、克隆选择和GLP-I表达细胞来源HEI^93(人胚肾细胞系，#ACC305，DSMZ Cell Culture Collection, 德国)、AtT20(小鼠 LAFl 垂体腺肿瘤细胞系，#87021902, European Cell Culture Collection，UK)，hTERT-MSC 细胞由丹麦 University Hospital of Odense 的 Kassem 教授生产并提供。对于IO6个细胞的转染，使用具有不同的GLP-I构建体的0.5-2 μ g质粒DNA。所述构建体是如实施例1所述产生的。通过如描述于Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人.1994ff Harvard Medical School Vol2. ,Unit 9. 1)中的标准磷酸钙共沉淀法转染 HEK293 细胞。如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人，1994ff，Harvard Medical School Vol 2. ,Unit 9.4)所述使用 FuGene (Roche)转染 AtT20细胞。hTERT-MSC细胞的转染使用一种非病毒方法即Nucleofeetor技术(Amaxa)进行，所述方法是以电参数和细胞类型特异性溶液的组合为基础的。使用Nucleofector装置 (程序C17)，实现了 > 60%的Nucleofector溶液VPE-1001转染效率。转染48小时后，用 DNA稳定整合到染色体中的细胞克隆体的选择通过将选择剂灭菌素Qyg/ml)添加到培养基中来进行。12-15天后，稳定转染的细胞克隆体可以被分离和扩增用于表征。不同的GLP-I构建体的瞬时表达在hTERT-MSC和HEK293细胞中测定。而在单体 GLP-I构建体#103和#317中仅发现边缘活化GLP-I水平(仅具有GLP-I (7-37)的一个复本)。在hTERT-MSC和HEK293细胞中表达的巨大增加可在二聚体GLP-I构建体#217 (具有 GLP-I (7-37)作为组件(I)和作为组件(III))中发现。结果汇总于图2。构建体到GLP-I 构建体#159的延伸(具有4个IP2复本作为组件(II))没有导致进一步的显著增加(未示出)。在用不同构建体转染hTERT-MSC细胞之后，选择稳定表达GLP-I的克隆体。表达水平显示于表1。表1
构建体细胞克隆体活化的GLP/I06个细胞 小时 [pmol]#103 CLPIl7j7149TM113/130.4#317 CLPT(7.,71-IP2-1 Iaa71TM169/10.6#217 CLPT ,7 37,-IP2-CLP1(7J i79TM217/132.7实施例3由哺乳动物细胞分泌的GLP-I肽的蛋白印迹分析
来自分泌GLP-I的细胞的细胞培养上清液在10%-20%梯度的SDS PAGE(120V，90 分钟)中分离，并通过半干印迹法转移到PVDF膜(Immobilon-P膜0. 45 μ m Millipore IPVH 00010) (2.0mA/cm2，60 分钟)。甲醇固定并封闭(在 TBS 中 3% (w v)BSA,0. 1% (ν ν) 吐温-20)后，使膜用 1 μ g/ml 抗-GLP-I 抗体(HYB 147-12，Antibodyshop)在 4°C ο/η 下免疫印迹。洗涤并在RT下与0.02 μ g/ml检测抗体(Anti Mouse IgG，HRP轭合的，Perkin Elmer PC2855-1197)培养4小时后，化学发光检测显示蛋白质的位置。蛋白印迹分析显示于图3(1 IOOng溶解于模拟转染的hTERT-MSC细胞的上清液中的合成的GLP-I (7-37)，2 来自构建体#217的分泌二聚体GLP-I的hTERT-MSC细胞(克隆体79TM217/13)的上清液，3 来自构建体#217的分泌二聚体GLP-I的AtT20细胞(克隆体81-A-217/3)的上清液；M 预先染色的蛋白质标记[kDa])。结果显示，含有GLP-I (7_37) 和C-末端附件的肽(图3中的2和3)由转染的细胞系分泌并且可使用抗-GLP-I抗体检测，所述抗体结合GLP-I (7-37)的中间分子表位。实施例4人细胞分泌的GLP-I肽的体外血浆稳定性HEK293和hTERT-MSC细胞用编码异源基质降解酶信号序列的构建体转染，所述构建体连接到编码以下肽的GLP-I变体1 =GLP-I (7-37)(构建体 #103)2 =GLP-I (7-37)-IP2-延长有 11 个氨基酸(构建体 #317)3 =GLPl (7-37) -IP2-GLP1 (7-37)(构建体 #217) 在37 °C和5 % CO2下，使含有细胞分泌的GLP-I肽或者合成的GLP-I (7-37) (Bachem)的细胞培养物上清液(superrT cont)与含有二肽基肽酶活性的富含人淋巴细胞的血浆培养3小时或者再加6和9小时。模拟转染的细胞的上清液中的合成的GLP-I (7-37) 用作DPP-IV活性的阳性对照，其显示被添加的DPP-IV抑制剂(#DPP4，Biotrend)所抑制。 活化 GLP 使用 GLP-I (活化的)ELISA (#EGLP-35K，Biotrend)、使用结合到 GLP-I (7-37)识别DPP-IV退化的、失活的GLP-I (9-37)肽的GLP-I (7-37)的N-末端表位的抗体来测定。结果显示于图4 (HEK293 细胞)和 5 (hTERT-MSC 细胞)。HEK293 和 hTERT-MSC 细胞对于基因构建体均是有效宿主。对于转染的细胞，结果编号是，1 来自构建体#103的分泌 GLP-I (7-37)的细胞的上清液，2 来自构建体#317的IP2和11个氨基酸延伸的分泌GLP-I 的细胞的上清液，3 来自构建体#217的分泌二聚体GLP-I的细胞的上清液。虽然构建体1 产生以类似于合成的GLP-I的方式通过DPP-IV失活的野生型GLP-1，但是C-末端延长的 GLP-I形式(图4中的2和3，图5中的3)更加耐降解。所述C-末端延长的GLP-I肽在体外人血浆中被显著稳定化。具有二聚体GLP-I序列(3)的肽在体外对DPP-IV降解几乎完全稳定。实施例5通过cAMP释放测定的GLP-I肽的体外生物活性GLP-I (7-37)通过7次跨膜穿越的、G蛋白偶联的GLP-I受体发挥其生物学作用， 其通过第二信使环AMP导致蛋白质激酶A发信号的活化。为了确保CMl的C末端延伸不干扰GLP-I的作用模式，在体外生物学分析中对CMl生物活性定量，所述分析法测定了在与不同浓度的肽培养之后在表达GLP-I受体的细胞系中cAMP的增加。用于该研究的表达GLP-I受体的细胞系(克隆体111CH0349/18)是用人GLP-I受体稳定转染的CHO(中国仓鼠卵巢) 细胞系。79TM217/18K5细胞中产生的CMl对肽的生物活性的剂量响应曲线显示于图7。在 cAMP生物分析中产生半数最大效应(ED50)的肽的剂量已测定为353pM。实施例6GLP-Icm肽的体外人血浆稳定性合成的GLP-I 肽(SEQ ID NO =Isyn, SEQ ID NO :6syn，SEQ ID NO -Jtec, SEQ ID NO 8syn)以20ng/ml的浓度与人血浆在37°C和5% CO2下培养3小时。血浆的二肽基肽酶活性受 DPP-IV 抑制剂(#DPP4, Biotrend)的抑制。使用 GLP-1 (活化的)ELISA(#EGLP_3^(， Biotrend)测定活化 GLP。与天然GLP-I(7_37) (SEQ ID NO 1)相比，C-末端延长的 GLP-1 肽 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8在体外在人血浆中被显著稳定化(图7)。作为对照(在右手侧)， 显示了添加DPP-IV抑制剂的实验所获得的结果。在这些对照实验中，GLP-I活性完全保留。实施例7质粒创建瞬时和稳定基因表达的载体由两个分离的转录单元组成，一个用于感兴趣的基因 (GOI)，一个用于自杀基因HSV胸苷激酶和抗性基因灭菌素的融合。对于第一转录单元，使用人泛激素B启动子，对于第二转录单元，使用人铁蛋白启动子。质粒基于具有7，919个碱基对的质粒PCM4，其示意地表示于图8中。如图8所示，转录单元1包括以下成分CMVenh 即刻早期增强子人细胞巨化病毒UbiB人泛激素启动子BStro-GLP 融合基因，编码基质降解酶和GLPI构建体的信号肽和引导序列ori pMBI 大肠杆菌最低复制起始区。Hygro 潮霉素B抗性基因。转录单元2，SV40 enh :SV40 增强子。FerH 与鼠EFI基因的5，UTR组合的人铁蛋白H启动子。Tk-bla 编码1型单纯疱疹病毒胸苷激酶和灭菌素抗性基因的融合基因。为了瞬时表达，使用环状质粒。为了筛选稳定表达的细胞克隆体，使质粒线性化， 并清除细菌序列(PMB1源和潮霉素基因)。实施例8间充质干细胞系或间充质基质细胞系(MSC)的产生。间充质干细胞系是由丹麦University Hospital of Odense的Kassem教授(发表于 Simonsen 等人，2002，Nature Biotechnology 20m，592-596)根据以下标准产生来源产物细胞系由健康男性供者(33岁)的骨髓抽吸物分离的间充质干细胞(MSC)组成。永生化通过引入端粒酶逆转录酶的编码序列来使细胞永生化。逆转录病毒转导通过将GCsam逆转录病毒载体包裹在PG13中进行，在所述载体中，转基因的表达由Moloney鼠白血病病毒长末端重复序列驱动。在培养的第9天(PDL 12)进行转导。迄今为止细胞系被培养直到沈0的群体倍增数水平(PDL)。通过荧光原位杂交和索瑟恩斑迹法(southern blot)测试插入部位。在染色体 5(5q23-31)上仅有一个异位的(ecotopic)hTERT的插入部位。在PDL 186处进行分析。吉姆萨显带技术和比较基因组杂交揭示，hMSC-TERT在PDL 96处不产生任何数目或结构的染色体异常，并维持正常二倍体雄性核型。在皮下植入6个月后在免疫缺陷小鼠中检测致肿瘤性，发现PDL80为阴性。流式细胞计量法(FACS)分析使细胞在标准生长培养基中培养到80%融合。使细胞胰蛋白酶化(typsinised) 并通过FACScan流式细胞测定器(Becton-Dickinson)分析大小和粒度。对于表面标记研究，使胰蛋白酶化的细胞在冰上用直接轭合于荧光染料(FITC-轭合的小鼠抗人CD44单克隆抗体，#CBL1MF，Cymbus Biotechnology ；藻红蛋白-轭合的小鼠抗人⑶166单克隆抗体，#559263，BD Pharmingen)的抗体染色30min。清洗样品，再用1 %多聚甲醛固定直至用 FACScan (Becton-Dickinson)分析。表征像其未永生化负体那样，永生化细胞仍然能够分化成脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞(参见图9A)。永生化细胞具有成纤维细胞性形态，并且在大小和粒度方面如通过例如使用⑶44和⑶166表位标记经流式细胞计量法显示的与人类MSC有更多的同质性，这是本文所用原代细胞的特征。永生化细胞表达与其未永生化负体相同的CD标记(参见图9B)。培养含有血清的介质7% Earles MEM10% FCS2mM L-谷氨酰胺ImM丙酮酸钠100U/ml 青霉素0. lmg/ml 链霉素群体倍增在沈小时与30小时之间。转染和克隆选择对于IO6个细胞的转染，使用具有不同的GLP-I构建体的0.5-2 μ g质粒DNA。通过标准磷酸钙共沉淀法转染HEK293细胞。使用FuGene (Roche)转染AtT20细胞。hTERT-MSC细胞的转染是使用一种非病毒方法即Nucleofector技术(Amaxa 公司)来进行的，所述方法是以电参数和细胞类型特异性溶液的组合为基础的。使用 Nucleofector 装置(程序 C17)和 Nucleofector 溶液 VPE-1001，实现了 > 60% 的转染效率。转染48小时后，通过将选择剂灭菌素Qy g/ml)添加到培养基中来进行DNA稳定整合到染色体中的细胞克隆体的选择。12-15天后，稳定转染的细胞克隆体可以被分离和扩增用于表征。表达
不同的GLP-I构建体的瞬时表达是在hTERT-MSC和HEK293细胞中测定的。活化 GLPl 水平可见于单体 GLPl 构建体 #103 (Stro-GLPl (7_37))和 #317 (Stro-GLPl(7_37)-IP2_ 延长有11个氨基酸)中，在hTERT-MSC和HEK293细胞中，表达的巨大增加可见于二聚体 GLPl 构建体 #217 (Stro-GLP 1(7_37)-IP2-GLP1(7_37))中。构建体 #317 到四聚体 GLPl 构建体 #159 (Stro-GLPl(7_37)-IP2Gx)-11个氨基酸)的延伸产生类似活性(也参见上述图2)。在用不同构建体转染hTERT-MSC细胞之后，选择稳定表达GLPl的克隆体(参见上文图4和5， 实施例4)。实施例9包裹使用？85( 六六，奥地利)洗涤待包囊的培养细胞，并使用胰蛋白酶/EDTA(PAA，奥地利)分离。使用培养基将反应快速中止(取决于细胞类型，例如RPMI、PAA，奥地利)，并使细胞混悬物离心出来(8min，1，200rpm)。使颗粒重新混悬于PBS中并测定细胞计数。再次离心出期望量的4x IO7个细胞(8min，1，200rpm)。然后通过抽吸完全去除PBS，并在没有空气泡的情况下将50 μ 1颗粒重新混悬于用5mM 1-组氨酸缓冲至7. 4的pH的50 μ 10.9% 盐水中。将这一细胞混悬液置于900 μ 1的1. 5-1. 7% (w/v)藻酸钠溶液中(使用在室温下 0. 2% (w/v)含水溶液具有大约5mPa. s的粘度的藻酸盐)。为了使重新混悬的细胞与藻酸盐溶液混合，将溶液吸到Iml带有套管的注射器中，并通过反复缓慢吸取和排出的方式与细胞均勻混合。得到4X107个细胞/ml的细胞浓度。为了产生具有约200 μ m直径的微囊，在充气喷嘴中使用具有120 μ m内径的套管。 具有2. Omm开口的空气环以螺丝拧紧于内部套管上。该装置是WO 00/09566所述装置的修改版。使均质的细胞/藻酸盐溶液混合物通过所描述的喷嘴滴下。为此目的，将含有所述混合物的Iml注射器通过路厄(Iuer)接头置于套管上。以50 μ 1/min的速度使细胞/藻酸盐溶液混合物压缩通过套管。以2.51/min的速度使空气流通过外空气环。使所得微囊沉淀于含钡沉淀浴(20mM BaCl, 5mM L-组氨酸，124mM NaCl, pH 7. 0士0. 1，290m0smol 士3) 中，所述沉淀浴设置于喷嘴下大约IOcm处。在含钡沉淀浴中停留5min之后，在每一情况下将微囊用20mlPBS洗涤5次。然后将500μ1的单层微囊置于500μ1的与上文用于核芯的溶液相同的 1.5-1.7% (w/v)藻酸盐溶液中，并混合均勻。将这一混悬液置于Iml注射器中，并通过路厄接头连接到喷嘴的内部通道(内径200 μ m)，以50 μ 1/min的速度压缩通过内部通道。 将含有1. 5-1. 7%藻酸盐溶液的5ml注射器通过路厄接头连接到第二内部通道(内径 700 μ m)，以250 μ 1/min的速度压缩通过第二内部通道。以2. 91/min的速度使空气流通过外空气环。使所得微囊沉淀于含钡沉淀浴OOmM BaCl, 5mM L-组氨酸，124mM NaCl，pH 7. 0士0. l，290m0smOl士3)中，所述沉淀浴设置于喷嘴下大约IOcm处。在含钡沉淀浴中停留 5min之后，在每一情况下将微囊用20ml PBS洗涤4次，再用培养基洗涤1次。通过这一方法制备具有大约180-200 μ m的总直径的两层微囊(包括藻酸盐层)，其中内部的含有细胞的核芯的直径为120-150 μ m。在核芯中细胞的浓度为大约虹IO7个细胞/ml藻酸盐。这样得到具有 0. 002-0. 004 μ 1珠体积的、每个珠含有大约100个细胞的(球形)微囊(细胞珠)。编码和分泌GLP-I的(球形)微囊每小时产生平均0. 2fmol活化GLP-I。在核芯中含有包囊的分泌GLP-I的hTERT-MSC细胞的细胞珠的显微照片显示于图 10中。为了产生具有约600 μ m直径的微囊，将内径400 μ m的套管在充气三通道喷嘴中用于内部通道。将套管固定在内径700μπι的外喷嘴上。将具有1.5mm开口的空气环以螺丝固定于两个内套管上。该装置是WO 00/09566所述装置的修改版。使均质的细胞/藻酸盐溶液混合物通过所描述的喷嘴滴下。为此目的，将含有所述混合物的Iml注射器通过路厄接头置于内部通道上。以300μ Ι/min的速度使细胞/藻酸盐溶液混合物压缩通过内部通道。以2.51/min的速度使空气流通过外空气环。使所得微囊沉淀于含钡沉淀浴QOmM BaCl，5mM L-组氨酸，124mM NaCl，pH 7.0 士0· 1，290m0smol 士 3)中，所述沉淀浴设置于喷嘴下大约IOcm处。在含钡沉淀浴中停留5min之后，在每一情况下将微囊用20ml PBS洗涤5 次。然后将500μ 1的单层微囊置于500μ 1的与上文用于核芯的溶液相同的0. 8% (w/v)藻酸盐溶液中，并混合均勻。将这一混悬液置于Iml注射器中，并通过路厄接头连接到喷嘴的内部通道(内径400μπι)，以50μ Ι/min的速度压缩通过内部通道。将含有 0.8%藻酸盐溶液的5ml注射器通过路厄接头连接到第二内部通道(内径700 μ m)，以 250μ 1/min的速度压缩通过第二内部通道。以2. 91/min的速度使空气流通过外空气环。 使所得微囊沉淀于含钡沉淀浴OOmM BaCl, 5mM L-组氨酸，124mM NaCl，pH 7.0士0.1， 290m0smol 士3)中，所述沉淀浴设置于喷嘴下大约IOcm处。在含钡沉淀浴中停留5min之后， 在每一情况下将微囊用20mlPBS洗涤4次，并用培养基洗涤1次。通过这一方法制备具有大约600 μ m士 100 μ m的总直径的两层微囊(包括藻酸盐层)，其中内部的含有细胞的核芯的直径为380 μ m士20 μ m。在核芯中细胞的浓度为大约2_3 X IO7个细胞/ml藻酸盐。这样得到具有0. 065-0. 180 μ 1珠体积的、每个珠含有大约1000个细胞的球形微囊(细胞珠)。 具有分泌GLP-I的细胞的细胞珠每小时产生平均5fmol的活化GLP。实施例10C-末端延长的GLP-I的抗细胞凋亡功效C-末端延长的GLP-I类似物CMl的细胞保护功效使用大鼠胰岛素瘤细胞系 Rin-5F在体外测试。将40，000个RIN-5F细胞经96孔播种，再在用1 % L-谷氨酰胺和10% 胎牛血清补充的RPMI中培养2天。在转变成无血清条件(补充1 % L-谷氨酰胺的RPMI) 后，在不同浓度的大肠杆菌产生的重组二聚体GLP-I融合肽CMl存在下，通过添加蛋白质生物合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)诱导细胞凋亡。对小时之后，使用AlamarBlue对细胞存活力定量。在InM GLP-I类似物CMl存在下，已经观察到显著的抗细胞凋亡效果(ρ < 0. 01)。 结果给于图10。实施例11产生GLP-I的h TERT-MSC细胞系的细胞因子谱为了研究与GLP-I无关的、细胞保护的效果，针对细胞因子、趋化因子和生长因子的分泌检测分泌GLP-I的细胞系79TM217/18K5细胞系。所述细胞系得自人基质细胞，并因此分泌特征性的细胞因子谱。多重分析试剂盒 (Biosource Cytokine 30-plex)用于同时测定30最大量的人细胞因子、趋化因子和生长因子。关于细胞因子 IL-1RA、IL-I β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL 7、IL-10、IL_12(p40/ p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、EGF、嗜酸粒细胞亲和素、FGF-碱性、IFN_a、IFN γ , GM CSF、G-CSF、HGF、MIG、MIP-b、MIP-I α、RANTES 和 TNFa (各分析物的检测限为20pg 每 IO5 个细胞· 24h)，未发现表达。以可检测水平表达的细胞因子汇总于表1中。表1 生长因子血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子-3 (NT-3)、神经胶质细胞系-衍生的神经营养因子(GDNF)和细胞因子白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)和单核细胞趋化蛋白I(MCP-I)的表达水平。这些因子已使用VEGF ELISA(#ELH-VEGF-001 ； RayBio 公司)、NT-3ELISA (#TBM3，Promega 公司)、GDNF ELISA (#TB22LPromega 公司)以及人IL-6、IL-8和MCP-I ELISA试剂盒(RayBio公司)在CMl分泌细胞系79TM217/18K5 的细胞培养上清液中定量。
权利要求
1.基因工程化为编码和分泌神经保护因子、抗血管形成因子和/或其片段或变体以用于眼内治疗眼疾病或病症的细胞，其中基因工程化为编码和分泌神经保护因子、抗血管形成因子和/或其片段或变体的所述细胞被包囊在球形微囊中。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述神经保护因子选自GLP-I肽或GLP-I融合肽或者其片段或变体，并且所述抗血管形成因子选自内皮抑制素或者其片段或变体。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的细胞，其中所述球形微囊包含球形核芯和至少一个表面包裹层，其中所述球形核芯包含或组成为交联聚合物和细胞的混合物，所述细胞编码和分泌神经保护因子、抗血管形成因子和/或其片段或变体；和其中所述至少一个表面包裹层包含或组成为交联聚合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞，其中所述球形微囊具有约120μ m至约 800 μ m的总直径、约120 μ m至约700 μ m的总直径、约150 μ m至约650 μ m的总直径或约 165 μ m至约600 μ m的总直径，或者甚至约120 μ m至约300 μ m的总直径、约150 μ m至约 250 μ m的总直径、约165 μ m至约225 μ m的或约180 μ m至约200 μ m的总直径，包括约180、 185、190或200 μ m的总直径。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞，其中所述细胞是编码和分泌神经保护因子、抗血管形成因子和/或其片段或变体的间充质干细胞、间充质基质细胞、人间充质干细胞，得自人间充质干细胞、同种异体细胞或自体细胞的分化的细胞。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的细胞，其中所述核芯和/或所述至少一个表面包裹层的所述交联聚合物包含相同或不同浓度的化学上相同的聚合物，其中所述聚合物可进一步具有不同分子量和/或可以是不同交联的。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的细胞，其中所述交联聚合物选自生物聚合物和藻酸盐。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的细胞，其中所述球形微囊包含1个、2个、3个、 4个或5个或者更多个表面包裹层。
9.根据权利要求3至8中任项所述的细胞，其中所述球形微囊包含由聚阳离子组成的另外的外表面包裹层。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞，其中所述神经保护因子和/或其片段或变体是选自下列的GLP-I肽a)包含GLP-I的氨基酸7-35的肽；或者b)包含GLP-I或GLP-I(7-36)酰胺的氨基酸7_36的肽；或者c)包含GLP-I的氨基酸7-37的肽；或者d)包含根据式II的序列的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-X aa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xa a36_Xaa37，其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys> Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或者酰胺或者不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、 Lys、酰胺或者是不存在；或者e)何含根据式III的序列的肽Xaa7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa 23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, 其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val, Leu、lie 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或者是不存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在，或者f)显示与上述根据a)至e)的肽中任一个有至少80%同一性的肽。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞，其中所述神经保护因子和/或其片段或变体是包含组件(I)和(II)的GLP-I融合肽或者其片段或变体，其中组件⑴N-末端基选自由下列序列组成的肽或者包含下列序列的肽a)GLP-I (7-35、7-36 或 7-37)序列，或者b)序歹IjSEQ ID NO 1 ；或者c)包含根据^II的序列或由根据式II的序列组成的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-X aa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xa a36-Xaa37，其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys> Glu、Asn 或 Arg ； Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或者酰胺或者不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、 Lys、酰胺或者是不存在；或者d)包含根据式II的序列或由根据式III的序列组成的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa 23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或者是不存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在；或者e)或者与根据a)至d)的序列中任一项的序列具有至少80%序列同一性的序列；和组件(II)，组件(II)的C-末端基选自至少9氨基酸的肽序列或其功能片段或变体。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述GLP-I融合肽的组件(II)选自a)含有根据SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI), SEQ ID NO :27 (DFPEEVAI)、SEQ ID NO: 28 (RDFPEEVA)或 SEQ ID NO :29 (RRDFPEEV)、SEQ ID NO :30 (AADFPEEVAI)、SEQ ID NO: 31 (ADFPEEVA)或 SEQ ID NO 32 (AADFPEEV)的序列或者与 SEQ ID NO :22、27、28、29、30、31 或32具有至少80%序列同一性的序列的肽序列；或者b)含有根据SEQ ID NO 23 (RRDFPEEVAI VEEL)或 SEQ ID NO 24 (RRDFPEEVAIAEEL)或 SEQ ID NO 33 (AADFPEEVAIVEEL)或 SEQ ID NO 34 (AADFPEEVAIAEEL)的序列或者与SEQ ID NO :23、24、33或34具有至少80%序列同一性的序列的肽序列；或者c)含有根据 SEQ ID NO 2 (RRDFPEEVAIVEELG), SEQ ID NO :3 (RRDFPEEVAIAEELG)、SEQ ID NO: 35(AADFPEEVAIVEELG)或SEQ ID NO :36 (AADFPEEVAIAEELG)的序列或者与 SEQ ID NO :2、3、 35或36具有至少80%序列同一性的序列的肽序列。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的细胞，其中所述GLP-I融合肽的组件(I)和组件(II)直接连接或者通过连接子序列连接。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的细胞，其中所述GLP-I融合肽替代地含有或者除组件⑴和(II)以外另外地含有组件(III)，其中如果组件⑴和(III)以融合蛋白形式存在，则组件(III)可连接到组件(I)的C-末端和/或组件(I)的N-末端，或者其中如果组件(I)、(II)和(III)以融合蛋白的形式存在，则组件(III)可连接到组件(II)的 C-末端和/或组件⑴的N-末端。
15.根据权利要求14所述的细胞，其中组件(III)包含至少4个氨基酸残基，优选至少10个另外的氨基酸残基，更优选至少20或者最优选至少30个，或者其中组件(III)包含至少4个，优选至少10个，更优选至少20个另外的氨基酸残基， 所述氨基酸残基为以下的序列的残基a)如在胰高血糖素原中的GLP-2的N-末端序列，或者b)GLP-I (5-37、6-37 或 7-37)序列，或者c)包含根据式II的序列的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-X aa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xa a36_Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ； Xaa 18 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ； Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或者酰胺或者不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys, 酰胺或者是不存在；或者d)包含根据式III的序列的肽Xaa7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xa a23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-组氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或Arg ；Xaa34是Lys、Glu或Arg ；Xaa35是Gly ；Xaa36是Arg或Lys、酰胺或者是不存在； Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在。e)或者与根据a)至d)的序列中任一项的序列具有至少80%序列同一性的序列，或者其中组件(III)含有或者包含SEQ ID NO :4或5的序列，或者与SEQ ID NO :4或5具有至少80%序列同一性的序列。
16.根据权利要求2至15中任一项所述的细胞，其中所述GLP-I融合肽另外含有或者包含作为组件(IV)的载体蛋白质，特别是转铁蛋白或白蛋白。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的细胞，其中所述GLP-I融合肽包含或组成为选自下列序列的肽序列:SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、 SEQ ID NO 46,SEQ ID N0:47 或 SEQ ID N0:48，或者与 SEQ ID NO :6、7、8、10、11、12、26 或 37至48具有至少80%序列同一性的序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的细胞，其中在所述球形微囊的核芯中的所述细胞被基因工程化为另外分泌选自下列的因子抗细胞凋亡因子、生长因子、VEGF、促红细胞生成素(EPO)、抗血小板药、抗凝血药和抗血栓形成药，和/或分泌以治疗水平通过所述胶囊释放选自VEGF、IL6、IL8、⑶NF、NT3和MCPl的内源性蛋白质或肽如旁分泌因子，和/ 或被基因工程化为另外含有自杀基因。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的细胞，其中眼疾病和病症包括由视网膜退化所致眼疾病和病症，包括视网膜疾病，选自色素性视网膜炎(RP)、黄斑变性(MD)、年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)、视网膜病、糖尿病性视网膜病、斑点水肿、血管内皮和周皮细胞异常、视网膜血管阻塞、青光眼、包括小梁网，以及视神经病，包括小梁网改变和角膜内皮异常，起因于眼新生血管形成、脉络膜新生血管形成的眼疾病，起因于黄斑变性的脉络膜新生血管形成，顽固性和复发性脉络膜新生血管形成，由组织胞浆菌病和病理性近视所致脉络膜新生血管形成，由血管样纹所致脉络膜新生血管形成，前部缺血性视神经病，细菌性心内膜炎，先天性黄斑变性，鸟枪弹样视网膜脉络膜病变，脉络膜血管瘤，脉络膜痣，脉络膜无灌注，脉络膜骨瘤，脉络膜破裂，无脉络膜，慢性视网膜剥离，视网膜缺损，脉网膜小疣，内源性念珠菌属眼内炎，视网膜色素性上皮细胞的外乳头状错构瘤，黄点状眼底，原发性，黄斑裂洞，恶性黑色素瘤，膜增生性肾小球肾炎(II型)，金属性眼内异物，牵牛花椎间盘综合征， 多发性消散性白点综合征(MEWDS)，锯齿缘处新生血管形成，手术显微镜痛，视神经乳头凹陷，光凝固法，斑点状内脉络膜病，风疹，肉状瘤病，匐行性或地图状脉络膜炎，视网膜下液引流，倾斜椎间盘综合征，弓形虫性视网膜脉络膜炎，结核病，或伏格特_小柳_原田三氏综合征，糖尿病性视网膜病所致新生血管形成，非糖尿病性视网膜病，静脉分支闭塞，中央视网膜静脉闭塞，早产儿视网膜病，虹膜发红，新生血管性青光眼，黄斑旁毛细血管扩张症， 镰状红细胞视网膜病，伊尔斯病，视网膜脉管炎，脑视网膜血管瘤病，放射性视网膜病，视网膜冷冻创伤，色素性视网膜炎，视网膜脉络膜缺损，单纯疱疹性角膜炎所致角膜新生血管形成，角膜溃疡，角膜成形术，翼状胬肉或创伤。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的细胞，其中所述球形微囊被植入到或者注射到施用位置，所述施用位置选自待治疗患者的眼，包括眼的组织或区域，包括待治疗患者的眼的受侵袭区域或组织，包括视网膜、虹膜、离虹膜2-3mm的区域或区，包括结膜和巩膜被轻微搅乱之后离虹膜2-3mm的区域或区，眼的玻璃体腔，眼或视网膜的任何表面，虹膜或其组织或周围区域，前房，晶状体囊状袋，视网膜下间隙，脉络膜周隙，眼的内部，或者眼的任何腔室。
全文摘要
本申请涉及编码和分泌适用于(眼内)治疗眼疾病的神经保护因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白质或蛋白质样物质的细胞，例如间充质干细胞或间充质基质细胞或者任何其它适宜细胞。此类眼疾病包括青光眼和其它视神经病症、视网膜疾病，特别是色素性视网膜炎(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病等。本文所用细胞被包囊于(球形)微囊中，所述微囊优选包括核芯和至少一个表面层，以防止所治疗患者的免疫系统反应。本申请还涉及这些(球形)微囊或者本文定义的用于(眼内)治疗眼疾病的此类因子(用于制备(药物)组合物)以用于治疗此类眼疾病的用途。
文档编号A61P27/02GK102438647SQ201080021065
公开日2012年5月2日 申请日期2010年5月11日 优先权日2009年5月12日
发明者克里斯蒂娜·瓦尔坎普, 埃里克·特内斯, 彼得·盖格莱, 松格弘米特拉·潘达-乔纳斯, 约斯特·B.·乔纳斯 申请人:生物相容英国有限公司