用于预防和治疗黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的组合物和方法

专利名称：用于预防和治疗黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的组合物和方法
用于预防和治疗黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的组合物和方法
I.相关申请本申请要求2009年12月4日提交的美国临时申请No. 61/266，705和2010年4月29日提交的美国临时申请No. 61/329，410的优先权，所述申请的全部内容均以引用的方式并入本文。II.发明领域本发明涉及适用于眼部的视网膜组织的化学组合物，其加强和组织、或重组织视网膜组织的细胞外基质结构从而使组织稳定化，以及稳定和保护衬有布鲁赫膜的视网膜色素上皮细胞层来延缓或阻止黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的发展。更具体地说，本发明涉及化学组合物，其适合加强和组织布鲁赫膜的细胞外基质结构以及稳定和保护衬有布鲁赫膜的视网膜色素上皮层，以维持脉络膜和视网膜之间的屏障的完整性，从而防止布鲁赫膜的破裂。布鲁赫膜的破裂导致(I)视网膜上皮细胞的脱离和死亡，
(2)脉络膜新生血管的形成，和(3)年龄相关性黄斑变性的逐步发展。III.背景年龄相关性黄斑变性(AMD)是最常见的慢性黄斑变性病症。AMD是导致美国65岁以上的人群法定盲的第一大原因，10%的52岁以上的人口和33%的75岁以上的人口患有此病。据报道，全球有2000万到2500万人染上AMD，且随着老年人口快速增长，数字持续增加。预计在未来的30到40年，当前数量会翻三番。AMD存在两种形式湿性(渗出性或血管性)和干性(非渗出性、萎缩性或非新生血管性)。在新的血管形成以提高对缺氧视网膜组织的供血时，湿性AMD(不如干性常见)发生。然而，新的血管十分脆弱易破，导致出血和周围组织受损。中心视力会突然丧失，若不加以治疗，可能会导致所谓的盘状变性。其它症状包括失真、对比敏感度降低和色觉下降。湿性AMD被认为产生于与干性AMD相关的布鲁赫膜的生化和结构变化。干性更为常见，其特征为玻璃膜疣和视网膜色素丧失。玻璃膜疣是小而淡黄色的沉积物，形成于布鲁赫膜上或周围。相较于湿性，干性视力丧失更为平缓且不那么严重。然而，少数干性黄斑变性患者最终发展成视网膜色素上皮地图状萎缩(干性AMD的一种形式，与最佳矫正视敏度的大幅下降有关)。不幸的是，没有已证实的治疗干性AMD的方法。最近一些试验的结果不支持使用激光治疗干性AMD。医生通常观察或监测干性AMD进展为更危险的湿性AMD的最初迹象。如上所述，在湿性AMD早期进行治疗是最成功的。如果可以确定适当的治疗方法，甚至有可能阻止AMD的发展。AMD如上所述，AMD具有两种不同的形式干性和湿性。干性比湿性更常见，大约90%的AMD患者诊断出患有干性AMD。湿性AMD通常导致更为严重的视力丧失。虽然湿性AMD影响约10%的AMD患者，但却占所有源于AMD的严重视力丧失的约90%(国立眼科研究所(National Eye Institute))。在湿性AMD中，异常形成的新血管在视网膜下(从脉络膜)生长，血液和液体渗漏入视网膜和视网膜下腔。该渗漏引起视网膜细胞死亡，促使视网膜中央窝(黄斑中央)结疤，结疤使中心视力产生盲点。干性AMD的特征为玻璃膜疣和视网膜色素丧失。玻璃膜疣是形成于布鲁赫膜上或周围的小而淡黄色的沉积物。视网膜是复杂的多层结构，在功能上可视为两个部分视杆和视锥感光层以及它们的神经联系，其汇聚光线并将光线转化为由视神经传递的电神经冲动；和下面的视网膜色素上皮以及下面的称为布鲁赫膜的基底膜，其共同作用来维持脉络膜和视网膜之间的屏障的完整性。脉络膜是重要的血管膜，位于视网膜和巩膜之间，为视网膜外半层提供主要供 血来源。老化和AMD老化和包括眼睛在内的整个身体的生理变化有关。尽管老化也许和AMD相关或无关，但识别老化过程中发生的视网膜色素上皮和布鲁赫膜之间连接处的变化尤为重要。众所周知，老化与细胞外基质(ECM)的成分和结构发生改变有关。布鲁赫膜由四个ECM层组成，各层包含胶原、糖胺聚糖和糖蛋白。在老化过程中，布鲁赫膜发生变化，包括内胶原层整体增厚和胶原含量及胶原空间组织改变。交联增多，同时黄斑下的布鲁赫膜的非胶原蛋白增加。糖胺聚糖大小和含量的增加在一些研究中也有报道。总的来说，布鲁赫膜成分和结构的变化导致了布鲁赫膜通透性和扩散性的变化。总之，AMD眼睛的异常ECM的特征在于基底层沉着、基底线沉着和它们的临床实证表现软性玻璃膜疣。糖尿病性视网膜病变糖尿病性视网膜病变是视网膜微血管病，包括毛细血管渗漏和视网膜缺血。其中涉及多个生化途径，包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)的产生，其引起新血管形成、血管通透性增加和血-视网膜屏障崩溃。糖尿病性视网膜病变的进程和年龄相关且与布鲁赫膜(BM)的结构和生化变化有关。糖尿病性视网膜病变(DR)是I型和2型糖尿病患者失明的首要原因，是糖尿病的并发症，对视网膜内的血管造成损害。糖尿病性视网膜病变有四个阶段(I)轻度非增生性视网膜病变，其中在视网膜血管中出现微动脉瘤；(2)中度非增生性视网膜病变，其中一些营养视网膜的血管变得阻塞；(3)重度非增生性视网膜病变，其中许多通向视网膜的血管阻塞，使视网膜若干区域失去供血；和(4)增生性视网膜病变，其中新的异常的壁薄易碎的血管生长出来为视网膜供血，但这些新的血管也许会漏血而产生严重的视力下降和失明。出血经常发生在睡眠中且会发生多次。液体也会在糖尿病性视网膜病变的任一阶段渗漏入黄斑中央引起黄斑水肿和视力模糊。约40%到45%的美国确诊糖尿病患者具有某一阶段的糖尿病性视网膜病变，约一半的增生性视网膜病变患者还具有黄斑水肿。和眼部疾病(如糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性)有关的发病机制和失明是不需要的血管生成的直接结果。在眼部组织中，血管生成是最常见的导致失明的原因。增生性糖尿病性视网膜病变的特征是玻璃体的视网膜血管侵入。年龄相关性黄斑变性是一种黄斑疾病，其通过向内生长(in-growth)穿透布鲁赫膜的脉络膜血管区别于干性。糖尿病性黄斑水肿
糖尿病性黄斑水肿(DME)被描述为视网膜的增厚和\或视网膜中央I个视盘直径内的硬性渗出物。DME和DR是糖尿病患者的微血管并发症，其使视敏度减退，最终导致失明。DR患者会发展成DME，DME发生在扩张的通透性过高的毛细血管和微动脉瘤渗漏导致的血-视网膜屏障崩溃之后。和DR —样，DME和穿透受损的或解组织的布鲁赫膜的脉络膜新生血管有关。血管牛成血管生成(本文中又称为新生血管)是新的血管形成的过程。血管生成通常发生在胚胎形成和发育期间，且发生在处于伤口愈合和胎盘发育期间的发育完全的有机体中。此外，血管生成发生在各种病理条件下，包括由新生血管导致的眼部疾病，如糖尿病性视网膜病变和黄斑变性中。最近的研究表明，布鲁赫膜的改变以及相伴的RPE细胞的细胞外基质的变化可能有助于脉络膜新生血管患者增加VEGF的产量(Kwak等)。再者，动物研究(Kwak等)确认正常的RPE细胞和完整的布鲁赫膜对来自脉络膜的血管侵入提供物理或生化屏障。布鲁赫膜布鲁赫膜是由RPE基底膜、内胶原层、中弹性层和外胶原层组成的五层膜结构。这种位于视网膜色素上皮(RPE)细胞和脉络膜之间的细胞外基质网状物厚度为2-4i!m，且在老化的过程中经历结构变化和化学重构。脉络膜流随心律振荡使布鲁赫膜经受压力诱导应力的恒定循环，且布鲁赫膜的力学性质是其生理机能和能够作为粘附的RPE和血管化的脉络膜之间的有效屏障的关键。研究表明布鲁赫膜的弹性在21岁后，随着年龄的增长成线性下降，每年减少约I %。布鲁赫膜和视网膜色素上皮细胞在正常的眼睛中，视网膜色素上皮(RPE)是内部衬有布鲁赫膜的六角形单细胞层，其将神经视网膜与脉络膜毛细血管层(脉络膜)分开。RPE负责维持神经视网膜、脉络膜毛细血管层和布鲁赫膜的完整性。只要适当地附着在布鲁赫膜上，RPE层的完整性就可以维持。虽然布鲁赫膜的年龄相关性结构变化和RPE的细胞变化之间的联系是未知的，但已知的是布鲁赫膜的结构变化要比RPE的细胞变化早10年到20年，并且可以诱导上面的RPE在附着、存活、增殖和基因表达谱方面发生变化。目前不能明确知道布鲁赫膜的哪些结构或化学变化对RPE产生年龄相关的影响。已知的是，随着年龄增长在布鲁赫膜内发生许多变化，包括异常蛋白和脂质的沉积，蛋白基质结构的地形重组织，以及细胞附着所必需的配体结合位点的变化。改变布鲁赫膜的治疗人们曾尝试通过全身性透析(Fell，AJ等)来改变布鲁赫膜和尝试修复(DelPriore, L)或重建(Tezel，TH等)布鲁赫膜以复原正常屏障功能以及增强RPE附着性。如果成功，布鲁赫膜将会恢复其阻止脉络膜新生血管(CNV)的能力。在过去几年中，消除中央视网膜(黄斑)内异常血管的策略已证实可以帮助很大一部分患‘湿性’年龄相关性黄斑变性(AMD)的患者。不幸地是，这些血管经常复发，因为 布鲁赫膜中潜在的结构缺陷没有被修复。此外，没有可用的治疗方法使患‘干性’AMD(没有异常血管)患者的视网膜色素上皮(RPE)复原，这还是由于布鲁赫膜中潜在的缺陷，其阻止了 RPE细胞粘附在此结构以改造完好的单细胞层。不管在哪种情况下，都需要布鲁赫膜完整性的局部复原方法，布鲁赫膜完整性的局部复原将阻止新血管疾病的入侵及/或使得RPE单细胞层得以重构，无论是宿主细胞还是移植细胞。因此，布鲁赫膜的局部黄斑下修复是复原RPE单细胞层和保存视力必需的邻近光感受器(视杆和视锥)的基础。直至现在，修复布鲁赫膜的实验性尝试也因为许多重大的挑战而挫败。这些挑战包括需要移植至视网膜和/或RPE下时不会诱导炎症或异物反应的材料；需要允许RPE细胞粘附以及生长成无畸变的单细胞层同时也不干扰上层光感受器外节的精确组织的材料构造；需要材料足够薄和多孔以维持黄斑内正常的结构关系以及生理上重要分子在脉络膜、RPE以及视网膜之间的扩散；需要材料有足够弹性而富有韧性和不易碎以便可以经手术完好地递送至视网膜下腔。另一个期望特性就是生物可降解性。专利公布20090306772描述了 RPE和下面的脉络膜毛细血管层之间暂时性结构屏障的移植，该支架用作模板以使这些宿主结构平躺以及有效地维持与天然布鲁赫膜类似的新基底膜结构。本发明描述了原位修复布鲁赫膜(眼睛中RPE下面的结构)以及构建渗出性(湿性)和萎缩性(干性)AMD的早期、根本损伤的位置的方法。在某些实施方案中，本发明通过将聚合物支架移植入受试者(如，人受试者)视网膜下腔，来使用所述聚合物支架治疗视网膜疾病。据认为，通过RPE和下层的脉络膜毛细血管层之间形成暂时性结构屏障，支架用作模板以使这些宿主结构平躺以及有效地维持与天然布鲁赫膜类似的新基底膜结构。眼外层内ECM的组成细胞外基质组织(ECM)是布鲁赫膜的重要成分，布鲁赫膜是位于视网膜光感受器和视网膜色素上皮下面的多层结缔组织。布鲁赫膜由胶原、糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白组成。胶原包括I型、III型、IV型、V型和VI型。蛋白聚糖包括核心蛋白聚糖。糖胺聚糖包括硫酸软骨素和硫酸皮肤素。糖蛋白包括层粘连蛋白和纤连蛋白。核心蛋白聚糖在视网膜组织和布鲁赫膜中得到鉴别，据报道，它在布鲁赫膜的发育(Hirabayashi 等，Medical Electron Microscopy, 36:136-146, 2003)和视网膜神经节细胞的分化中(Inatani 等，Investigative Ophthalmology & VisualSci. ,40:1783-1791, 1999)是重要的。小的富含亮氨酸蛋白聚糖角膜胶原原纤维与天然结合大分子缔合，所述大分子包括原纤维缔合胶原(FACIT)，如XII、XIV和XX型胶原；和小的富含亮氨酸重复蛋白聚糖(SLRP)，如核心蛋白聚糖、基膜聚糖、角膜蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖以及骺蛋白聚糖。这些大分子与胶原原纤维相互作用以控制原纤维直径和稳定ECM组织。它们也可能涉及将原纤维结合在一起以限制原纤维彼此后退的能力。这些桥接提供了一定的灵活性但是限制了原纤维移行的距离。将核心蛋白聚糖加入ECM以形成胶原原纤维之间的桥接，因此来稳定ECM是有可能的。已证实蛋白聚糖的加入可以阻止因蛋白聚糖的先前移除而导致的异常的胶原原纤维“生长”。
核心蛋白聚糖核心蛋白聚糖是小的富含亮氨酸重复蛋白聚糖或SLRPS家族的一员。核心蛋白聚糖是大约IOOkDa的蛋白聚糖，由40kDa核心蛋白和硫酸软骨素或硫酸皮肤素糖胺聚糖链组成。核心蛋白聚糖与胶原I型和II型、纤连蛋白、血小板反应蛋白和TGFe相互作用。商品化动物源性核心蛋白聚糖可以从Sigma Chemical Company或其它的生化药剂供应商获得。但是，本发明者是从Catalent Pharma Solutions获得重组人核心蛋白聚糖蛋白(称为Galacorin )。最近已证实核心蛋白聚糖的核心蛋白与4至6种胶原分子相互作用(Orgel等，PlosOne, 4:1-10, 2009)以及稳定细胞外基质结构的原纤维间组织。核心蛋白聚糖充当组织稳定剂和组织者。核心蛋白聚糖是马蹄状的蛋白聚糖，其结合人角膜的胶原原纤维，形成附着于该原纤维或邻近原纤维上的两个相邻胶原分子的双齿配体，从而帮助稳定原纤维和定向原纤维形成。(Scott, JE, Biochemistry, 35:8795, 1996)。核心蛋白聚糖似乎是在特定结合位点连接胶原原纤维的细胞外基质的到处存在的成分(Scott, JE等，Exp. Cell Res, 24359-66, 1998)。角膜透明性依赖于角膜基质内胶原原纤维的尺寸和排列。核心蛋白聚糖的结合在限制胶原原纤维的生长以及控制胶原原纤维的排列以产生透明性(Rada，JA等，Exp EyeRes. , 56i635, 1993)中有重要作用。核心蛋白聚糖对体外胶原原纤维形成影响的研究显示对胶原原纤维生长和胶原原纤维直径增加的抑制作用(Kuc, IM 和 Scott, PG, Connective Tissue Res. , 36:287, 1997)。核心蛋白聚糖也有许多的生物或生理特性，包括EGF受体的生物配体和可能调节细胞生长(lozzo，RV等.T. Biol. Chem. . 274:4489. 1999)、下调TGF0(Giri, SN 等,Biochem.Pharmacol.,54:1205, 1997 ；ffestergen-Thorsson,G等，J. Clin. Invest.，92i, 632，1993)、抑制细胞附着和可能的抗粘附作用(Gu, J.和 Wada, Y. , I. Biochem (Tokyo), 119:743, 1996)、抑制癌细胞(Nash, MA 等.，CancerRes.，59i, 6192, 1999)以及抑制血管生成(Grant 等，Oncogene, 21:4765-4777, 2002 ；Sulochana 等，J. Biol. Chem. 280:27935-27948. 2005)。AMD的治疗如上文讨论的，没有已证实的治疗干性AMD的方法。但是，有一些正在研究的方法包括使用包囊的捷状神经营养因子(CNTF)产生细胞防止光感受器和视网膜色素上皮细胞的损失；使用P0T-4(抑制补体成分C-3)和艾库组单抗(Eculizumab)(静脉输液以抑制)抑制补体级联；以及使用净化血液疗法治疗血液，此方法使用血液过滤器排除血液中过多的大蛋白、脂肪和其它物质，从而改善进入黄斑的血流和潜在地改进视力。所提议的其它治疗干性AMD的方法包括抗氧化剂和锌补充剂的消耗。不同于干性AMD，有一些已被FDA批准或正在研究的药剂用以治疗湿性AMD。这些药剂的作用方式主要是通过对血管内皮生长因子(VEGF)的阻断来抑制血管生成。这些药剂包括哌加他尼钠(Pegaptanib Sodium) (MaCUgen )、雷珠单抗(Ranibizumab) (LuceiltiS )、贝伐单抗(Bevacizumab) (AvaStill )和乙酸阿奈可他(Anecortave acetate) (Retaane ),专利参考US专利6，946，440和7，402，562以及专利公布US2009/0105127描述了在角膜塑形术程序用以重分配角膜组织以矫正近视和远视后，核心蛋白聚糖稳定角膜基质的有效性。在这些专利中，发明者发现核心蛋白聚糖、其它小的富含亮氨酸蛋白聚糖和带有间断性三螺旋分子的纤维缔合胶原可被递送到眼睛前面的角膜内，在角膜塑形术后交联间质的胶原纤维以稳定重分配的角膜组织。在本发明中，发明者发现核心蛋白聚糖可施加于眼睛后部的组织以维持细胞外基质组织、防止细胞外基质的解组织，或重组织布鲁赫膜的细胞外基质。应用核心蛋白聚糖维持布鲁赫膜的组织与先前的角膜稳定化应用明显地不同。例如， 将核心蛋白聚糖施用至角膜旨在通过在基质的高度组化的、胶原性的片层之间形成桥接来增强它的生物力学稳定性。递送至布鲁赫膜旨在维持和稳定基质组织或重组织包含至少五个独特的胶原层的此多样结构的一层或多层的基质结构。局部施用至角膜不能完成将核心蛋白聚糖递送至眼睛后部的原因有几个；分子太大而不易扩散通过组织严密的角膜上皮和内皮，更重要的是，核心蛋白聚糖将会自发地结合角膜基质内胶原分子上的特定氨基酸序列。因此在那些涉及递送至布鲁赫膜的应用中，核心蛋白聚糖通常是经微创结膜下注射、传统的玻璃体内注射、经巩膜递送、筋膜下注射、脉络膜上腔递送或其它合适方法直接地施用于眼睛后部或眼睛后部的外层。W02005116066描述了对抑制不希望的血管生成有用的核心蛋白聚糖肽类(同样发表在Sulochana等2005)。基于 所述肽类的血管生成抑制特性，作者提议核心蛋白聚糖肽类可以用于治疗黄斑变性。同样，US 2009/0246133A1描述了对靶向经历血管生成的组织有用的组成物和方法，包括由血管生成靶向部分与包括核心蛋白聚糖的治疗部分相结合而组成的缀合物，所述治疗部分对治疗糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性有用。尽管众所周知，核心蛋白聚糖显示抗血管生成活性并且可能对治疗糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿以及与血管生成有关的AMD( S卩，湿性AMD)是有用的，发明者发现核心蛋白聚糖，包括重组人核心蛋白聚糖核心蛋白，也可以用于治疗或预防干性AMD。不受特定理论的限制，我们相信这种疗法或预防是可行的，因为核心蛋白聚糖稳定和组织(或重组织)布鲁赫膜的细胞外基质(ECM)来防止异常ECM的形成。异常ECM最终会导致布鲁赫膜的基底层和基底线沉着以及软性玻璃膜疣的形成与分解。只有在该后期，血管才会从脉络膜毛细血管层出芽并突破进入RPE下腔和视网膜下腔，导致在湿性AMD、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿中观察到的新生血管。因此，干性AMD的治疗不涉及核心蛋白聚糖的抗血管生成特性。发明者也证实当核心蛋白聚糖注射到动物模型的玻璃体时与任何不利观察都没有关系。相应地，本发明描述了用于稳定和组织视网膜组织含胶原的细胞外基质来维持布鲁赫膜的结构和组织，从而预防、延缓或限制布鲁赫膜的解组织进程的组合物和方法。IV.发明概述根据本发明，公开了用于治疗或预防干性AMD、防止湿性AMD的发展、以及防止或延缓糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的组合物和方法。具体来说，公开了稳定和维持视网膜组织(包括布鲁赫膜)内ECM的组织或重组织和稳定视网膜组织(包括布鲁赫膜)内ECM的组合物和方法。这些方法包括向患者眼部施用组合物,该组合物包含小的富含亮氨酸蛋白聚糖(SLRP)分子或SLRP分子的交联胶原原纤维和稳定原纤维间组织的蛋白成分，含在药学上可接受的载体中。在本发明的一个实施方案中，蛋白质，如核心蛋白聚糖核心蛋白质，通过结合至少两种不同的原纤维且多达6个胶原分子以在其间形成桥接而交联胶原原纤维。在本发明的另一个实施方案中，蛋白聚糖，如核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、飯蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、mimican、纤调蛋白聚糖、基膜聚糖或其任一组合,交联胶原原纤维以及稳定原纤维间和细胞的组织。本发明另外的目的和优点的部分将会在接下来的描述中阐明，部分将会从描述中显而易见，或通过本发明的实践而了解。凭借所附权利要求书中特别指出的元素和组合，本发明的目的和优点将会实现和获得。应理解先前的概述和接下来的详述只是示例性的和说明性的，而不对所要求的发明加以限制。
V.实施方案描述发明者发现通过向眼睛施用一种或多种交联和组织胶原原纤维结构的蛋白聚糖分子或蛋白质，眼睛外层，尤其是多层化布鲁赫膜内ECM组织的胶原原纤维可以被稳定和组织或重组织。此外，发明者发现通过向眼部施用一种或多种蛋白聚糖分子或蛋白质，眼部组织内的内皮和上皮细胞层可以被稳定。为了更容易的理解本发明，首先定义某些术语。其它定义在通篇的实施方案描述中阐明。定义“年龄相关性黄斑变性” 一黄斑的变性，黄斑是负责阅读或驾驶所需敏锐、中心视力的视网膜的一部分。因为黄斑主要是在AMD内受影响，所以可能发生中心视力丧失。AMD 存在两种形式湿性(渗出性或血管性)和干性(非渗出性、萎缩性或非新生血管性)。糖尿病性视网膜病变一糖尿病性视网膜病变是视网膜的微血管病，其涉及毛细血管渗漏和视网膜缺血。涉及多种生化途径，包括产生引起新生血管的VEGF、增强的血管通透性和血-视网膜屏障的崩溃。糖尿病性视网膜病变的进程是与年龄相关的且与布鲁赫膜的结构和生化变化有关。糖尿病性黄斑水肿一糖尿病性黄斑水肿(DME)被描述为视网膜的增厚和/或视网膜中央I个视盘直径内的硬性渗出物。DME和糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病患者的微血管并发症，其使视敏度减退，最终导致失明。DR患者会发展成DME，DME发生在扩张的通透性过高的毛细血管和微动脉瘤渗漏导致的血-视网膜屏障崩溃之后。和DR —样，DME和穿透受损的或解组织的布鲁赫膜的脉络膜新生血管有关。“黄斑” 一是负责详细的中心视力的视网膜内一个小而高度敏感区域。“布鲁赫膜” 一是由包含细胞外基质成分的五层组成的脉络膜最内层。“视网膜” 一是衬在眼睛后部内表面的感光组织。眼睛光学在视网膜上形成视觉世界的影像，视网膜和相机内的胶卷充当几乎相同的功能。“视网膜组织” 一是用于涵盖视网膜和其相关组织的术语，包括布鲁赫膜和脉络膜。“脉络膜” 一是眼睛内位于视网膜和巩膜之间的含结缔组织的血管层。“巩膜” 一是眼睛内不透明的白色区域或眼睛内含有胶原和弹性纤维的纤维状、防护性外层。“血管生成” 一是一种生理过程，涉及从先存在的血管生长新的血管。“新生血管” 一是具有红细胞灌注的功能性微血管网的形成。“脉络膜毛细血管层” 一是脉络膜内紧邻布鲁赫膜的一层毛细血管。“稳定”包括提高组织的硬度或对应力的抗性。“稳定”还可以表示借助于增加的分子间相互作用来降低一种胶原原纤维相对另一种胶原原纤维移动的能力。“细胞外基质或ECM” 一是动物组织的细胞外部分，其除了实行各种其它重要功能外还通常给动物细胞提供结构支撑。细胞外基质是动物结缔组织的定义性特征。ECM含有胶原、蛋白聚糖、糖胺聚糖、弹力蛋白、糖蛋白类和透明质酸。“交联”一包括两种或更多种胶原原纤维之间形成直接或间接键结。直接键结包括一种胶原原纤维的氨基酸和另一种胶原原纤维的氨基酸之间形成共价键结。例如，核心蛋白聚糖是马蹄形的蛋白聚糖，其结合人角膜的胶原原纤维，形成附着于该原纤维或邻近原纤维上两个或更多个相邻胶原分子的双齿配体，从而帮助稳定原纤维和定向原纤维形成。Scott, JE, Biochemistry,第 35 卷，第 8795 页(1996)。“交联胶原原纤维的蛋白质”包括在两种或更多种胶原原纤维之间形成直接或间接交联的蛋白质。实例包括重组人核心蛋白聚糖核心蛋白(“核心蛋白聚糖”)。“核心蛋白聚糖”包括本领域的技术人员所知其名称的任何蛋白质，只要所述核心蛋白聚糖充当附着于原纤维或邻近原纤维上两种或更多种相邻胶原分子的双齿配体。除非另外明确指明仅指缺乏聚糖的蛋白质，否则“核心蛋白聚糖”包括核心蛋白聚糖核心蛋白和蛋白聚糖形式。具体地说，核心蛋白聚糖包括由REFSEQ号NM_001920. 3描述的人核心蛋白聚糖基因的各种选择性剪接转录本中任一者编码的蛋白质。通常，所述人核心蛋白聚糖大小为359个氨基酸，并且其氨基酸序列在REFSEQ号NP_001911中陈述。各种突变及其对核心蛋白聚糖与胶原相互作用的影响已经被描述，例如Nareyeck等，Eur. J. Biochem,第271卷，第3389-98页(2004)，且结合胶原的突变体也在术语“核心蛋白聚糖”范围内，如称为179等位基因变体的核心蛋白聚糖变体，De Cosmo等，Nephron,第92卷，第72-76页(2002)。用于本发明方法中的核心蛋白聚糖可从各种动物组织来源中提纯或可重组产生。因此，不仅人核心蛋白聚糖，而且其它物种(包括但不限于灵长类动物、母牛、猪、绵羊、豚鼠、小鼠和大鼠)的核心蛋白聚糖也可用在本发明方法中。可用于本发明方法中的人核心蛋白聚糖的实例为重组人核心蛋白聚糖，其可商购自Catalent Pharma Solutions。可使用糖基化或者未糖基化形式的核心蛋白聚糖。核心蛋白聚糖的片段，无论是重组的还是蛋白水解的片段，也可用在某些实施方案中，只要所述片段充当附着于原纤维或相邻原纤维上两种或更多种相邻胶原分子的双齿配体。如本文所使用，术语“治疗”和类似用语，指获得所需药物学和/或药理学效应。治疗可给已知具有某病况的患者施用组合物或产物。治疗也可作为预防措施的一部分给患者施用组合物或产物，来抑制已知与初步治疗相关的疾病或病况的发展。在外科手术中，预防性治疗是为了改善外科手术的结果或者说降低与外科手术相关的不良继发效应，而给预定要接受外科手术的患者施用的任何治疗。一个预防性治疗的实例是对器官或组织移植前的患者施用免疫抑制剂。如本文使用的“治疗”涵盖任何针对哺乳动物(尤其是人)的病况或疾病的治疗并包括(a)抑制病况或疾病，如遏制其发展；和(b)缓解、减轻或改善病况或疾病，如引起病况或疾病的消退。“药学上可接受的载体”指无毒固体、半固体或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或任何常规类型的配制助剂。“药学上可接受的载体”指使用的剂量和浓度对受者无毒作用，并与制剂的其它成分相容。例如，含多肽制剂的载体优选不包括氧化剂和其它已知对多肽有害的化合物。适合的载体包括但不限于水、缓冲液(如平衡盐溶液)、右旋糖、甘油、盐水、纤维素(如羧甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素)、多糖(如透明质酸)及其组合。所述载体可包含外加剂如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂、或增强制剂有效性的佐剂。局部载体包括液态石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、聚氧乙烯单月桂酸酯水溶液(5%)，或十二烷基硫酸钠水溶液(5%)。其它材料如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂以及类似试剂，可根据需要添加。其它药学上可接受的载体的实例在整 个说明书(包括实施例)中呈现。适合本文使用的药学上可接受的盐类包括酸加成盐(由多肽的游离氨基形成)，所述盐类形成于如盐酸或磷酸的无机酸，或如醋酸、扁桃酸、草酸和酒石酸的有机酸。形成于游离羧基的盐类也可衍生于如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物的无机碱，以及如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇和组氨酸的有机碱。本文可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“寄主”和“患者”，指哺乳动物，包括但不限于，鼠科、猴猿类、人、猫科、犬科、马科、牛科、猪、绵羊、山羊、农场哺乳动物、体育哺乳动物、以及宠物哺乳动物。在进一步描述本发明之前，应当理解本发明不仅限于所述的特定实施方案，因而，当然也可有所变化。还应当理解本文所用的术语仅为了描述特定的实施方案，而并不意味着受其限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。交联并组织ECM中胶原原纤维的蛋白质胶原原纤维可通过间接键结交联。在本发明的这些实施方案中，一种或多种蛋白质充当胶原原纤维之间的中间连接。通过间接键结交联胶原原纤维的蛋白质实例是核心蛋白聚糖。用于本发明方法中时，核心蛋白聚糖通常溶解或悬浮在生理相容的缓冲液中。核心蛋白聚糖的浓度可在约10至约5000ii g/ml之间变动。在一些实施方案中，所述浓度在约10至约500 ii g/ml之间变动，而在其它实施方案中，可在约100至约5000ii g/ml之间变动。在另外其它实施方案中，所述浓度在约100至约IOOOii g/ml之间，在约200至约900ii g/ml之间，在约300至约800 u g/ml之间，在约350至约700 u g/ml之间，在约400至约700 u g/ml之间,或在约400至约600ii g/ml之间变动。其它通过在胶原原纤维间形成桥接以间接连接胶原纤维的蛋白质的使用浓度可如对核心蛋白聚糖所述的。所述用作蛋白质(其在胶原原纤维之间形成间接交联)的载体的缓冲液并不是关键并且可为许多药学上可接受的缓冲液中的任何一种，如中性pH磷酸盐缓冲液。其它合适的缓冲液包括HEPES,TRIZMA (Sigma-Aldrich，但也应当接受任何其它TRIS缓冲液的供应商)。缓冲液的浓度通常在约0. 005至约0. 5M之间，其pH值在约6. 5至约8. 5之间，尽管在一些实施方案中，所述pH值在约6. 8至约7. 6之间，而在其它实施方案中pH值在约7.0至约7. 4之间。用于本发明方法的核心蛋白聚糖溶液的一个实例是无菌且无热原的，所述溶液中存在的核心蛋白聚糖的浓度约为500 u g/ml，并用pH值约为7. 2的IOmM磷酸钠加上15mMNaCl缓冲。其它通过在胶原原纤维之间形成桥接以间接连接胶原纤维的蛋白质也可用在本制剂中。交联并组织眼组织中细胞外基质的蛋白质的施用方法可用各种方法施加交联并组织在组织基质(如布鲁赫膜)中的胶原原纤维的蛋白质。在一种实施方案中，包含交联胶原原纤维的蛋白质的溶液的施加是通过微创结膜下注射、传统的玻璃体内注射、经巩膜递送、筋膜下注射、脉络膜上腔递送或通过其它适当的方法将含有蛋白质的溶液递送到眼后部的组织层。所述注射技术可涉及显微针的使用，如38号显微针或其它适当规格的显微针，或用显微针直接注射入布鲁赫膜，所述显微针的规格如38或其它适当的规格。 在其它实施方案中，交联胶原原纤维的蛋白质可通过注射入巩膜组织来施加。在某些实施方案中，所述递送可使用充满核心蛋白聚糖的胶原植入物经巩膜递送并且之后置于结膜中。该递送技术不同于局部施用，因为局部施用的药物通常经过泪腺很快就从眼部清除，所以未提供与巩膜组织充分的接触时间。
患者的选择
本发明的方法部分上根据黄斑变性的阶段而变化。因此，在某些实施方案中，预防年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的发展的方法涉及对不存在具体的体征或症状的患者施用已公开的组合物。干性AMD的体征或症状包括视网膜内一种或多种色素的缺失、玻璃膜疣出现、或视网膜色素上皮的地图状萎缩。湿性AMD的症状包括中心视力丧失、视觉失真、对比敏感度降低以及色觉下降。糖尿病性视网膜病变的症状包括视网膜血管内的微动脉瘤，其可导致更严重的形式，其中新的异常的壁薄易碎的血管生长以供血给视网膜，但是新的血管可能漏血而产生严重的视力下降和失明。出血经常发生在睡眠中且会发生多次。液体也会在糖尿病性视网膜病变的任一阶段渗漏入黄斑中央引起黄斑水肿和视力模糊。糖尿病性黄斑水肿的症状包括视网膜增厚和/或视网膜中央I个视盘直径内的硬性渗出物。视网膜增厚和/或视网膜中央I个视盘直径内的硬性渗出物。起于脉络膜的新生血管是湿性AMD、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的体征或症状，如同布鲁赫膜的解组织，包括视网膜色素上皮细胞从布鲁赫膜分离。因此，在一方面，预防干性AMD的方法是对缺乏干性AMD或湿性AMD的体征或症状的患者施用已公开的组合物。在本发明的其它方面，预防湿性AMD，或阻止湿性AMD进程或延缓湿性AMD发展的方法是对具有一种或多种干性AMD体征或症状但无湿性AMD的体征或症状的患者施用已公开的组合物。在另外其它的实施方案中，治疗或延缓干性AMD的方法涉及对具有一种或多种干性AMD体征或症状但不显示任何湿性AMD的体征或症状的患者施用已公开的组合物，例如患者脉络膜中没有显示新生血管。同样，在其它实施方案中，预防糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿，或阻止糖尿病性视网膜病变和糖尿病性黄斑水肿的进程的方法是对具有所述致盲条件的一种或多种体征或症状的患者施用已公开的组合物。所述方法通常就其方法步骤和使用的组合物进行描述。在提供值的范围时，应理解在该范围的上下限和该规定范围的任何其它规定值或居中值之间的每个居中值，至下限单位的十分之一(除非另外明确规定)，均涵盖在本发明内。所述较小范围的上限和下限可独立包括在更小的范围内，并且也涵盖在本发明内，服从该规定范围内任何明确排除在外的界限。在该规定范围包括其中一个界限或两个界限都包括时，所述包括的界限均不包括或都包括的范围也涵盖在本发明内。应当注意，除非另外明确规定，否则本说明书中和所附权利要求书中使用的单数形式“一个/种”或“该”包括其复数指代物。因此，如提到“一种目标多肽”包括多个该类多肽；如提到“该试剂”包括提到本领域的技术人员所了解的一种或多种试剂及其等效物；
坐寸o除非另外定义，否则本文所使用的全部技术和科学术语与本发明相关领域的技术人员通常理解的意思相同。本文提到的所有出版物，包括专利、专利申请、和刊物的全部内容均以引用的方式并入本文，以公开和描述与出版物引用相关的方法和/或材料。本文所述的出版物仅提供其在本发明申请日之前的公开内容。本文的任何信息不得被视为承认本发明因先前发明而无权先于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要单独确认。以下仅通过实施例对本发明进行描述，但不得以任何方式认为本发明受其限制。现将详细参考本发明的现有实施方案。实施例实施例I.家兔模型中玻璃体内注射核心蛋白聚糖的测暈家兔玻璃体置换生物测定(Replacement Bioassay)在Insight Biomed (明尼苏达州Isanti市)进行。取出等量的玻璃体液后，六只兔眼接受玻璃体内注射0. 5mL的核心蛋白聚糖(4. 74mg/mL溶 于IOmM NaPO4+150mM NaCl pH 7. O。对侧的眼睛充当未操作的对照组。操作后监测动物直到其从麻醉中恢复。48小时时对动物肌内注射甲苯噻嗪(Xlyazine)(10mg/Kg体重)、克他命(50mg/kg体重)和乙酰丙嗪(0. 5mg/kg体重)进行麻醉。使用局部2. 5%苯肾上腺素HCl和1%托品酰胺使眼睛扩张。注射后48小时时，在取出玻璃体试样之前，对照组和处理组的眼睛都按照家兔玻璃体分级量表(Rabbit Vitreal Grading Scale)为眼炎评级。在取出0. 5ml玻璃体试样之前，局部施用0. 5%的丙美卡因。确定细胞计数和眼部炎症反应来评价对试样的炎症反应。如果玻璃体细胞计数小于或等于100细胞/mm3和/或总体平均临床反应小于或等于1，那么认为测试材料是非炎症性的。未经操作的眼睛一定也如生物测定的参数所定义，评分为非炎症性的。在玻璃体内注射核心蛋白聚糖(4. 74mg/mL)后，所有六只眼睛都显示总体平均玻璃体细胞计数为2. 92细胞/mm3和总体平均临床反应为0. 28。基于这些参数,该试液，即核心蛋白聚糖溶液，被认为是非炎症性的。实施例2.血■管生成抑制测试一鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)测定最近关于Euclid Systems的研究清楚地证明了人重组核心蛋白聚糖核心蛋白的抗血管生成活性。在受精卵的标准绒毛尿囊膜(CAM)中证明了抗血管生成活性。由宾夕法尼亚州 Spinnerstown市的MB Research Laboratories (项目号为 10-18858. 09)执行研究。结果如下所示，其证明了对血管化的剂量相关性抑制作用。表I.根据CAM测定的血管化抑制作用
权利要求
1.一种治疗有需要患者的干性年龄相关性黄斑变性(AMD)或预防有需要患者的湿性AMD发展的方法，所述方法包括通过注射技术向患有干性AMD患者的眼睛后部施用包含核心蛋白聚糖和药学上可接受的载体的药物组合物，从而治疗所述干性AMD或预防湿性AMD的发展。
2.一种治疗有需要患者的糖尿病性视网膜病变或预防有需要患者的糖尿病性黄斑水肿发展的方法，所述方法包括通过注射技术向患有糖尿病患者的眼睛后部施用包含核心蛋白聚糖和药学上可接受的载体的药物组合物，从而治疗所述糖尿病性视网膜病变或预防糖尿病性黄斑变性的发展。
3.一种包含核心蛋白聚糖和药学上可接受的载体的药物组合物，其用于治疗有需要患者的干性年龄相关性黄斑变性(AMD)或预防有需要患者的湿性AMD的发展。
4.一种包含核心蛋白聚糖和药学上可接受的载体的药物组合物，其用于治疗有需要患者的糖尿病性视网膜病变或预防有需要患者的糖尿病性黄斑水肿的发展。
5.包含核心蛋白聚糖和药学上可接受的载体的组合物用于治疗有需要患者的干性年龄相关性黄斑变性(AMD)或预防有需要患者的湿性AMD发展的用途。
6.包含核心蛋白聚糖和药学上可接受的载体的组合物用于治疗有需要患者的糖尿病性视网膜病变或预防有需要患者的糖尿病性黄斑水肿发展的用途。
7.根据权利要求I或2所述的方法、根据权利要求3或4所述的药物组合物，或根据权利要求5或6所述的用途，其中所述核心蛋白聚糖是重组人核心蛋白聚糖核心蛋白。
8.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述核心蛋白聚糖通过微创结膜下注射或通过传统的玻璃体内注射来施加。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核心蛋白聚糖直接施加于布鲁赫膜。
10.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述核心蛋白聚糖使用胶原浸溃的递送系统经巩膜来施加。
11.一种稳定遭受干性年龄相关性黄斑变性患者的视网膜组织的细胞外基质中的胶原原纤维的方法，所述方法包括向所述患者的眼部施用包含蛋白聚糖分子或蛋白聚糖分子的核心蛋白和药学上可接受的载体的组合物，其中所述蛋白聚糖分子或其核心蛋白交联胶原原纤维。
12.—种组织遭受干性年龄相关性黄斑变性患者的视网膜组织的细胞外基质中的胶原原纤维的方法，所述方法包括向所述患者的眼部施用包含蛋白聚糖分子或蛋白聚糖分子的核心蛋白和药学上可接受的载体的组合物，其中所述蛋白聚糖分子或其核心蛋白交联胶原原纤维。
13.—种稳定和组织遭受干性年龄相关性黄斑变性患者的布鲁赫膜的细胞外基质中的胶原原纤维的方法，所述方法包括向所述患者的眼部施用包含蛋白聚糖分子或蛋白聚糖分子的核心蛋白和药学上可接受的载体的组合物，其中所述蛋白聚糖分子或其核心蛋白交联胶原原纤维。
14.一种稳定和组织遭受轻度干性年龄相关性黄斑变性患者的布鲁赫膜的细胞外基质中的胶原原纤维以延缓或限制湿性年龄相关性黄斑变性发展的方法，所述方法包括向所述患者的眼部施用包含蛋白聚糖分子或蛋白聚糖分子的核心蛋白和药学上可接受的载体的组合物，其中所述蛋白聚糖分子或其核心蛋白交联和组织胶原原纤维。
15.根据权利要求14所述的方法，其中组合物预防湿性黄斑变性的发展。
16.一种治疗干性年龄相关性黄斑变性和预防或最小化湿性年龄相关性黄斑变性发展的方法，所述方法包括向所述患者的眼部施用包含蛋白聚糖分子或蛋白聚糖分子的核心蛋白和药学上可接受的载体的组合物，其中所述蛋白聚糖分子或其核心蛋白交联和组织胶原原纤维。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述蛋白聚糖或所述蛋白聚糖的核心蛋白还抑制血管生成以延缓湿性年龄相关性黄斑变性的发展。
18.根据权利要求16所述的方法，其中蛋白聚糖或所述蛋白聚糖的核心蛋白预防黄斑变性的发展。
19.一种预防患者黄斑变性的方法，所述方法包括向所述患者的眼部施用包含蛋白聚糖分子或蛋白聚糖分子的核心蛋白和药学上可接受的载体的组合物，其中所述蛋白聚糖分子或其核心蛋白交联和组织胶原原纤维。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述蛋白聚糖或所述蛋白聚糖的核心蛋白还抑制血管生成以延缓湿性年龄相关性黄斑变性的发展。
21.一种治疗糖尿病性视网膜病变和预防或最小化糖尿病性视网膜病变发展的方法，所述方法包括向患者的眼部施用包含蛋白聚糖分子或蛋白聚糖分子的核心蛋白和药学上可接受的载体的组合物，其中所述蛋白聚糖分子或其核心蛋白交联和组织胶原原纤维且稳定附着于布鲁赫膜上的视网膜色素上皮细胞层。
22.—种治疗糖尿病性视网膜病变和预防或最小化糖尿病性黄斑水肿发展的方法，所述方法包括向患者的眼部施用包含蛋白聚糖分子或蛋白聚糖分子的核心蛋白和药学上可接受的载体的组合物，其中所述蛋白聚糖分子或其核心蛋白交联和组织胶原原纤维且稳定附着于布鲁赫膜上的视网膜色素上皮细胞层。
23.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中所述蛋白聚糖或所述蛋白聚糖的核心蛋白选自核心蛋白聚糖、双糖链蛋白多糖、飯蛋白聚糖、角膜蛋白聚糖、mimican、纤调蛋白聚糖、基膜聚糖或其任一组合。
24.根据权利要求11-22中任一项所述的方法，其中所述蛋白聚糖或所述蛋白聚糖的核心蛋白是重组人核心蛋白聚糖。
25.根据权利要求11-22中任一项所述的方法，其中所述组合物通过微创结膜下注射或传统的玻璃体内注射来施加。
26.根据权利要求11-22中任一项所述的方法，其中所述组合物通过微创结膜下注射或传统的玻璃体内注射施加于布鲁赫膜中。
全文摘要
本发明公开了稳定和组织视网膜组织，尤其是布鲁赫膜(Bruch’s membranes)的细胞外基质中的胶原原纤维的方法，以及稳定衬有布鲁赫膜的视网膜色素上皮层的方法。所述稳定化作用和组织化作用可以通过用交联和组织胶原原纤维的蛋白质，如核心蛋白聚糖(decorin)，治疗视网膜组织来实现。稳定化和组织化方法包括在诊断干性黄斑变性、诊断早期糖尿病性视网膜病变和早期糖尿病性黄斑水肿之前、期间或之后对视网膜组织进行治疗，以预防、延缓或限制布鲁赫膜和衬有布鲁赫膜的视网膜色素上皮细胞解组织的进程。
文档编号A61K38/14GK102639141SQ201080054492
公开日2012年8月15日 申请日期2010年12月3日 优先权日2009年12月4日
发明者B·H·德沃尔夫森, D·P·德沃尔, V·汤普森 申请人:欧几里得系统公司