专利名称：一种抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种具有抗感染作用的纳米胶原/磷酸钙骨修复材料及其制备方法。
背景技术：
据AO组织报道，目前在使用内固定的人群中约5%发生了感染，平均每例感染的治疗费用在15000美元。在固定物相关感染发生率高、抗生素耐药菌株日益增加和系统性全身应用抗生素局限性逐渐被认识的背景下，局部预防性或治疗性应用抗生素已成为在固定物相关感染的治疗中具有前景的主要措施之一，尤其是把固定物与抗生素组合或者合成在一起的途径。复合抗生素的局部药物释放系统通过载体向感染部位局部、持续和高浓度地释放抗生素来达到抑制和根治感染的目的，被认为是治疗骨髓炎的有效方法。人工骨具有良好的抗生素缓释能力，部分人工骨还具有一定的骨诱导能力，以人工骨作为抗生素缓释载体治疗感染性骨缺损具有广阔的应用前景。庆大霉素PMMA珠链因局部缓释高浓度抗生素、且血药浓度低、毒性及副作用小等优点成为创伤后骨髓炎治疗的重要方法。然而，临床应用表明PMMA在体内不能降解，需再次手术取出，加重患者痛苦，因此PMMA在骨髓炎治疗中的应用正逐渐为其他可降解材料取代。磷酸钙材料如石膏、β -磷酸三钙及烧结的羟基磷灰石(sintered hydroxyapatite, SHA)由于生物相容性好，也已作为药物载体进行应用。但石膏的吸收速率太快超过新骨生成速度，对新骨不能提供很好的支持，β -TCP吸收速度很慢，而SHA由于结晶度很高在体内几乎不降解，所以这些材料都不是理想的抗生素载体材料。另一个应用于临床的生物可降解材料是胶原海绵，但近期的研究证据表明抗生素的释放时间可能仅持续4d。骨修复材料的研制开发一直是生物医学工程领域大批科学工作者努力的方向。现在手术中实际使用的骨修复材料效果最好的是自体骨和异体骨。但是自体骨数量有限，而异体骨又有免疫排斥和感染疾病的危险。人们已经开发了由金属、陶瓷、高分子以及其复合材料制成的多种骨修复材料。但是这些材料各有不足，在临床中没有哪一种能与自体骨或异体骨媲美。考虑到自体骨和异体骨的生物学优势主要在于它们的结构和成分与天然骨完全相同，骨组织工程的原理认为一个具有和天然骨相似的组成和微观结构的框架材料将会具有优异的生物学性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的制备方法，得到可降解、生物相容性好、能均勻、长期、局部的释放药物和具有高度孔隙率、多孔的框架材料。一种抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的制备方法，按照如下步骤进行(1)将胶原溶解在酸性溶液中，配制5. 0 X 10_5 5. 0 X 10_3g/ml的胶原溶液，向胶原溶液中缓慢滴加钙离子溶液，滴加量为每克胶原滴加钙离子0. 01 0. 16mol ；
(2)向步骤(1)制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加含磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子中磷元素的量与加入的钙离子的量的摩尔比为2 1 ；(3)向步骤⑵制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液至pH为6 8，pH值用试纸或pH计测定，在pH为5 6时开始出现沉淀，pH值为7时出现白色悬浊液；(4)将白色悬浊液静置1 5天，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水清洗后， 放入冻干机内冷冻干燥，随后研磨制得干粉备用；(5)将分子量为100，000的左旋聚乳酸溶于溶剂1，4_ 二氧六环，在室温下搅拌；(6)在步骤(5)制成的溶液中加入步骤⑷制得的干粉，并混合均勻，制成混合溶液，干粉与左旋聚乳酸的质量比为1 (0.6-2);(7)在步骤(6)制成的混合溶液中加入万古霉素，加入量不超过混合溶液总质量的5% ；(8)将步骤(7)制成的材料放入冻干机中冻干；(9)将冻干后的材料参照相关国标用Co6tl照射消毒后保存，即得抗感染纳米胶原/ 磷酸钙骨修复材料。所述酸性溶液为盐酸、硝酸或乙酸溶液。所述抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料具有多微孔结构，微孔直径为50 500 微米，微孔大量连通，孔隙率为70% 90%，力学抗压强度为1. 52Mpa。本发明的有益效果本发明的方法制备的抗感染胶原基骨修复材料，具有优异的生物相容性，而且结构上也具有仿骨性。其钙磷盐晶体尺寸在纳米量级，与有机成分胶原的结合紧密，材料具有大量连通的50 500微米微孔，且孔隙率约为70% 90%。此材料的强度和生物相容性也很好，能促进骨髓间充质干细胞的粘附和伸展。材料体外释放30天仍具有抑菌效果。力学抗压强度满足松质骨最低强度。载药骨材料体外释放药液不影响成骨细胞的黏附、伸展。
图1为抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的XRD谱图；图2为抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的药物释放曲线；图3为抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的抑菌环直径；图4为骨髓间充质干细胞在抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料上的伸展电镜图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1所用材料为I型胶原凝胶(浓度固含量1%，所含胶原为纯化的牛皮胶原)、分析纯CaCl2 · 6H20、分析纯Na2HPO4、分析纯的1，4_ 二氧六环、左旋聚乳酸(PLLA)分子量 100，000。(1)将20g胶原凝胶溶解在0. 5M乙酸溶液中，配制7. 0 X 10_4g/ml的胶原溶液，向胶原溶液中缓慢滴加CaCl2溶液，滴加量为每克胶原滴加钙离子0. 09mol ；
(2)向步骤⑴制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加Na2HPO4水溶液，加入的Na2HPO4与加入的CaCl2的摩尔比为2 1 ；(3)向步骤⑵制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液至pH为6 8，pH值用试纸或pH计测定，在pH为5 6时开始出现沉淀，pH值为7时出现白色悬浊液；(4)将白色悬浊液静置1 5天，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水清洗后， 放入冻干机内冷冻干燥，随后研磨制得干粉备用；(5)将分子量为100，000的左旋聚乳酸溶于溶剂1，4_ 二氧六环，在室温下搅拌；(6)在步骤(5)制成的溶液中加入步骤⑷制得的干粉，并混合均勻，制成混合溶液，干粉与左旋聚乳酸的质量比为1 0.6;(7)在步骤(6)制成的混合溶液中加入万古霉素，加入量不超过混合溶液总质量的5% ；(8)将步骤(7)制成的材料放入冻干机中冻干；(9)将冻干后的材料参照相关国标用CcT照射消毒后保存，即得抗感染纳米胶原/ 磷酸钙骨修复材料。实施例2所用材料为I型胶原凝胶(浓度固含量1%，所含胶原为纯化的牛皮胶原)、分析纯CaCl2 · 6H20、分析纯Na2HPO4、分析纯的1，4_ 二氧六环、左旋聚乳酸(PLLA)分子量 100，000。(1)将20g胶原凝胶溶解在0. IM盐酸溶液中，配制5. 0 X 10_5g/ml的胶原溶液，向胶原溶液中缓慢滴加CaCl2溶液，滴加量为每克胶原滴加钙离子0. Olmol ；(2)向步骤⑴制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加Na2HPO4水溶液，加入的Na2HPO4与加入的CaCl2的摩尔比为2 1 ；(3)向步骤⑵制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液至pH为6 8，pH值用试纸或pH计测定，在pH为5 6时开始出现沉淀，pH值为7时出现白色悬浊液；(4)将白色悬浊液静置1 5天，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水清洗后， 放入冻干机内冷冻干燥，随后研磨制得干粉备用；(5)将分子量为100，000的左旋聚乳酸溶于溶剂1，4_ 二氧六环，在室温下搅拌；(6)在步骤(5)制成的溶液中加入步骤⑷制得的干粉，并混合均勻，制成混合溶液，干粉与左旋聚乳酸的质量比为1 1;(7)在步骤(6)制成的混合溶液中加入万古霉素，加入量不超过混合溶液总质量的5% ；(8)将步骤(7)制成的材料放入冻干机中冻干；(9)将冻干后的材料参照相关国标用CcT照射消毒后保存，即得抗感染纳米胶原/ 磷酸钙骨修复材料。实施例3所用材料为I型胶原凝胶(浓度固含量1%，所含胶原为纯化的牛皮胶原)、分析纯CaCl2 · 6H20、分析纯Na2HPO4、分析纯的1，4_ 二氧六环、左旋聚乳酸(PLLA)分子量 100，000。(1)将20g胶原凝胶溶解在0. 2M硝酸溶液中，配制5. 0 X 10_3g/ml的胶原溶液，向胶原溶液中缓慢滴加CaCl2溶液，滴加量为每克胶原滴加钙离子0. 16mol ；(2)向步骤⑴制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加Na2HPO4水溶液，加入的Na2HPO4与加入的CaCl2的摩尔比为2 1 ；(3)向步骤⑵制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液至pH为6 8，pH值用试纸或pH计测定，在pH为5 6时开始出现沉淀，pH值为7时出现白色悬浊液；(4)将白色悬浊液静置1 5天，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水清洗后， 放入冻干机内冷冻干燥，随后研磨制得干粉备用；(5)将分子量为100，000的左旋聚乳酸溶于溶剂1，4_ 二氧六环，在室温下搅拌；(6)在步骤(5)制成的溶液中加入步骤⑷制得的干粉，并混合均勻，制成混合溶液，干粉与左旋聚乳酸的质量比为1 2;(7)在步骤(6)制成的混合溶液中加入万古霉素，加入量不超过混合溶液总质量的5% ；(8)将步骤(7)制成的材料放入冻干机中冻干；(9)将冻干后的材料参照相关国标用CcT照射消毒后保存，即得抗感染纳米胶原/ 磷酸钙骨修复材料。实施例4材料晶体结构测试用08DISC0VER高分辨率衍射仪(德国西门子公司)对空白胶原基骨材料和载药胶原基骨材料进行测试分析。最大功率2. 2KW测角仪2最小步距0. 0002度测角仪最小步距0. 0001度角度重复性0. 0001度。
力学实验。如图1所示，材料晶体结构与天然骨类似。 力学实验结果表明抗压强度大于松质骨的最低抗压强度(表1)。 表抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的抗压强度
样品M1doA0n=3MPammmmmmA211.44151078.5421.50151078.5431.61151078.54X1.52151078.54S0.08610.0000.0000.00M表示抗压强度实施例5体外降解实验样品放入带盖的洗提瓶中，用一定体积pH 7.2的PBS在37°C下洗提(或恒温振荡)，每隔2d将洗提液取出放在-70°C下保存，并更换新鲜洗提液，测试时间点3d，5d，9d， 13d，19d，23d，25d，27d，31d。采用TU-1901双光束紫外可见分光光度计，进行溶液的光谱测量、光度测量及定量测定。结果如图2所示，释放30天药物浓度为70 μ g/mL仍高于最低抑菌浓度。PBS 溶液的配置依次将 8. Og NaCUO. 2g KCl,2. 9g Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g KH2PO4 溶于800mL三蒸水中，搅拌溶解，用lmol/L HCl或NaOH液调节pH值至7. 0-7. 2，定容至1000mL容量瓶中。实施例6抑菌实验取金黄色葡萄球菌(S. aureus, ATCC 25923，美国)接种于LB培养基中，37°C培养 20h后将菌液稀释为107cfu/ml，接种于培养板表面。将灭菌后样品倒置于培养板中，样品表面与细菌接触，在37°C恒温箱中静置。每3天将试样移植到新细菌培养板中，并测量所用细菌培养板中出现的抑菌环(Zone ofinhibition，Ζ0Ι)直径。结果如图3所示，30d材料仍有有抑菌效果，抑菌环直径为(11 士0. l)mm。实施例7细胞试验材料表面培养细胞的扫描电镜观察将消毒后样品分别放入无菌6孔板中，用含 10%胎牛血清的DMEM培养液预湿8小时，吸出培养液，每孔中加入3. Oml密度IX IO6个/ ml同步化处理后BMSCs细胞悬液，并同时接种无样品孔作为空白对照，在37°C、0)25%、湿度99%条件细胞培养箱中培养。在倒置显微镜下随时观察各孔内细胞生长情况，在培养 24h后，弃去实验组样品孔培养液，PBS冲洗2次，除去样品表面未贴壁细胞，将样品放入新 24孔板中，加4°C预冷的2. 5%戊二醛，在4°C固定2h，吸出固定剂，然后将样品用PBS浸洗 2次，每次lOmin，再用4°C预冷的锇酸，4°C固定lh，PBS浸洗2次，每次lOmin。依次乙醇系列梯度脱水、(X)2临界点干燥、喷金后，用JSM-300型扫描电镜观察材料表面细胞的形态及材料表面形貌变化。扫描电镜能显示材料表面形貌及黏附细胞的整个轮廓，可细致地观察其伪足的伸展、基质颗粒的分泌等。材料表面培养细胞的扫描电镜观察如图4所示在材料上生长的细胞能伸出较多的伪足，且非常牢固，表明材料具有良好的生物相容性。
权利要求
1.一种抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行(1)将胶原溶解在酸性溶液中，配制5.OX 10_5 5. OX 10_3g/ml的胶原溶液，向胶原溶液中缓慢滴加钙离子溶液，滴加量为每克胶原滴加钙离子0. 01 0. 16mol ；(2)向步骤(1)制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加含磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子中磷元素的量与加入的钙离子的量的摩尔比为2 1 ；(3)向步骤(2)制成的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液至pH为6 8，pH值用试纸或PH计测定，在pH为5 6时开始出现沉淀，pH值为7时出现白色悬浊液；(4)将白色悬浊液静置1 5天，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水清洗后，放入冻干机内冷冻干燥，随后研磨制得干粉备用；(5)将分子量为100，000的左旋聚乳酸溶于溶剂1，4_二氧六环，在室温下搅拌；(6)在步骤(5)制成的溶液中加入步骤(4)制得的干粉，并混合均勻，制成混合溶液，干粉与左旋聚乳酸的质量比为1 (0.6-2);(7)在步骤(6)制成的混合溶液中加入万古霉素，加入量不超过混合溶液总质量的5% ；(8)将步骤(7)制成的材料放入冻干机中冻干；(9)将冻干后的材料参照相关国标用Co6°照射消毒后保存，即得抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料。
2.根据权利要求1所述一种抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液为盐酸、硝酸或乙酸溶液。
3.根据权利要求1所述一种抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料具有多微孔结构，微孔直径为50 500微米，微孔大量连通，孔隙率为70 % 90 %，力学抗压强度为1. 52Mpa。
全文摘要
本发明公开了属于生物医用材料领域的一种抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料的制备方法。本发明首先在酸溶的胶原溶液中缓慢滴加含钙离子的溶液和含磷酸根离子的水溶液，滴加NaOH溶液调pH值，冷冻干燥后研磨制得干粉备用，用1，4-二氧六环溶解左旋聚乳酸，搅拌一定时间，与干粉混合均匀，最后加入万古霉素搅拌均匀，采用冻干的方法去溶剂制备抗感染纳米胶原/磷酸钙骨修复材料。本发明制备的骨修复材料，具有优异的生物相容性、抗感染性、类似人骨的微结构。
文档编号A61L27/12GK102205150SQ20111013087
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者崔福斋, 王秀梅, 胡堃, 胡艳丽, 连小洁, 郭文广 申请人:北京奥精医药科技有限公司, 清华大学