专利名称：结核耐药相关外排蛋白来源抗结核ctl表位肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及结核病治疗性多肽疫苗，尤其是涉及利用结核杆菌自身耐药相关抗原筛选出的具有治疗活性的抗结核CTL表位肽，本发明还涉及该肽在制备结核病治疗性多肽疫苗中的应用。
背景技术：
耐药结核分枝杆菌数量的日益增加是造成近年来结核病死灰复燃、卷土重来的重要原因。结核分枝杆菌耐药机制主要分天然耐药机制和获得性耐药机制。获得性耐药主要是由于耐药相关基因的点突变，而天然耐药机制主要由于细胞壁的通透性障碍和活跃外排泵系统。因此，药物外排系统可以成为重要的耐药结核治疗靶点。近年来在动物模型及临床研究中发现，CD8+ CTL在抗结核感染保护性应答中起着重要和独特的作用，CD8+ CTL对靶细胞发挥杀伤作用，必须能识别靶细胞表面与相应MHC-I类分子结合的特异性抗原表位，即细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位。 目前研究的CD8+CTL蛋白抗原表位，主要集中在结核菌特异的分泌蛋白上，如ESAT-6、CFP-10、 CFP-21、MPT64、Ag85复合物等，而对于膜蛋白尤其是药物外排蛋白CD8+CTL表位报道很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一类结核耐药相关外排蛋白来源的抗结核CTL表位肽，本发明还提供该类肽在制备结核病治疗性多肽疫苗中的应用。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的结核耐药相关外排蛋白来源抗结核CTL表位肽为九肽，所述九肽的氨基酸序列为
P5 Tyr-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Gly-Pro-Val 或 P6 Tyr-IIe-Val-Gly-Phe-Cys-Leu-Leu-Val 或 P7 Thr-Leu-Thr-Trp-Leu-Phe-Ala-Phe-Val 或 P8 =Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val 或 P9 :Ala-Leu-Gly-Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu 或 PlO :Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu-Pro-Cys-Leu 或 Pll Leu-Leu-Cys-Ala-IIe-Phe-Ala-Glu-Val 或 P12 :Arg-Leu-Trp-Pro-Thr-Val-Gly-Cys_Leu0本发明所述的结核耐药相关外排蛋白来源抗结核CTL表位肽在制备结核病治疗性多肽疫苗中的应用。本发明是根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、BIMAS 和NetCTL 1. 2数据库对结核耐药相关蛋白抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位进行了预测分析，筛选获得表位肽。然后通过体外ELISP0T实验对预测表位肽进行鉴定。本发明采用理论和实验相结合的方法初步鉴定出能够体外诱导CTL的表位肽，鉴定的九肽未见文献报道，为研制基于耐药相关蛋白抗原的结核疫苗提供了理论基础，并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位肽疫苗提供更多的信息。
图1-8是本发明表位肽的质谱分析图谱。图9-16是本发明表位肽诱导的特异性CTL分泌IFN- γ的能力。
具体实施例方式本发明所述的本发明所述的结核耐药相关外排蛋白来源抗结核CTL表位肽为九肽，所述九肽的氨基酸序列为
Ρ5 =Tyr-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Gly-Pro-Val (YLGGTTGPV )分子量864. 6 (理论值 863. 44)
或 P6 =Tyr-Ile-Val-Gly-Phe-Cys-Leu-Leu-Val (YIVGFCLLV)分子量1026. 7 (理论值:1025. 86)
或 P7 =Thr-Leu-Thr-Trp-Leu-Phe-Ala-Phe-Val (TLTffLFAFV)分子量1097. 7 (理论值:1097. 32)
或 P8 =Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val 值=786. 7)
或 P9 :Ala-Leu-Gly-Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu 值:857.81)
或 PlO :Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu-Pro-Cys-Leu 值930. 24)
或 Pll Leu-Leu-Cys-Ala-IIe-Phe-Ala-Glu-Val 值=977. 52)
或 P12 Arg-Leu-Trp-Pro-Thr-Val-Gly-Cys-Leu 值:1043. 56)。本发明主要采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL 1. 2数据库对耐药相关外排蛋白的HLA_A*0201 限制性CTL表位进行了预测分析，筛选获得表位肽采用标准的Fmoc方案进行合成，经HPLC 纯化后，其纯度大于90%，质谱分析并证实其分子量符合理论值。各肽质谱鉴定图见图1-8。本发明表位肽的合成及制备采用固相合成法合成CTL表位肽。基本流程如下首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的肽。经HPLC 纯化后，其纯度大于90%，质谱分析并证实其分子量符合理论值。(参见①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②.N.休厄德、H. D.贾库布克著，刘克良等译，肽化学与生物学，科学出版社，2005年。)
(GLVAGLSAV)分子量786. 7 (理论 (ALGMLIAGL)分子量858. 7 (理论 (MLIAGLPCL)分子量930. 6 (理论 (LLCAIFAEV)分子量978. 6 (理论 (RLWPTVGCL)分子量1044. 6 (理论人外周血单个核细胞(PBMCs)的分离与ELISP0T实验检测
抽取健康供者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加白细胞介素2 (IL-2， Peprotech公司)和人β 2微球蛋白诱导分化CTL细胞，进一步在体外ELISP0T实验进行验证。方法如下
1. PBMCs的分离与诱导(1)以40ml PBS (PH 7. 2)稀释抗凝处理后的外周血40ml ； (2)离心管中加入細1 Lymphoprep分离液(Axis-Shield公司)；(3)加8ml步骤(1)中稀释后的外周血于4ml Lymphoprep分离液液面上；(4) 20°C离心(2000rmpX20min) ； (5)离心后，分为四层，弃去最上层，用玻璃吸管吸取第二层即白膜层(富含PBMCs); (6)吸出的白膜层用PBS CpH 7. 2)离心洗涤两次；(7)用M孔板铺板，细胞的浓度为IX 10 6/ml，每孔 Iml ； (8)第二天每孔加入3 PgAi^2微球蛋白和10 μ g表位肽，同时设立PBS组(以PBS 替代表位肽)作为阴性对照组；(9)第三天每孔加入50u IL-2;每2 3天换液，于七天后进行第二轮荷肽(即每孔补加50u IL-2U0 PgAi^2微球蛋白和10 yg表位肽/PBS)， 十四天后进行第三轮荷肽。第三轮荷肽后3天，得到效应细胞CTL，然后进行ELISP0T实验检测IFN-Y释放。2. ELISP0T实验具体实验步骤如下(1)封闭取出所需板条，用含5% FCS RPMI 1640培养基的培养基封闭，200 μ L /孔，室温下(25°C)静置5 10 min后将其扣出(FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应)；(2)细胞上板诱导的CTL作为效应细胞(IX IO5/孔)，荷肽的T2A2细胞作为刺激细胞(IX IO5/孔)铺板。100 μ L/孔。细胞在孔中的分布要尽量均勻(加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISP0T板)；·正对照细胞浓度为IX IO5/孔、加入10 UL ΡΗΑ，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌；·背景负对照加入100 μ L的含5%FCS的RPMI 1640培养基；(3)加完所有的样品之后，盖上板盖，放入0)2培养箱，37 °C培养18h; (4)裂解细胞倾倒孔内的细胞及培养基，200 μ L/孔加入冰冷的去离子水，4 ！冰浴反应10 min(低渗法裂解细胞)；(5)洗涤倾倒孔内的液体，IX的Washing Buff er，200 μ L/孔，洗涤5 7次，每次停留30 60 s，最后一次，在吸水纸上扣干；(6)加入检测抗体孵育每孔加入100 μ L稀释好的生物素标记检测抗体，37 °C孵育Ih ； (7)洗涤倾倒孔内的液体，1 X的Washing Buffer, 200 μ L/孔，洗涤5次，每次停留时间为3(T60 s，最后一次，在吸水纸上扣干；(8)酶联亲和素孵育将稀释好的酶联亲和素工作液加入到实验孔，100 μ L/孔，37 °C孵育Ih; (9)洗涤倾倒孔内的液体， IX的Washing Buffer，200uL/孔，洗涤5次，每次停留时间为30 60 s，最后一次，在吸水纸上扣干；(10)显色解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100 PL的显色液，室温静置 15-45min (在20 -25° C，显色25min较合适)，注意避光；(11)终止显色倾倒孔内液体， 揭开板底座，以去离子水洗涤3飞遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜自然晾干；用ELISP0T图象分析仪计数96孔板中每孔形成的斑点数。体外ELISP0T实验结果显示候选肽均能够在健康供者的外周血中诱导获得 CTLs,且获得的CTLs经刺激后与阳性肽相比较均有较高量的IFN- γ分泌(如图9_16所示)。本发明利用结核杆菌自身的耐药相关外排蛋白抗原筛选出具有抗结核的治疗性活性肽，为研制基于抗原表位的结核疫苗提供了理论基础，并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位肽疫苗提供更多的信息。
权利要求
1.一种结核耐药相关外排蛋白来源抗结核CTL表位肽，其特征在于所述表位肽为九肽，所述九肽的氨基酸序列为P5 Tyr-Leu-Gly-Gly-Thr-Thr-Gly-Pro-Val 或 P6 Tyr-IIe-Val-Gly-Phe-Cys-Leu-Leu-Val 或 P7 Thr-Leu-Thr-Trp-Leu-Phe-Ala-Phe-Val 或 P8 :Gly-Leu-Val-Ala-Gly-Leu-Ser-Ala-Val 或 P9 :Ala-Leu-Gly-Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu 或 PlO :Met-Leu-IIe-Ala-Gly-Leu-Pro-Cys-Leu 或 Pll Leu-Leu-Cys-Ala-IIe-Phe-Ala-Glu-Val 或 P12 :Arg-Leu-Trp-Pro-Thr-Val-Gly-Cys_Leu0
2.根据权利要求1所述的结核耐药相关外排蛋白来源抗结核CTL表位肽在制备结核病治疗性多肽疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种结核耐药相关外排蛋白来源抗结核CTL表位肽为九肽，所述九肽的氨基酸序列为P5YLGGTTGPV，或P6YIVGFCLLV，或P7TLTWLFAFV，或P8GLVAGLSAV，或P9ALGMLIAGL，或P10MLIAGLPCL，或P11LLCAIFAEV，或P12RLWPTVGCL。本发明根据抗原的一级结构,采用免疫信息学手段,运用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL1.2数据库对结核耐药相关蛋白抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位进行了预测分析，筛选获得表位肽，鉴定的九肽未见文献报道。通过体外ELISPOT实验对表位肽进行鉴定，其结果为研制基于耐药相关蛋白抗原的结核疫苗提供了理论基础,并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位肽疫苗提供更多的信息。
文档编号A61K39/04GK102212113SQ20111013864
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者吴亚红, 朱宇皇, 祁元明, 陈艳平, 陈飞, 韩艳林, 高艳锋 申请人:郑州大学