肝病的治疗方法

专利名称：肝病的治疗方法
技术领域：
本发明涉及治疗肝病和包括肝硬化和门静脉高血压在内的并发症的方法。具体地，本发明涉及治疗对肝产生直接或间接损害的非恶性肝病如病毒性或中毒性肝炎、脂肪肝的方法，以及用于治疗肝病的组合物。
背景技术：
非恶性肝病包括中毒性肝炎如最常见中毒形式的酒精性肝炎，感染引起的肝炎如病毒性肝炎、脂肪肝，以及不太常见的表征为慢性炎症的免疫性肝病。尝试改善肝功能的治疗总是次于原发性疾病过程治疗，但有许多尝试通过靶向不同病理过程组成来改善功能，所述病理过程包括细胞膜磷脂氧化以及细胞膜渗透性变化引起的细胞肿胀和缺氧。采用的一种关键方法是使用抗氧化剂，由黄酮木脂素如植物提取物水飞蓟素和水飞蓟宾开始(综述见Flora等，1998)。然而，这种黄酮木脂素在酒精性肝病中的功效令人失望(Angulo等，2000)，并有可能产生肝毒性作用(Bass ； 1999)。水飞蓟素的副作用在患者如病毒性丙肝和非酒精性脂肪肝病患者中最严重，所述病例中累积的黄酮木脂素水平报道为健康对象的4或5倍或更多(Schrieber等，Drug Metab. Dispos. 2008年 9月36(9) 1909-16)。水飞蓟素的副作用包括胃部不适、恶心、轻微头痛、腹泻、呕吐和关节痛。还报道了水飞蓟素降低口服避孕药的有效性，在少见情况下所述副作用可包括严重的胃痛、出汗和肌无力。最近，使用了生育酚、双嘧达莫(Novikov等，1991 ;Vargas等，2001) 和一系列新型合成和天然产生的抗氧化剂(Vaidya等，1996)。这些包括了钙阻断剂异搏定、地尔硫卓和氨氯地平(Mason等，1999)，以及尼群地平(Thurman和同事，1998)。首先，认为这些试剂在兴奋性组织如心肌和动脉中时直接作用于肝细胞以阻断钙进入(Liang和Thurman，1992)，然而，很快认识到肝没有电压门控性钙通道，所述通道是这些药物在兴奋性组织中的靶标。因此，如果这些药物作用于肝脏，其需要以不同方式起作用。因而，发现许多钙阻断剂也是有力的抗氧化剂(Heo等，1997)。还推测钙通道阻断剂可扩张肝动脉以增加氧合血到肝的递送(McLean. 1998)。然而，药物如异搏定、地尔硫卓(Liang和Thurman，1992 ；Romero和同事，1994)及其它钙阻断剂的保护效果在分离细胞中出现，并因而独立于血流中药物诱导的改变。尚未确认低剂量口服给药的钙阻断剂对肝动脉血流的效果。还显示地尔硫卓对肝内微血管血流没有影响 (Marteau 和同事，1988)。本文包括关于发明背景的讨论以解释本发明内容。其不视作在任意权利要求优先权日期上承认任何涉及的材料已发表、已知或作为部分公知常识。发明概述我们发现将对线粒体施加钙阻断效果和具抗氧化作用的钙通道阻断剂(具体是地尔硫卓)与源自天然产物的黄酮木脂素共同给予可显著改善肝细胞的功能，所述细胞经处理产生与慢性肝病中所出现类似的变化。据信钙通道阻断剂且具体是地尔硫卓在患病细胞的效果能使细胞更适当代谢黄酮木脂素，从而减少副作用可能。
因此，我们提供治疗肝病患者的方法，包括给予(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂的口服缓释制剂和(ii)至少一种黄酮木脂素。在一个优选实施方式中，钙通道阻断剂是地尔硫卓且给予剂量为10_70mg/天。在另一实施方式中，提供治疗肝病患者的方法，包括给予(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂的口服缓释制剂和(ii)抗氧化有效量的黄酮木脂素。所述黄酮木脂素一般以每天l_5000mg的量给予。在一个实施方式中，也给予硫胺素且所用典型剂量可为每天l_200mg，优选为每天 20-200mg硫胺素。所述钙通道阻断剂和黄酮木脂素可以在同一单位剂量中或分开给予。地尔硫卓采用缓释制剂形式，其在一个实施方式中还包括黄酮木脂素且在另一实施方式中不包括黄酮木脂素，所述黄酮木脂素以缓释或非缓释制剂形式分开给予。本发明还提供治疗和预防肝病的药物组合物，包括(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂和(ii)至少一种黄酮木脂素。所述药物组合物通常是缓释组合物，提供各钙通道阻断剂和黄酮木脂素的缓释。在一个实施方式中，所述缓释组合物可包括l_5000mg的至少一种黄酮木脂素(优选5-3000mg如10-2000mg或50_1000mg)和10-70mg如10_50mg含量的地尔硫卓构成的单
位剂量。在一个具体优选方面，我们发现将对线粒体施加钙阻断效果和具抗氧化作用的钙通道阻断剂(具体是地尔硫卓)与黄酮木脂素如提取自圣奶蓟(水飞蓟(Silybum marianum))的黄酮木脂素共同给予在模拟疾病的实验条件下可显著改善肝细胞的功能和存活。黄酮木脂素如水飞蓟素在患病细胞中通常无效且在患病肝脏中可浓缩至正常健康水平的4或5倍，从而加剧显著副作用的风险。我们认为共给予钙通道阻断剂不仅保护受疾病影响细胞中的细胞膜，还促进至少部分再生功能并改善黄酮木脂素的代谢。水飞蓟素作为亲水性抗氧化剂的作用可补充地尔硫卓抗氧化效果以保护暴露于活性氧(R0Q细胞的细胞膜和线粒体膜。这些效果具有互补性，因为亲水性水飞蓟素主要在形成ROS的胞质水相中，而亲脂性地尔硫卓在ROS通过将磷脂氧化成溶血磷脂而产生损害的细胞膜磷脂内积聚。ROS引起的细胞膜损伤提高了细胞和线粒体膜对水和钙的渗透性， 从而分别产生细胞肿胀、缺氧和钙超载。作为钙阻断剂的地尔硫卓在钙超载情况中抑制钙进入线粒体，因为其抑制线粒体膜中的钙门控性钙通道，所述通道在胞内钙浓度上升时激活。此作用可使受损或疲劳 (tired)细胞继续产生能量(ATP)。此效果在类似疾病情况的条件下对肝细胞功能具有积极影响。水飞蓟素看来对线粒体没有直接效果，除了可通过其抗氧化性质有助于保护膜， 而地尔硫卓对线粒体的能量保护效果通过使细胞能继续代谢水飞蓟素而产生额外的有益作用。通过地尔硫卓的直接线粒体效果保持水飞蓟素代谢具有2个重要的临床结果。首先，其有助于减轻若肝细胞代谢能力降低时肝病条件下可能发生的水飞蓟素副作用。第二， 疾病情况下肝细胞持续代谢水飞蓟素有助于维持肝选择性递送水飞蓟素，因为除了低剂量给予和在缓释制剂中，肝选择性药物递送的一个关键特征是所述药物必须具有由肝首过清除产生的较短半衰期。根据本发明，我们提供治疗患有肝病对象的方法，包括给予(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂和(ii)至少一种黄酮木脂素的口服缓释制剂。本发明还提供(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂和(ii)同为抗氧化剂的至少一种黄酮木脂素在制备治疗肝病的药物中的应用，所述两种成分在一种或多种缓释钙通道阻断剂的组合物中共同给予。本发明还提供治疗或预防肝病的药物组合物，包括(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂和(ii)同为抗氧化剂的至少一种黄酮木脂素。所述药物组合物通常是缓释组合物， 其在数小时，优选8-12或更多小时内释放活性剂(具有抗氧化效果的亲脂性钙通道阻断剂与亲水性黄酮木脂素抗氧化剂)。需要肝选择性缓释制剂，因为许多适用于此治疗的药物有血管活性或具有全身效果，若其优选在肝内浓缩则可避免这种作用。所述低剂量、缓释制剂优选提供的钙通道阻断剂递送率足以在门静脉内产生临床有效血液水平且低于在外周循环产生临床有效水平所需，从而提供对肝有选择性效果的递送率。除了钙通道阻断剂和黄酮木脂素，可分开或同时给予硫胺素。以维生素B这一名称为人熟知的硫胺素在线粒体内作为线粒体保护剂起作用，即作为丙酮酸脱氢酶辅因子，其也是亲水性抗氧化剂。其用于营养不良患者和一些病毒性肝炎患者。将硫胺素添加到具有抗氧化性质的钙拮抗剂中也发挥了维生素对线粒体内能量产生的促进效果和其自身在细胞内的抗氧化效果。发明详述肝脏以静脉血低压灌注。因此，在任何原因的细胞肿胀抑制血流时，其缺氧风险超过体内任何其它器官。肝缺氧是几乎所有非恶性肝病形式的特征，占50%或更多的病理和功能损伤。在炎症中，氧自由基通过炎症过程在细胞外产生。相反，在缺氧中，自由基在细胞内生成(随着NADPH水平升高)。自由基生成区域都在水相中。我们发现通过使用2种不同类型的抗氧化剂即黄酮木脂素与钙通道阻断剂联用， 获得保肝水平，当与单一抗氧化剂来源比较时其特异性提高。这与某一高水平抗氧化剂提供最优保护的通常观念相反。不希望受到理论约束，我们认为所述组合的效果增强可能是由于来自天然产物的抗氧化剂具体是黄酮木脂素的胞内抗氧化效果结合了抗击细胞内低氧自由基的钙通道阻断剂的胞内抗氧化效果。所述组合提供胞内稳定水平的磷脂，其与使用单一试剂相比有显著改善。此外，黄酮木脂素倾向于在患病肝细胞中积聚，其作为抗氧化剂的效果在钙通道阻断剂存在时得以恢复。黄酮木脂素在患病细胞中的代谢也增强，从而降低黄酮木脂素在患有肝病对象中的副作用风险。本发明使用至少一种选自黄酮木脂素的抗氧化剂。水飞蓟宾也称为水飞蓟，是水飞蓟素的主要活性组分，水飞蓟素是提取自圣奶蓟(水飞蓟)黄酮木脂素的混合物。本文使用的术语黄酮木脂素包括水飞蓟素和其活性成分水飞蓟宾，无论是纯化的化合物形式(认为是3，5，7-三羟基-2- (3- (3-羟基-4-甲氧苯基)-2-(羟甲基)-2，3- 二氢苯[b] [1，4] 二恶英-6-基)苯并二氢吡喃-4-酮)或药学上可接受盐如二氢水飞蓟宾双琥珀酸二钠(商品名Legalon SIL，注射液)，以及包合物如β -环糊精包合物和水飞蓟糖苷，其显示更好的水溶性和甚至更强的保肝作用。本发明可使水飞蓟素相关副作用减少或总体消除，以持续使用组合治疗而没有延长的不良效果。所述组合物一般至少每天给予一次，连续至少10天，优选至少20天，更优选连续至少30天。在一个实施方式中，所述组合物包括含有l_200mg硫胺素，优选20_200mg硫胺素的单位剂型硫胺素。肝病患者可能缺乏硫胺素，其可通过以每天l_5mg的量给予硫胺素来治疗。相反，使用相对较高剂量20-200mg远超过治疗维生素缺乏症所需的水平。本发明组合物的该剂量提供显著治疗效果，认为所述效果由相对较高剂量硫胺素的抗氧化作用产生。优选的钙通道阻断剂是亲脂性的以确保其深入渗透细胞且进入膜内，从而其治疗效果位于自由基发挥作用的地方。相反，在胞质或细胞环境内起作用的药物需要更为亲水。 大部分钙阻断药物，包括异搏定、地尔硫卓、氨氯地平和尼群地平都具有抗氧化性质作为膜稳定效果的组成，但地尔硫卓和异搏定较短的半衰期使得这些试剂更适用于制成肝选择性膜稳定剂。优选试剂是作为缓释制剂给予的地尔硫卓，剂量低于每天70mg如每天10-70mg 或每天20-70mg且优选低于每天50mg如每天10_50mg。这些剂量远低于治疗心绞痛和高血压所用药物的剂量。地尔硫卓可采用盐酸盐或其它药学上可接受盐的形式。我们发现地尔硫卓和黄酮木脂素如水飞蓟素的组合相较任一单独药物可保护细胞抵御氧化压力。地尔硫卓、黄酮木脂素和组合药物治疗都与2种细胞类型中ATP水平提高相关，组合药物治疗显示高出许多的保护效果。Bax和Bax mRNA水平通过药物治疗在统计上降低，所述组合再次显示有益效果比任一单独治疗高许多。地尔硫卓和黄酮木脂素的组合相较任一单独药物提供额外的保肝效果。保护性质延伸到降低促调亡蛋白Bax的水平。 因此，我们发现钙通道阻断剂和黄酮木脂素的组合不仅相较各自分开使用时显著改善肝保护，而且令人惊讶的是我们发现所述组合产生有用水平的细胞再生。因此，治疗不仅降低疾病作用，还引起细胞再生和至少部分减少肝病的严重性。地尔硫卓优选以低于治疗心血管疾病处方剂量的一半(更优选低于三分之一)给予。涉及处方药物的医书中提供了治疗心血管疾病的处方剂量。我们具体指澳大利亚版的 MIMS年刊(Australian Edition of MIMS Annual，2001)，其列出了地尔硫卓的平均最优剂量为每天180-M0mg。优选的钙通道阻断剂是膜稳定剂(或试剂组合)，其效果跨数个膜破坏过程主要成分。优选的钙通道阻断剂用作胞内和膜内抗氧化剂，限制钙进入线粒体，抑制磷脂酶活性，促进或维持细胞的能量产生。此外，这些作用优选在缺氧期间随着细胞PH降低而持续运作。总体上，我们认为这些效果用于减少细胞肿胀和缺氧，从而改善肝功能。我们在这些基础上发现地尔硫卓特别优选。所有细胞中的线粒体具有钙门控性的钙通道。所述通道随着胞内钙水平上升而激活，从而钙“分流”入线粒体。该通道不同于兴奋性组织(肌肉和动脉)的电压门控性通道， 但为几乎所有钙阻断剂(钙拮抗剂)所抑制。肝病患者常具有较低的正常血压，需要确保治疗不使血压降低到可能引起疲劳和肝功能损伤的水平。
肝选择性药物递送短效钙阻断剂是解决高血压和疲劳风险的一个方法，但地尔硫卓作为苯并噻嗪且与异搏定和二氢吡啶相反，在血压正常患者中产生很小的降血压影响并因此较其它钙拮抗剂更优选。亚细胞研究显示地尔硫卓的保护效果看来在其浓度远高于全细胞研究所用浓度或口服给药后观察到的药物血浆浓度时出现。然而，所述药物的亲脂性质意味着膜吸收药物，在膜和血浆间获得100 1或更高的浓度梯度。这也解释了为什么在药物用于细胞培养物后可能需要2小时或更长来显现线粒体钙阻断效果。地尔硫卓是顺式-(+)-3-(乙酰氧基)-5-[2_( 二甲氨基)乙基]-2，3_ 二氢-2- (4-甲氧苯基)-1，5-苯并硫氮杂革-4 (5H)-酮，在本文中称为“地尔硫卓”，其是具有钙拮抗活性的苯并噻嗪衍生物。因此，地尔硫卓在临床上用于阻断钙离子流入平滑肌和心肌并因而产生潜在的心血管效应。显示地尔硫卓用于缓解慢性心脏病症状，具体是心绞痛和心肌缺血及高血压，而副作用发生率较低。这些应用中，地尔硫卓可采用盐酸地尔硫卓， 以强度为30、60、90和120mg的片剂形式，和强度为60、90、120、180、240和300mg的胶囊形式。地尔硫卓还采用5mg/ml浓度的注射形式。治疗心血管疾病的地尔硫卓疗法通常起始于30mg，每天给予4次。所述剂量逐步增加到180-360mg/天，以分剂量每天给予3或4次，间隔1_2天直至获得最优响应。地尔硫卓由肝脏广泛代谢。根据玛瑞恩公司(Marion Merrell Dow he.)发布的专业应用信息，CARDIZEM. RTM.品牌片剂中的地尔硫卓吸收约80%，且受到广泛的首过作用，相较静脉内给药产生约40%的绝对生物利用度。30-120mg单一口服剂量的CARDIZEM. RTM.地尔硫卓片剂在给药后2-3小时产生峰值血浆水平。给药后30-60分钟内产生可检测的血浆水平表明CARDIZEM. RTM.地尔硫卓片剂易吸收。单次或多次给药后的血浆消除半衰期约为3. 5 小时。CARDIZEM. RTM.地尔硫卓片剂的治疗血液水平看来为50_200ng/ml。与现有技术的钙通道阻断剂制剂相反，视作阻碍心血管疾病有效治疗的药物如地尔硫卓的首过清除在治疗肝病中成为优势，因为其可使药物的临床效果限于肝脏。因此，特别优选钙通道阻断剂以低剂量存在且作为缓释制剂以提供门静脉中的临床有效血液水平和低于在外周循环产生临床有效水平所需的剂量。因此，本发明的方法和组合物提供对肝具有选择性效果的递送率。该肝保护方法联用地尔硫卓和黄酮木脂素及任选的硫胺素，可用于因存在氧化试剂或氧化过程而出现原发或继发性细胞膜受损的任何肝疾病状态。使用这些膜稳定剂的肝选择性制剂可补充原发病治疗。地尔硫卓的直接线粒体效应能在疾病情况下保护肝功能，还对水飞蓟素的代谢清除有临床上重要的影响。首先，它有助于减少若肝细胞代谢能力降低时肝病条件下可能发生的水飞蓟素副作用。第二，疾病情况下肝细胞持续代谢水飞蓟素有助于维持肝选择性递送水飞蓟素，因为除了低剂量给予和在缓释制剂中给予外，肝选择性递送的一个关键特征是所述药物必须具有由肝首过清除产生的较短半衰期。适当时这些保肝剂可与主要疾病治疗所用的治疗剂共开处方或共配制，所述治疗剂如治疗丙肝的病毒唑或其它口服给药的抗病毒剂。因此，本发明还提供治疗或预防肝病的方法，通过与其它活性剂如用于治疗门静脉高血压或病毒性肝炎的活性剂一起共给予或共配制本发明中详述的保肝治疗，该治疗包括钙通道阻断剂和抗氧化剂如地尔硫卓与至少一种黄酮木脂素的肝选择性制剂，其中任选包含另一抗氧化剂如硫胺素，其相较钙通道阻断剂更亲水。所述组合物的2种组分即钙通道阻断剂与黄酮木脂素可共配制或以单独组合物给予。所述试剂可通过相同途径(具体是口服给药)或不同途径给予。例如，一种活性剂可经静脉内或胃肠外给予而钙通道阻断剂经口服给予。在本发明的方法和组合物中，硫胺素在使用时可采用盐形式如盐酸盐或其它药学上可接受的衍生物。中毒性肝炎患者吸收硫胺素的能力受损，尽管血液中较低的硫胺素浓度通常难以测量。因此，在患病肝脏细胞中线粒体能量产生严重受阻。在本发明的一个具体优选实施方式中，至少一种选自用于治疗门静脉高血压的试剂或抗病毒剂的药剂与钙通道阻断剂、黄酮木脂素和任选的硫胺素共配制。在另一实施方式中，本发明提供治疗或预防中毒性肝炎(例如酒精性肝炎，还包括脂肪肝)的方法，包括共给予钙通道阻断剂和硫胺素的肝选择性制剂。如果亲水性的硫胺素与钙通道阻断剂成分共配制，其特别有利。因此，在优选的实施方式中，我们提供治疗中毒性肝炎的组合物，包括钙通道阻断剂如地尔硫卓和黄酮木脂素具体是水飞蓟素、水飞蓟宾和其药学上可接受的抗氧化剂衍生物的肝选择性制剂。优选的钙通道阻断剂是量为20_70mg/天的地尔硫卓，更优选25_50mg/天。黄酮木脂素如水飞蓟宾或水飞蓟素的日剂量为l-5000mg/天且优选10-2000mg/ 天。在本发明的一个实施方式中，地尔硫卓黄酮木脂素的日剂量比为 50 1-1 120 且更优选 2 1-1 120。使用硫胺素时，优选其含量提供每天l_200mg的递送且更优选每天20_200mg。在本说明书的描述和权利要求中，单词“包括”和该单词变体如“包含”和“含有” 不用于排除其它添加物、组分、整数或步骤。使用维生素硫胺素在线粒体中加入补充性线粒体效应，在所述线粒体中作为丙酮酸脱氢酶辅因子促进能量生成。此疗法可用于在肝脏受到任何形式慢性非恶性疾病损伤时保护肝脏和维持肝功能，在这些慢性非恶性疾病中细胞膜受到原发或继发性过程损伤从而肝细胞肿胀足以阻碍门静脉血流并弓I起肝缺氧。本发明治疗可应用的疾病包括所有形式的病毒性肝炎(包括乙肝和丙肝)、酒精性肝病、肝硬化、中毒性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪肝、化疗或放疗期间持续的肝损伤、肝老化。肝内细胞膜结构和功能的进行性退化是几乎所有形式的慢性、非恶性肝病的关键组成。它引起肝功能的总体损伤，导致细胞死亡，补充或提高原发病过程的效应。肝选择性药物递送的构想需要半衰期较短的药物以低剂量和缓释制剂给予。这与肠包衣很不同且随着药物通过小肠提供了优选至少8小时且至多M小时的释放。穿越胃肠壁后，药物到达相对小体积的门静脉系统且被携带到肝脏。在此通过代谢从循环中移除显著部分，剩余部分进入体积大许多的全身循环。如此，获得稳定的浓度梯度，其中肝和门脉循环中的药物浓度比全身循环至多高5倍或更多。所得浓度梯度可在硬化或其它缓流门脉循环条件下更高，然而，此效果可能为门脉与全身循环间侧支血管显著生成所抵消。在许多治疗情况下，需要限制药物递送到靶器官。当药物具有涉及其它药理特性的副作用时，这特别重要。在膜稳定剂也是钙通道阻断剂(和强效血管扩张剂)的情况中，其作为肝选择性疗法可避免或最小化有害血管扩张剂和心脏作用，从而增加耐受性和可接受性。肝选择性递送还使所需药物总体日剂量减少到20-25 %的完整全身剂量，所述全身剂量是给予药物达到全身效果时通常需要的剂量。在地尔硫卓的情况中，用于治疗心绞痛和高血压的全身效果所需的剂量通常是 120-360mg/天，每天50mg或更少剂量的地尔硫卓会在肝中保持治疗效果，但在体内其它部分则没有。具有这些特性且包括配制用于肝选择性递送的有或没有硫胺素的包含地尔硫卓的膜稳定剂可用于在以下情况中保护肝脏·病毒性肝炎，包括乙肝、丙肝和其它形式·酒精性肝炎·肝硬化·门静脉高血压·脂肪肝，包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)·毒素、药物和异常免疫状态引起的其它非恶性肝病形式·化疗期间的肝功能障碍·放疗后的肝功能障碍·肝老化。在病毒性肝炎的情况中，肝细胞膜损伤的直接原因是机体对病毒存在的免疫应答 (Loguercio和狗(1吐化0，2003)。这导致自由基生成，损害细胞表面和内部的细胞膜(Jain 等，200 。由此尽管有或没有添加病毒唑(或相关分子)时使用干扰素是必需的抗病毒治疗，需要保护或逆转免疫过程对肝细胞的损伤。因此，具有抗氧化和线粒体效应的肝选择性膜稳定剂可补充初级治疗。此外，在无法负担昂贵的杀病毒疗法的人群中，用肝选择性膜稳定剂如地尔硫卓或可最小化或控制症状的相关分子治疗成为可负担的替代方案。因此，有或没有添加硫胺素的肝选择性膜稳定剂可作为单疗法开处方，与干扰素和病毒唑或其它适当抗病毒疗法共开处方，或与病毒唑或其它口服给药的抗病毒疗法组分共配制从而将2种或所有药物一起作为肝选择性制剂给予。硫胺素(维生素Bi)治疗用于酒精性肝病，因为该疾病患者通常缺乏所述维生素营养。硫胺素作为数个切割碳-碳键的反应的辅酶，所述反应包括肝线粒体内的关键代谢过程(Wilson，1998)。除了修正营养缺乏，硫胺素治疗可改善乙肝和丙肝患者中药物诱导的线粒体损伤(Kontorinis和Dieterich，200 。其它研究显示硫胺素缺乏在酒精性肝病和丙肝引起的硬化患者中普遍，但在无硬化的丙肝患者没有(Levy和同事，200 。然而，显示硫胺素改善乙肝患者的肝功能(Wallace和ffeekS，2001)。这些研究提示所述维生素可能对病毒性肝炎患者的线粒体功能具有保护效应。硫胺素保护效应的另一关键构成是其抗氧化特性，这由于其亲水性分布而似乎在胞质中具有活性。有证据显示硫胺素(维生素)治疗可作为线粒体保护剂协助病毒性肝炎患者 (Wallace AE和W^eeks WB，2001)，具体是在丙肝引起的硬化患者中(Levy等，2002)。肝选择性膜稳定剂和硫胺素的共处方或共配制在这些患者中有效。具体地，我们认为硫胺素以及膜稳定剂的补充性能量促进作用和其抗氧化效果提供了显著的优点。在门静脉高血压和硬化患者中，立即治疗是修正潜在的原发肝病，然后降低血管对门静脉血流的阻力，或用普萘洛尔或其它非选择性肾上腺素拮抗剂立即降低门静脉血流。因此，具有抗氧化剂和线粒体钙抑制的所述组合物可补充此初步治疗。所述组合物可与普萘洛尔共开处方。在其它肝病形式，包括中毒性肝炎、免疫性肝炎和全身性化疗进程期间肝损伤中， 氧化剂和自由基在细胞内外攻击肝细胞膜是所述疾病主要病理机制。这进而引起细胞肿胀，诱导缺氧和细胞及线粒体内第二阶段的自由基生成。放疗也产生自由基。尽管在肝必需或有意辐照时这可能是靶向癌症器官的关键机制，通过门静脉血用低压灌注的正常生理功能使得所述器官特别面临缺氧和功能退化的风险。因此，共同给予钙通道阻断剂和黄酮木脂素可补充药物或毒素撤停、免疫性疾病控制、全身化疗期间的治疗、或放疗后治疗。在老化肝中，肝的氧化特性减少，从而肝保护自身免受饮食中自然发生的氧化作用的能力减弱。这些变化包括线粒体和胞质功能，使得肝面临更大的细胞肿胀、中等缺氧和功能受损的风险。因此，共同给予钙通道阻断剂和黄酮木脂素用于治疗老化肝以协助维持具有任何程度肝功能损伤的老年患者的肝功能。缓释制剂有许多技术可影响活性药剂从口服给药制剂中缓释。这些方法可包括设计用于延迟胶囊、片剂或其它载剂崩解的技术，设计用于阻碍胶囊、片剂或其它载剂溶解度的技术， 活性剂可结合聚合物或其它大分子从而不发生吸附直到所述物质从该聚合物或其它大分子中释放的技术。完成这些不同缓释方法的手段不同且包括熟知的老方法如虫胶包被层， 和使用合成及纤维素聚合物或提供具有至少一个孔的膜包被的更现代化技术。根据本发明的剂型可以是控释剂型。释放这些剂型的机制可通过扩散或侵蚀来控制。在一些实施方式中，所述制剂包括聚合物包衣的多颗粒，聚合物包衣的片剂或迷你片剂，或亲水性基质片剂。设计用作保肝剂的膜稳定药物的缓释制剂可设计成在给药后约6-约M小时释放，从而可每天一次给药并使药物持续接触肝脏。在一些实施方式中，在延长时间段释放药物的制剂可具有1个以上定时释放组分以影响时间覆盖。本发明涉及发现作为缓释制剂给予的低剂量膜稳定剂(包括剂量小于50mg/天的地尔硫卓)的保护效果是通过对肝自身而不是血管系统的直接保护作用来介导，所述药物用作亲脂性抗氧化剂以渗透细胞并保护细胞膜和线粒体免受磷脂氧化的损害影响，并用作线粒体钙拮抗剂。所述缓释组合物可以是前面报道用于治疗心血管病的任何类型，除了地尔硫卓剂量减少到每天20-70mg。如上所述，该缓释组合物还优选包括含量为每天l_5mg的硫胺素。 所述组合物可设计成每天给药一次、每天给药二次或更频繁，具体优选每天给药一次。美国专利号4，721，619,4, 891，230,4, 917，899 和 5，219，62 公开了意在需要每 12 小时给予一次(即每天二次)的地尔硫卓制剂。美国专利号4，894，240和5，002, 776公开了意在需要每M小时给予一次(即每天一次)的地尔硫卓制剂。为获得这些专利中所公开的溶出概况，公开的制剂需要包被中央芯体的多层膜和活性芯体和/或多层膜中的有机酸。这些专利中公开的合适有机酸是己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸。根据玛瑞恩公司发布的专业应用信息，CARDIZEM. RTM.⑶地尔硫卓胶囊是含有 120,180,240或300mg盐酸地尔硫卓的缓释型地尔硫卓胶囊，建议剂量为一天1胶囊。类似地，为获得M小时地尔硫卓释放分布，CARDIZEM. RTM.⑶地尔硫卓胶囊中的小丸包括富马酸、有机酸和包被中央芯体的多层膜。根据上述专利，所述小丸在包被过程期间和之后数小时必须干燥。适用于发明过程的另一方法描述于美国专利5 834 024(HeiniCke等)，其使用短滞和长滞地尔硫卓小丸的组合以提供M小时的均勻地尔硫卓释放。在本发明组合物的一个实施方式中，所述缓释组合物包括含地尔硫卓的芯体和一个或多个聚合物包衣。所述芯体可以且优选包含硫胺素组分。所述芯体可在例如惰性材料如糖丸芯上形成。药学上可接受的粘合剂如羟丙基纤维素可用于所述芯体。一个或多个包衣可含有通透地尔硫卓和水的聚合物及相对较少通透地尔硫卓和水的聚合物。地尔硫卓通透性聚合物示例是合成自丙烯酸和甲基丙烯酸酯的低季铵基团含量的阳离子聚合物，称为EUDRAGIT RL(德国罗姆药厂(Rohm Pharma GmbH)生产)乙基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素(较低，中等或较高分子量)、醋酸丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、三乙酸纤维素、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、 聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、 聚丙烯，聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯基异丁基醚)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氯乙烯或聚氨酯，或这些中任意2种或更多种的混合物。合适的较少通透水和地尔硫卓的天然产生聚合物或树脂包括虫胶、壳聚糖，杜松胶(gumjimiper)或这些中任意2种或更多种的混合物。较少通透地尔硫卓和水的可使用物质包括阳离子聚合物，称为EUDRAGIT RS(德国罗姆药厂生产；EUDRAGIT RS通透性低于EUDRAGIT RL，因为EUDRAGIT RS的铵基团较少) 乙基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素(较低，中等或较高分子量)、醋酸丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、三乙酸纤维素、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚 (丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)、聚乙烯、低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、聚丙烯，聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯基异丁基醚)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氯乙烯或聚氨酯，或这些中任意2种或更多种的混合物。合适的较少通透水和地尔硫卓的天然产生聚合物或树脂包括虫胶、壳聚糖，杜松胶或这些中任意2种或更多种的混合物。除了所述聚合物，包衣层含有润滑剂和湿润剂。优选所述润滑剂是滑石且湿润剂是月桂基硫酸钠。月桂基硫酸钠的合适替代物可包括试剂如阿拉伯树胶、苯扎氯铵、聚西托醇 (cetomacrogol)乳化蜡、十八醇十六醇混合物、鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、多库酯钠、硬脂酸钠、乳化蜡、单硬脂酸甘油酯、羟丙基纤维素、羊毛醇、卵磷脂、矿物油、单乙醇胺、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、藻酸丙二醇酯、山梨聚糖酯、硬脂醇和三乙醇胺，或上述任意2种或更多种的混合物。
所述包衣中可含有的合适滑石替代物是硬脂酸钙、胶态二氧化硅、丙三醇、硬脂酸镁、矿物油、聚乙二醇、和硬脂酸锌、硬脂酸铝，或上述任意2种或更多种的混合物。增塑剂优选包括在所述包衣中以改善聚合物膜的弹性和稳定性并防止聚合物渗透性在长期储存中变化。这种变化可影响药物释放率。合适的常规增塑剂包括乙酰化单甘油酯、乙酰柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、蓖麻油、柠檬酸酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁脂、草酸二乙酯、苹果酸二乙酯、富马酸二乙酯、邻苯二甲酸二乙酯、丁二酸二乙酯、丙二酸二乙酯、酒石酸二乙酯、邻苯二甲酸二甲酯、丙三醇、甘油、三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、矿物油和羊毛脂醇、矿脂和羊毛脂醇、邻苯二甲酸酯、聚乙二醇、丙二醇、菜油、芝麻油、三醋精、柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯和乙酰柠檬酸三乙酯，或上述任意2种或更多种的混合物。柠檬酸三乙酯是目前优选的增塑剂。或者或此外，所述芯体或包衣可包括有机酸，如己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸和富马酸。控释的替代方法是使用膜包被含有活性剂的芯体，所述膜中具有至少一个孔。这种安排由Chen等在US 6，866，866中描述，用以提供每天一次剂量的二甲双胍缓释。Chen 等还在美国专利6，524，620中描述了地尔硫卓的缓释制剂，其可与低剂量的本发明组合物一起使用以治疗肝病。现在参考以下实施例描述本发明。应理解本发明提供所述实施例的目的只是阐述，它们不限制本发明范围。
实施例尽管水飞蓟素组成复杂，但其他研究者已显示可将此植物试剂配制在易侵蚀基质中，所使用的系统是基于单硬脂酸甘油酯和聚乙二醇6000或泊洛沙姆188 (Cheng等2007)。 由此可使用许多制备缓释制剂的标准技术将水飞蓟素和其它植物抗氧化剂与地尔硫卓共配制。本发明的权利要求涉及在缓释制剂中共配制植物抗氧化剂与低剂量地尔硫卓的构想，而不是所用制剂的特定化学性质。对比实施例此实施例比较了地尔硫卓、水飞蓟素和硫胺素分开给予时保护肝细胞抵御活性氧的效果。方法分离的大鼠肝线粒体用低浓度Ca2+孵育以部分解偶联氧化磷酸化，测量氧消耗和受体对照比。用LC质谱测量线粒体外介质的地尔硫卓浓度。通过胶原酶消化分离并在盖玻片和多孔板中培养的大鼠肝细胞用H2O2孵育(以产生活性氧)，用Cobas Fara全自动生化分析仪通过测量乳酸脱氢酶释放来评价细胞活力。结果在用琥珀酸盐作为底物的线粒体中，Ca2+(170 μ M)使受体对照比从3. 3减少到
1.9。D(+)地尔硫卓以210,410和790 μ M浓度预孵育5分钟使受体对照比分别增加到2. 0、
2.3和2. 6。添加线粒体丙酮酸和-酮戊二酸脱氢酶的辅因子-硫胺素，不影响地尔硫卓的作用。实验结束时线粒体外介质中的地尔硫卓浓度检测显示有显著量的地尔硫卓分配到线粒体膜内。所测地尔硫卓浓度在添加205、410和790μΜ地尔硫卓时分别为142 士 14(5)、275士 10(6)禾Π 553士38(3) μ M。分离的大鼠肝细胞用0. 5mM H2O2孵育M小时，诱导87% 的细胞死亡。肝细胞用1 μ M地尔硫卓、1 μ M地尔硫卓+50 μ M硫胺素、50 μ M单独硫胺素、 50 μ M水飞蓟素或100 μ M水飞蓟素预处理2小时，死亡细胞比例分别为5、3、87、88和90%。 因此，地尔硫卓而不是低浓度水飞蓟素，显著降低H2A诱导的肝细胞死亡。结论推断低浓度地尔硫卓有效保护肝细胞免受活性氧诱导的损伤。这可能部分是由于地尔硫卓作用于调节Ca2+移动和保护线粒体合成ATP的能力。在所用条件下，地尔硫卓比低浓度水飞蓟素显著更有效。这些结果表明地尔硫卓可在保护肝细胞免受活性氧和其他试剂诱导的损伤方面发挥重要作用，但水飞蓟素的效果相对较小。实施例1此实施例比较了肝细胞在氧化应激下对地尔硫卓、水飞蓟素和地尔硫卓与水飞蓟素的组合的响应。材料和方法包括d-顺式地尔硫卓、水飞蓟素和二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH2-DA)在内的所有化学物购自密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司(Sigma Chemical, St. Louis，M0)。达氏修正依氏培养基(DMEM)、胎牛血清、青霉素、链霉素购自GIBCO/BRL。MTT(细胞增殖)和ATP 酶试剂盒购自西格玛(密苏里州圣路易斯)。人肝细胞瘤细胞系Chang和PLC/PRF/5细胞购自马里兰州罗克维尔美国模式培养物保藏所(ATCC，Rockville, MD) 0细胞培养和药物治疗Chang和PLC/PRF/5肝细胞瘤细胞在补充有DMEM的25cm2培养瓶中于37°C、95% 空气和5% CO2的湿润大气下维持至少M小时，所述DMEM含有10% FBS(DF-IO)、青霉素和链霉素(50单位/ml)。细胞接种到培养板(IOOmm2)上并接触DF-10培养基和药物处理M 小时以用于蛋白质印迹和RT-PCR研究。对于DCF和MTT试验，细胞在黑色96孔板(美国纽约的康宁公司(Corning))上再次培养，并可在任何药物处理前贴壁8小时。板汇合后， 细胞接触含药物的DF-10培养基M小时。对照细胞不用任何药物孵育。DCF 试验通过活性氧产物如脂质过氧化物将非荧光2’，7’-二氯二氢荧光素(DCFH)转变成高荧光二氯荧光素(DCF)，形成所述试验的基础。活性胞内2’，7’-二氢二氯荧光素(DCFH) 形式的DCFH2-DA如TolIefson等^所述制备。简言之，通过在200 μ L甲醇和100 μ L 2Ν NaOH存在下用100 μ L DCFH2-DA储液室温避光孵育来切割DCFH2-DA的二乙酸盐部分。2小时后，用Ca/Mg-PBS稀释所得DCFH溶液以获得20 μ M的终探测浓度，临用前ρΗ调整至7. 4。H2O2诱导的氧化压力Chang和PLC细胞在96孔培养板(Costar#3603，康宁公司)中以每孔25,000个细胞的细胞密度培养。在DMEM-10 % FBS中过夜孵育后，培养物用PBS洗2次，然后用IOM H2DCFDA在95%空气/5% CO2中37°C孵育30分钟。通过用温和PBS清洗培养物2次来移除胞外H2DCFDA15通过用400M H2O2在含Ca++和Mg++的PBS中37°C避光孵育细胞20分钟，诱导细胞氧化压力。负对照用相同条件进行，但没有H202。DCF信号发出的细胞荧光强度立即用BMG(美国北卡罗来纳州达勒姆)Fluostar Galaxy荧光分析仪G85nm激发波长/520nm 发射波长)测量，配有针对板底部的激发和发射探针。从对照和药物处理细胞的3份培养物中计算平均荧光强度。结果表示为任意荧光单位(AFU)。细胞活力/细胞增殖MTT试验采用MTT试验评价细胞生长和活力。活细胞通过功能性线粒体使MTT (3-G，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑，一种四唑)还原成紫色甲瓒。试验条件如生产商所概述(密苏里州圣路易斯的西格玛)。简言之，Chang和PLC细胞以3xl04个细胞/孔的浓度在96孔板中培养。接触地尔硫卓和/或水飞蓟素M小时和H2A (400 μ Μ, 20分钟)处理后，各孔添加10 μ 1 MTT溶液(10%的培养物体积)。细胞用MTT溶液再孵育3. 5小时， 此时移除所述培养基并将MTT溶剂加入孔内(100 μ 1)。用spectra Max 190(分子仪器公司(Molecular Devices))分析仪定量有色溶液在570nm的吸光度。检测细胞ATP水平采用生物发光试验检测总细胞ATP水平。过程细节如生产商所概述(密苏里州圣路易斯的西格玛)。Bax蛋白质印迹蛋白QOyg)与 4X 凝胶上样缓冲液 GX = 250mmol/L Tris-HCl, pH 6. 8,8% SDS、20%甘油、0. 2%溴酚蓝和5% -巯基乙醇)混合，在还原条件下于15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-聚丙烯酰胺)凝胶上分开，转至Nitroplus-2000膜(微米分离公司(Micron Separations he.)，马萨诸塞州韦斯特伯鲁)。通过在溶于IX Tris-缓冲盐水-土温(TBS-T，每升中2. 42g Tris碱、29. 25g NaCl,0. 5ml 土温20)的脱脂奶粉中室温预孵育膜1小时来封闭非特异性抗体结合。然后用一抗在含5%脱脂奶的IX TBS-T中4°C 过夜孵育膜。一抗对于兔抗Bax的效价为1 1000且对单克隆小鼠抗β-肌动蛋白为 1 3000。然后用辣根过氧化物酶偶联的二抗(用于Bax的山羊抗兔抗体和用于β-肌动蛋白的抗小鼠抗体(1 1000稀释))孵育膜。所述抗原-抗体复合物通过增强的化学发光(ECL系统，安玛西亚公司(Amersham))检测。用NIH成像软件检测各靶蛋白带的光密度 (OD)值。通过归一化肌动蛋白来校正蛋白上样变化。Bax RT-PCR采用TRIzol LS试剂如生产商手册所述提取Chang细胞的总RNA。通过优势 (Advantage) RT-for-PCR试剂盒合成cDNA的第一条链。简言之，将1 μ g总RNA溶于焦碳酸二乙酯处理的双蒸水(ddH20)以获得12. 5μ1终体积。然后，加入Iyl寡(dT)弓丨物、 4 μ 1 5 X反应缓冲液、1 μ 1 10mmol/l dNTP混合物、0. 5 μ 1重组RNA酶抑制剂和1 μ 1莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶，42°C孵育1小时。逆转录过程结束时，反应混合物加热至 94°C持续5分钟，加入ddH20至终体积100 μ 1。用优势(Advantage)PCR试剂盒、聚合酶混合物、GIBC0-BRL(安省伯灵顿)合成的寡芯体苷酸进行PCR。用于Bax的基因特异性PCR 引物购自西格玛(密苏里州圣路易斯)。寡芯体苷酸引物是5’-GTT TCA TCC AGG ATC GAG CAG-3，(有义)，5，-CAT CTT CTT CCA GAT GGT GA-3，(反义)。产物长度是 487bp。特异性大鼠GAPDH扩增引物来自科隆泰克公司(Clontech，5507-3)，预期GAPDH大小为986碱基对。使用艾本德MasterCycler (艾本德公司(Eppendorf)，纽约州韦斯特伯里)进行PCR 扩增30轮的94°C变性45秒、53°C (Bax)和60°C (GAPDH)退火45秒、72°C延伸120秒，再在72°C最终延伸7分钟。用1.2%琼脂糖凝胶分析PCR产物。通过在曼尼托巴细胞生物学研究所DNA测序设备(加拿大温尼伯)测序确认PCR产物特性。
统计分析数据表示为平均值士标准偏差。η值指各研究重复进行数量。数据用单因素方差分析(one-way ANOVA), SNK 事后检验(Student-Newman-Keu 1 s post hoc test)采用 ρ
<0. 05作为显著性水平(统计显著性设为ρ < 0. 05)。根据附图讨论结果。在图中图l.PLC(图la)和Chang(图lb)细胞在过氧化氢诱导的氧化压力中的DCF荧光。细胞在96孔板中培养。将H2DCFDA(IOM)加样到细胞上30分钟。然后细胞接触400M H20220分钟。测量各孔的细胞荧光并立即记录。数据表示为平均值士标准偏差；η = 7广ρ
<0. 01, ***ρ < 0. 001 ；单尾分布。图2.通过MTT试验评价地尔硫卓和/或水飞蓟素后PLC(图2a)和Chang(图 2b)细胞的细胞生长。细胞在96孔板中培养。数据表示为平均值士标准偏差；η = 7广ρ
<0. 01, ***ρ < 0. 001 ；单尾分布。图3.通过生物发光试验评价对照(无氧化压力处理)、PLC细胞(图3a)和 Chang(图3b)细胞的细胞ATP水平。数据表示为平均值士标准偏差；η = 7。图4.通过生物发光试验评价PLC细胞中的细胞ATP水平。数据表示为平均值士标准偏差；η = 7广ρ < 0.01, ***ρ < 0. 001 ；单尾分布。图5.对照和药物处理Chang细胞中的Bax表达。空白包含无血清培养基细胞而对照包括H2A处理后的含血清培养基。地尔硫卓、水飞蓟素、组合药物处理在Chang细胞中的抗调亡效果。H2O2处理诱导细胞凋亡。Bax活性用作细胞凋亡标记。图6.通过相对肌动蛋白归一化Bax光密度来计算Chang细胞中的相对Bax表达。 数据表示为平均值士标准偏差；η = 7 ;*ρ < 0. 05，**ρ < 0. 01，***ρ < 0. 001 ；单尾分布。图7.对照和药物处理Chang细胞中Bax和上样对照GAPDH的RT-PCR图像。胞内自由基水平用二氯荧光素(DCF)试验评价细胞自由基水平。

图1显示来自H2O2诱导的氧化压力的DCF荧光，对于PLC细胞(顶部)用地尔硫卓O. 5和10 μ M)、水飞蓟素(10和IOOOyg/ L)或地尔硫卓O. 5μΜ或ΙΟμΜ)和水飞蓟素(1000 μ g/L)组合处理，或者Chang细胞 (底部)用地尔硫卓0.5μΜ)和水飞蓟素(1000 μ g/L)或地尔硫卓(10 μ M)和水飞蓟素 (10 μ g/L)处理。地尔硫卓和水飞蓟素都使PLC和Chang细胞中的自由基水平在统计上减少(p<0. 05)。地尔硫卓和水飞蓟素处理之间的DCF荧光没有统计学差异。地尔硫卓和水飞蓟素的组合还使DCF荧光较图1所示单用水飞蓟素或地尔硫卓减少(P < 0. 001)。细胞增殖用来自西格玛的MTT试剂盒评价细胞活力和增殖。图2显示地尔硫卓和水飞蓟素都使细胞增殖较对照(无药物处理)水平在统计上增加(P <0.001)。添加水飞蓟素 (1000 μ g/L)到2. 5 μ M地尔硫卓进一步提高细胞增殖(P < 0. 001)。将地尔硫卓浓度增至 10 μ M较使用2. 5 μ M不再产生增殖上的任何增加。细胞ATP水平为了理解地尔硫卓、水飞蓟素、地尔硫卓和水飞蓟素的组合的保护性质，我们研究了药物处理后的细胞ATP水平。图3显示对照组(无氧化压力)中药物处理不显著影响细胞ATP水平。然而，如图4所示，氧化压力(H2O2处理)后的ATP水平显著高于对照(无药物处理)。2. 5μ M地尔硫卓和10μ M地尔硫卓间没有显著差异。水飞蓟素本身也显著增加ATP水平(ρ < 0. 01)。将水飞蓟素加入地尔硫卓还使ATP水平相较单独地尔硫卓(ρ < 0. 001)或单独水飞蓟素(ρ < 0. 01)提高。当地尔硫卓剂量增加(2. 5 μ M到10 μ Μ)和水飞蓟素(1000 μ g/L)，ATP水平没有统计学提高。Bax7jC 平为了进一步理解地尔硫卓和水飞蓟素的保护性质，我们研究了药物处理是否影响促凋亡蛋白Bax。图5显示药物处理后Chang细胞中的代表性蛋白质印迹，而图6概括了所有研究的数据。地尔硫卓O. 5 μ M和10 μ Μ)使Bax水平显著低于对照细胞(无药物处理； ρ <0.001)。2种地尔硫卓浓度间没有统计学差异。水飞蓟素存在时Bax水平减少远高于对照(P < 0. 001)且显著高于地尔硫卓(10 μ M地尔硫卓时ρ < 0. 01，2. 5 μ M地尔硫卓时 ρ <0.001)。地尔硫卓和水飞蓟素的组合进一步减少Bax水平。数据显示地尔硫卓和水飞蓟素的组合相较单独地尔硫卓或单独水飞蓟素提供更多肝保护。Bax mRNA为进一步阐明药物处理的保护性质，我们研究了地尔硫卓和水飞蓟素对Bax mRNA 的影响以理解保护功能是否与抗调亡标记降解或抑制转录相关。图7显示RT-PCR Bax mRNA 的代表性扫描。显然地尔硫卓对Bax mRNA的抑制显著高于单独使用水飞蓟素。小结细胞接触400 μ M H2O2氧化压力20分钟后用DCF荧光评价胞内自由基水平。地尔硫卓在5和10 μ M后显著降低DCF荧光信号，而水飞蓟素则在1000 μ g/L。地尔硫卓和水飞蓟素的组合相较单独药物进一步保护细胞抵御氧化压力(P < 0. 001)。用MTT试验评价细胞活力，显示地尔硫卓和水飞蓟素在统计上提高细胞生长(P < 0.01)，组合还提供进一步的保护效果。通过研究ATP、Bax和Bax mRNA的水平来评价保护效果的性质。地尔硫卓、水飞蓟素和组合药物处理都与2种细胞类型中的ATP水平提高相关联，组合药物处理显示保护效果大许多(P < 0. 001)。药物处理使Bax和Bax mRNA水平在统计上减少，组合再次显示比任一单独处理大许多的有益效果(P < 0. 001)。我们推断低剂量地尔硫卓和水飞蓟素 (1 μ g/ml)提供肝保护效果抵御氧化压力引起的自由基损伤。地尔硫卓和水飞蓟素的组合相较任一单独药物提供额外的肝保护作用。保护性质延伸到减少促调亡蛋白Bax水平。实施例2 地尔硫卓和水飞蓟素的代谢研究此实施例的过程用大鼠肝细胞系H4-IIE细胞系进行。这是一个已良好建立的肝细胞模型。所述细胞系表现出正常分化大鼠肝细胞的所有主要特征。该细胞系用于肝功能的医学生化研究已有20年，其特性不逊色于其它正常新鲜分离的大鼠肝细胞。用采用过氧化氢的已建立方法诱导氧化损伤。塑料多孔板中培养的肝细胞用0. 5mM过氧化氢孵育1 小时，然后在标准孵育条件下于正常培养基中孵育12小时。此方案诱导对靶细胞的氧化损伤。通过测量染料台盼蓝的排除和胞质酶乳酸脱氢酶的释放来评价细胞损伤。为评价肝细胞的水飞蓟素代谢率，细胞用5 μ M浓度的水飞蓟素在正常细胞培养孵育条件下孵育4-10小时。用正常未处理肝细胞和先前用过氧化氢处理以诱导氧化损伤的细胞进行实验。测量通过肝结合和氧化药物代谢酶途径的水飞蓟素代谢，用液相色谱以分开不同代谢物和用质谱以鉴定和定量代谢物。为检验地尔硫卓的效果，在有和没有5 μ M地尔硫卓情况下孵育细胞。用正常未处理肝細胞和如上所述用过氧化氢处理的细胞进行实验。各自在有和没有地尔硫卓情况下孵育。用所述液相色谱和质谱测量水飞蓟素代谢物。通过测量培养基中的乳酸脱氢酶活性来评价过氧化氢诱导的細胞损伤程度。接触氧自由基的细胞显示水飞蓟素代谢。添加低剂量地尔硫卓有助于维持受损细胞代谢水飞蓟素和相关化合物的能力。此效果可联用于保护和提高线粒体功能，能够保持能量生成。地尔硫卓对线粒体的此效果可使肝細胞在接触氧自由基或轻度受损时能比其它情况下更有效代谢水飞蓟素。此发现显著降低来自水飞蓟素和其代谢物增强的副作用风险，并提供甚至在患病肝細胞中具有恒定低水平活性剤、较短半衰期和良好的首过清除的治疗，所述细胞中水飞蓟素和其代谢物本可能増加并导致副作用。
权利要求
1.一种治疗患有肝病对象的方法，所述方法包括给予(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂的口服缓释制剂和(ii)至少一种黄酮木脂素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述钙通道阻断剂和黄酮木脂素在同一缓释制剂中给予。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述黄酮木脂素在分开的口服剂型中给予。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，除所述钙通道阻断剂和黄酮木脂素之外，还共同给予硫胺素。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种黄酮木脂素选自水飞蓟宾、水飞蓟素、提取自圣奶蓟(水飞蓟)的黄酮木脂素、水飞蓟宾的药学上可接受盐如二氢水飞蓟宾双琥珀酸二钠、水飞蓟宾和水飞蓟宾糖苷的包合物；所述钙通道阻断剂是地尔硫卓。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述黄酮木脂素日剂量为 l-5000mg/天且钙通道阻断剂日剂量为10-70mg/天的地尔硫卓。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓释制剂所含单位剂量包括含量 20-70mg的钙通道阻断剂地尔硫卓和含量10-2000mg的黄酮木脂素。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述地尔硫卓黄酮木脂素的日剂量重量比为2 1-1 120。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述地尔硫卓对线粒体的能量保持效果使受损肝细胞能继续代谢黄酮木脂素，从而维持水飞蓟素的较短半衰期和其肝选择性递送。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种钙通道阻断剂是在缓释制剂中，提供的释放机制选自聚合物包衣的多颗粒、聚合物包衣的片剂或迷你片剂、 或亲水性基质片剂。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述钙通道阻断剂和黄酮木脂素在胶囊、片剂或囊片形式的至少一剂中给予。
12.(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂和(ii)同为抗氧化剂的至少一种黄酮木脂素在制备治疗肝病的药物中的应用，所述两种成分在一种或多种缓释钙通道阻断剂的组合物中共同给予。
13.一种治疗或预防肝病的药物组合物，所述组合物包括(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂的口服缓释制剂和(ii)至少一种黄酮木脂素。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述至少一种黄酮木脂素选自水飞蓟宾、水飞蓟素、提取自圣奶蓟(水飞蓟)的黄酮木脂素、水飞蓟宾的药学上可接受盐如二氢水飞蓟宾双琥珀酸二钠、水飞蓟宾的包合物如β -环糊精包合物和水飞蓟宾糖苷。
15.如权利要求13或14所述的组合物，其特征在于，所述钙通道阻断剂是地尔硫卓。
16.如权利要求13到15中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物采用单位剂型，所述单位剂型中包括20-70mg的钙通道阻断剂。
17.如权利要求13到16中任一项所述的组合物，其特征在于，所述地尔硫卓黄酮木脂素的重量比为50 1-1 120，且更优选2 1-1 120。
18.如权利要求13到17中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物采用单位剂型，所述单位剂型中包括50-3000mg的黄酮木脂素组分。
19.如权利要求13到17中任一项所述的组合物，其特征在于，所述至少一种钙通道阻断剂是在缓释制剂中，提供的释放机制选自聚合物包衣的多颗粒、聚合物包衣的片剂或迷你片剂、或亲水性基质片剂。
20.如权利要求13到19中任一项所述的组合物，其特征在于，所述钙通道阻断剂的控释制剂提供的剂量递送率足以在门静脉内产生临床有效血液水平的钙通道阻断剂且低于在外周循环产生临床有效水平所需，从而提供对肝有选择性效果的递送率。
21.如权利要求13到20中任一项所述的组合物，其特征在于，所述钙通道阻断剂与黄酮木脂素一起存在于选自胶囊、片剂或囊片的至少一个单位剂型中。
全文摘要
一种治疗患有肝病对象的方法，所述方法包括给予(i)具有抗氧化效果的钙通道阻断剂的口服缓释制剂和(ii)至少一种黄酮木脂素。
文档编号A61P1/16GK102573864SQ201080046984
公开日2012年7月11日 申请日期2010年10月15日 优先权日2009年10月15日
发明者H·J·史密斯 申请人:霍华德·J·史密斯及同仁控股有限公司