专利名称：促血管及周边组织修复或再生的制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种可以促进血管及周边组织修复或再生的制剂及其制备方法。
背景技术：
各类血管疾病，例如冠状动脉中产生粥状硬化所引起的冠心病，心绞痛、心肌梗塞、心律失常；脑动脉硬化引起的中风，脑缺血、脑梗塞，脑萎缩；外周动脉粥样硬化引起的肢端缺血,坏疽,坏死，间歇性跛行；以及继发性高血压,糖尿病,慢性炎症,缺血性肠炎,表皮缺血，颈动脉闭塞，及局部或系统性缺血引起的梗塞性痴呆等都是致死率或发病率很高的疾病，在各类血管疾病中，动脉粥样硬化所导致的血栓及血管堵塞是最常见和最重要的发病机理。而由于干细胞具有的促进血管再生和器官功能恢复的特殊功效，因此，干细胞疗法是近年来在治疗各种血管疾病中最受人期待的新发展方向。
干细胞是ー种具有多向分化潜能和自我复制能力的早期未分化细胞。它的特性有具有自我复制能力和多向分化潜能；终生保持未分化或低分化特征；缺乏分化标记；分化情况受所处微环境的影响；通过对称性和非対称性分裂两种方式生长；具有分裂的慢周期性；绝大多数干细胞处于GO期等。按发生学来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是来源于早期中胚层的ー种具有多向分化潜能的成体干细胞。MSC理论上可分化为所有中胚层来源的细胞，例如内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞等，并且具有低免疫活性，同种异体移植不会产生免疫排斥。MSC广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，也可从胎儿脐血中分离得到，还存在于胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肝脏、脂肪、肌肉、皮肤等多种组织中。MSC不仅具有高度増殖、自我更新和多向分化潜能，而且易于分离、培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，在体外长期培养的过程中始終保持多向分化的潜能，遗传背景相当稳定。其中多向分化潜能被认为是MSC最重要的生物学特征之一。目前认为MSC在体内的分化主要取决于所处的环境，在梗塞心肌处就分化为心肌，在愈合的伤ロ处则主要分化为成纤维细胞。在体外的诱导分化则取决于诱导物，在不同的诱导条件下，可分化为不同的组织细胞。MSC已经被证明可以分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞等血管结构，此外，MSC还能在移植的局部分泌ー些促血管生成的生长因子和细胞活素，如血管内皮生长因子。MSC在体内外均可増加局部血管内皮生长因子的水平，从而促进局部血管的新生。MSC移植还可以減少心肌细胞的凋亡，并改善心脏功能。此外，尚有实验证实植入MSC后可以增加局部胰岛素样生长因子的表达，同样也具有很强的促血管生成作用。因此，MSC移植后的促血管生成作用推测应包括两个方面①MSC能分化为新生的血管内皮、血管壁平滑肌及管壁胶原细胞。②MSC移植后分泌促血管生成物质。事实上，移植的MSC在參与缺血组织修复中分泌出的生长因子和细胞活素，可借由MSC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于受损血管及周边组织的修复和再生，从而恢复缺血性坏死的组织的相应功能。因此，MSC在体外人工环境中分泌的促血管及周边组织修复或再生的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂，用于克服现有药物的不足，为临床治疗缺血性疾病提供一种新的治疗药物。上述缺血性疾病主要指由于动脉粥样硬化或其他类血栓，血脂异常导致的血管阻塞类缺血性疾病，具体包括并不局限干在冠状动脉中产生粥状硬化所引起的冠心病，心绞痛、心肌梗塞、心律失常；脑动脉硬化引起的中风，脑缺血、脑梗塞，脑萎缩；外周动脉粥样硬化引起的肢端缺血，坏疽，坏死，间歇性跛行；以及继发性高血压,糖尿病,慢性炎症,缺血性肠炎，表皮缺血，颈动脉闭塞，及局部或系统性缺血引起的梗塞性痴呆等。本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法，该方法步骤为1)从健康人血液中通过白细胞置换(Ieukapheresis)获取外周血单核细胞,或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物(lipoaspirate)中直接提取 MSC;2)筛选及培养外周血或骨髄单核细胞以获得MSC细胞；3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促血管及周边组织修复或再生制剂。本发明所述制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤I)所述的健康人血液或骨髄的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置換。可选步骤中所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为将所获得的骨髓或外周血液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为Ficoll-Paque (GEhealthcare)、Histopaque-1077 (Sigma),或其他公司同类产品，优选为 Histopaque-1077 ；适用温度范围为15到25°C，优选为25°C。具体操作为将含有骨髄或外周血及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞其内所含多种细胞亚群，呈多形性。本发明所述制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー种，并可添加有h印arin(0-100U/ml)。培养基中另可含有质量比为5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。在预设条件为培养温度37°C，ニ氧化碳浓度为5-7%的细胞培养箱中培养。本发明所述制备能够有效的促进促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞的步骤为以下所述方法①至④中的ー种方法 :将单核细胞以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6个细胞的密度培养1_2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。方法②将 单核细胞与fibrin微球(直径50-250微米，可由商业途径获得，如Forticell Bioscience)共同培养 1-2 天，姆 IOO-IOOOmg fibrin 微球可吸附 I X IO6 至I X IO8个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7_21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。方法③将单核细胞通过⑶14，或⑶45特异性抗体进行磁珠分选(MACS ,由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出不含⑶14或⑶45的单核细胞亚群，将此⑶14—或⑶45_单核细胞亚群以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6个细胞的密度培养1_2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7_21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。方法④将人脂肪吸取物(lipoaspirate,约50-100ml)在pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或O. 9%的医用生理盐水中洗浄，用I型和II型胶原酶(collagenase type I，
II,Sigma-Aldrich)消化(酶的浓度范围O. 05% -O. 1% )，消化步骤为置于37°C条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7_21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。本发明所述制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的ー种方法①将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为O. 5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7. 4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。方法②将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的ー种，并可添加有O. 5-1 %的生长因子添加剂EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的ー种(由瑞士 Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1);或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin(0-100U/ml);培养基中另可含有质量比为5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为
O.5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7.4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加I %的医用人血清白蛋白或自体血清。
在按照上述方法①或②培养完成后，收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去MSC细胞。本发明所述制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管及周边组织生长因子及细胞活素如MCP-I，EGF, MMP-9, MMP-2, PDGF, SDF-I，FGF, VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学(proteomics),细胞活素阵列(cytokine array),酶联免疫吸附测定(ELISA)，或Bio-Plex 细胞因子测试。③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。
图I :本发明所述促血管及周边组织修复或再生制剂对成体内皮细胞的存活影响及对成纤维细胞的刮伤愈合和迁移功效。图2 :本发明所述促血管及周边组织修复或再生制剂对大鼠动脉环微血管新生及周边组织新生功效。
具体实施例方式以下通过具体的实例对本发明的内容作进ー步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。实施例I.单核细胞的制备。将抽取出的骨髓或者由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液加入密度梯度剂Histopaque-1077 (Sigma),姆15mL Histopaque中加入30mL骨髓提取液或者外周血白细胞悬液。将骨髓提取液或外周血白细胞悬液在梯度剂的存在下于400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含骨髄系单核细胞的悬浮液。实施例2. MSC细胞的获取。针对I类MSC细胞的获取方法将骨髓或外周血单核细胞在添加有10%人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米IX IO6个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。针对II类MSC细胞的获取方法将骨髓或外周血单核细胞在添加有10%人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米I X IO6个细胞的密度培养2天，通过⑶14，或⑶45特异性抗体进行磁珠分选(MACS ,由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出不含⑶14或⑶45的单核细胞亚群，将此⑶14_或⑶45_单核细胞亚群在添加有10%人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米I X IO6个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单、核细胞受体。针对III类MSC细胞的获取方法将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50_100ml)在pH = 7. 4,0. 9%的医用生理盐水中洗浄,用II型胶原酶(collagenase type II)消化(质量浓度O. 075% )，消化条件为于37°C下震荡30分钟。将消化并过滤出的单核细胞在添加有10%人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米IX IO6个细胞的密度培养2天，将贴壁细胞继续培养21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。实施例3.促血管及周边组织修复或再生制剂的获取。将实施例2所获得的各型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为
O.5%的环境中在O. 9%的医用生理盐水中培养2天(每平方厘米2 X IO5个细胞)，并可添 加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的MSC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为O. 2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除井分装于_80°C冷库冷藏备用。视具体情況，每IxlO6个MSC细胞可以制备
2-5ml所述促血管及周边组织修复或再生制剂。实施例4.促血管及周边组织修复或再生制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。实施例3所制得的促血管及周边组织修复或再生制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokine array)鉴定(由R&D Systems购买)，此促血管及周边组织修复或再生制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子MCP-1、EGF、IL-6、IL-8、MMP-9、SDF-I、HGF, VEGF以及TOGF。通过酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)，其中有效成分的含量为，MCP-I 5-50ng/ml ;IL_8 1-5 μ g/ml ；SDF-1 :0. 5_5ng/ml ;IL_6 :5_20ng/ml ；PDGF-BB :0.トlOng/ml ；VEGF :l_20ng/ml。其他成分组成见表 I。表I.本发明所述促血管及周边组织修复或再生制剂中的成分列表(包含并不局限于以下成分)
权利要求
1.一种促进血管及周边组织再生或修复的制剂的制备方法，其特征在干，该制剂的制备方法包括如下步骤 1)从健康人血液中通过白细胞置换获取外周血单核细胞，或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物中直接提取MSC ； 2)筛选及培养外周血或骨髄单核细胞以获得MSC细胞； 3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基； 4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促血管及周边组织修复或再生制剂。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤I)所述的健康人血液或骨髄的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置換。
3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤I)所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品，温度为15 25°C，离心カ为200g_500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー种，并添加有heparin (0-100U/ml)，培养基中另可含有质量比为5 %至20 %的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清，在预设条件为培养温度37°C，ニ氧化碳浓度为5-7%的细胞培养箱中培养。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的培养单核细胞以获得MSC细胞的方法为以下所述方法①、②、③或④中的ー种 方法①将单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天，获I型MSC。
方法②将单核细胞与fibrin微球共同培养1_2天，每IOO-IOOOmg fibrin微球可吸附IX IO6至IX IO8个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21 天，获 I MMSC0 方法③将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选，筛选出不含CD14或⑶45的单核细胞亚群，将此⑶14-或⑶45-单核细胞亚群以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7-21天，获II型MSC。
方法④将人脂肪吸取物50-100ml在pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或O. 9%的医用生理盐水中洗浄，用I型和II型胶原酶消化(酶的浓度范围O. 05% -O. 1% )，消化步骤为置于37°C条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7-21天，获III型MSC。
6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的ー种方法①将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为O. 5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为Ml 19、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7. 4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。
方法②将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为Ml 19、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的ー种，并添加有O.5-1%的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的ー种；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100 μ g/ml);并可添加有h印arin (0-100U/ml);培养基中另可含有质量比为5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为Ml 19、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7. 4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，不添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。
8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述MSC细胞为I型MSC细胞。
9.一种由权利要求1-8任一所述的方法制备获得的制剂。
10.权利要求9所述的制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种促进血管及周边组织再生或修复的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)，进而在低血清条件培养上述MSC细胞，最后分离MSC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的促进血管及周边组织再生或修复的制剂能够显著的促进血管组织的新生或受损血管组织的修复。
文档编号A61K35/14GK102641292SQ20111004192
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月21日 优先权日2011年2月21日
发明者杨子江, 顾丽娅, 顾茂健 申请人:杨子江