专利名称：壳聚糖-dna纳米颗粒复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物及其制备方法。
背景技术：
基因治疗一直是人们关注的热点之一，它可以通过填补缺失的基因、替换有缺陷的基因或沉默不需要的基因来治疗遗传性和非遗传性疾病。但裸露的基因在体内很容易被核酸酶降解，转染效率很低。因此，发展安全高效的基因载体成为基因治疗成功的先决条件。近年来，主要的基因载体系统分为病毒和非病毒载体两种。虽然病毒载体在体内有较高的转染效率，但存在可能的毒性、易引起免疫反应及产生炎症的风险。非病毒载体包括脂质体和阳离子复合物，脂质体目前虽被广泛应用于细胞转染，但其包封率低、贮存稳定性差、容易被血液中的成分清除，使其在生物整体的应用受到限制。因此，人们将目光转向了非病毒载体中富含阳离子且骨架包含氨基的聚合物。其中，壳聚糖作为一种聚阳离子基因载体正受到人们的广泛关注。甲壳素在脱乙酰度达50%-100%之间时，成为壳聚糖(Chitosan，CS)，系统名 (1，4) -2-氨基-2-脱氧-β -D-葡聚糖，可溶于酸性水溶液形成自身带正电荷的大分子。壳聚糖大分子能够与DNA相互作用形成壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物(CNPs-DNA)，且此复合物对DNA有一定的保护作用，使其免受核酸酶的降解，并具有黏膜附着剂的性质。除此之外， 壳聚糖纳米颗粒DNA复合物的粒径大小适于细胞吞噬，且表面带有适量正电荷可与带负电的细胞膜产生静电吸附作用，进而打开上皮细胞之间的紧密连接使大分子物质通过细胞间隙运输，对细胞无毒副作用。因而可作为良好的基因载体用于基因转染。影响壳聚糖纳米粒体外基因转染效率的因素很多，主要包括壳聚糖的分子量、脱乙酰度、壳聚糖氨基与DNA磷酸基比例(N/P)、DNA浓度、pH值、离子强度、温度等。因此，研究壳聚糖的各种影响因素对转染效率的影响，探寻最有效的CNPs-DNA，对提高目标基因的转染效率有重要意义，为基因治疗奠定了基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物(CNPs-DNA)。本发明的目的之二在于提供该复合物的制备方法。为达以上目的，本发明通过下述方案实现
一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物，其特征在于该复合物为壳聚糖上的氨基质子化为一NH3+,与荧光蛋白质粒DNA上的磷酸基以静电作用结合而形成，其中N:P的摩尔比为 4-8。上述的荧光蛋白质粒为绿色荧光蛋白质粒。上述的绿色荧光蛋白质粒为pEGFP_Cl。一种制备上述的壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.将经纯化的壳聚糖溶于10%醋酸中配制成浓度为2g/L的溶液，调节pH为5-6，得壳聚糖原液，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌；
b.将步骤a所得壳聚糖原液稀释成0.2-0. 8g/L，调pH为6_8，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌备用；
c.将荧光蛋白质粒DNA用浓度为25-75mmol/L的Na2SO4水溶液稀释为100—400 μ g/ ml的溶液；
d将步骤b和步骤c所得的壳聚糖稀释液和质粒溶液置于55°C保温30 min ； e.按M孔板每孔以IOul壳聚糖溶液与10ul、400ug/ml质粒溶液的比例混合30 s，室温下静置1小时。本发明的复合物能保护DNA免受核酸酶的降解，并与带负电的细胞膜产生静电吸附作用，促进细胞的内吞作用，实现目的基因的转染。该复合物细胞毒性低，因而可作为良好的基因载体用于基因转染。实现了目标基因的转染，为基因治疗的应用提供了有力的条件。
图1为本发明的凝胶阻滞实验，其中A，A’为裸质粒DNA;B，B’为CS ;C_I分别为 N/P=10、8、6、4、2、l、l/2 的 CNPs-DNA。图2为本发明的DNaseI消化后，其中A，A’为裸质粒DNA ；B, B’为CS ；C-I分别为 N/P=10、8、6、4、2、l、l/2 的 CNPs-DNA。图3为倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，其中A为裸质粒转染组；B为 Lipofectamine 2000 转染组；C、D、E 分别为 N/P=8、6、4 的 CNPs-DNA 转染组)。图4为本发明的流式细胞仪检测转染效率，其中A为裸质粒转染组；B为 Lipofectamine 2000 转染组；C、D、E 分别为 N/P=8、6、4 的 CNPs-DNA 转染组。图5为CNPs-DNA的细胞毒性实验。
具体实施方案下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例一壳聚糖纳米颗粒DNA复合物CNPs-DNA的制备
(1)称20mg纯化后的壳聚糖溶于10%的醋酸，可微微加热(勿超42°C )，待壳聚糖颗粒完全溶解后，用IOM的NaOH溶液粗调pH为5. 5，得0. 2% (w/v)的壳聚糖原液，经0. 22 μ m 滤膜过滤除菌。(2)取适量的壳聚糖原液稀释成浓度为0. 08% (w/v)的壳聚糖溶液，用IOM的NaOH 溶液调PH为6. 5-7. 0之间，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌备用。(3)质粒DNA (pEGFP-Cl)用蒸馏水稀释为400 μ g/ml的DNA溶液，加入1/10体积 500mM的Na2SO4溶液(使其终浓度为50mM)。(4)将壳聚糖溶液与质粒溶液分别置于55°C恒温孵育器上保温30 min。等体积混合后，迅速于涡旋器上混合30s，室温下静置lh，即得壳聚糖纳米颗粒DNA复合物CNPs-DNA， 可用于后续转染实验。实施例二 对CNPs-DNA物理性质的测定
41.凝胶电泳阻滞和DNase I的消化实验请具体说明凝胶电泳阻滞消化实验的具体步
骤，
(1)凝胶电泳阻滞实验=CNPs-DNA经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳60V，40min，由于壳聚糖包裹DNA后掩盖了 DNA本身的负电荷，使其无法在电泳中从负极向正极移动而被阻滞于上样孔中。(2) DNase I 的消化实验=CNPs-DNA 中加入 0. 5U DNase I (lU/ul)，37°C温浴 lh, 经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳60V，40min,被包裹的DNA滞留在上样孔中，未被包裹的DNA被 DNase I消化降解。以此来判断壳聚糖纳米颗粒对DNA的保护能力。参见图1和图2，说明 CNPs-DNA能够有效保护DNA免受DNase I的消化。的粒径和kta电位测定使用ktasizerfOOOHS粒度及电位分析仪测定其平均粒径和kta电位。参见表1
表1 不同N/P的CS-DNA粒径及kta分布情况
权利要求
1.一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物，其特征在于该复合物为壳聚糖上的氨基质子化为一NH3+,与荧光蛋白质粒DNA上的磷酸基以静电作用结合而形成，其中N:P的摩尔比为 4-8。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物，其特征在于所述的荧光蛋白质粒为绿色荧光蛋白质粒。
3.根据权利要求2所述的壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物，其特征在于所述的绿色荧光蛋白质粒为pEGFP-Cl。
4.一种制备根据权利要求1所述的壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.将经纯化的壳聚糖溶于10%醋酸中配制成浓度为2g/L的溶液，调节pH为5-6，得壳聚糖原液，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌；b.将步骤a所得壳聚糖原液稀释成0.2-0. 8g/L，调pH为6_8，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌备用；c.将荧光蛋白质粒DNA用浓度为25-75mmol/L的Na2SO4水溶液稀释为100—400 μ g/ ml的溶液；d将步骤b和步骤c所得的壳聚糖稀释液和质粒溶液置于55°C保温30 min ；e.按M孔板每孔以IOul壳聚糖溶液与10ul、400ug/ml质粒溶液的比例混合30 s，室温下静置1小时。
全文摘要
本发明涉及一种壳聚糖-DNA纳米颗粒复合物及其制备方法。该复合物为该复合物为壳聚糖上的氨基质子化为—NH3+，与银光蛋白质粒DNA上的磷酸基以静电作用结合而形成，其中N:P的摩尔比为4-8。本发明的复合物能保护DNA免受核酸酶的降解，并与带负电的细胞膜产生静电吸附作用，促进细胞的内吞作用，实现目的基因的转染。该复合物细胞毒性低，因而可作为良好的基因载体用于基因转染。实现了目标基因的转染，为基因治疗的应用提供了有力的条件。
文档编号A61K47/36GK102205134SQ20111013065
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者刘芳, 文铁桥, 霍一楠 申请人:上海大学