专利名称：日本血吸虫SjLGL基因的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫SjLGL基因的siRNA及其应用。
背景技术：
血吸虫病是一种人和动物都会受传染的寄生虫病，流行范围广，对人和家畜均产生严重危害。目前，主要采用药物，例如吡喹酮，对已经感染血吸虫病的人或动物进行治疗， 但是吡喹酮药物进行口服时，“首过效应”大，生物利用度差，影响了临床应用效果。有必要寻找新的治疗血吸虫病的药物。幼虫巨大致死基因(Lethal Giant Larvael，LGL)，是指突变时能够引起细胞过度增殖导致组织过度增生的基因。LGL基因突变能够导致果蝇上皮细胞过度增殖、极性丧失、 不能分化及上皮单层细胞结构被破坏等类似于人类癌性肿瘤的表型。其突变表型主要表现在幼虫阶段，即幼虫上皮细胞极性丧失，过度增殖且不能正常分化，导致不能成蛹，最后形成“巨大幼虫”而死亡。LGL基因的存在并不仅仅局限果蝇，LGL基因的同系物已经在人类、 小鼠、大鼠、牛、昆虫、蠕虫、黏菌和酵母菌中被鉴定，在不同物种间高度保守的同源基因很可能同样行使着调节细胞极性与增殖的保守功能。在2009年发表的日本血吸虫基因组测序工作和曼氏血吸虫基因组测序工作中都报道了血吸虫体内LGL基因的存在。日本血吸虫LGL基因(SjLGL)，其基因序列在GenBank 中的编号为AY812588。在前期研究工作中本课题组在酵母系统和哺乳动物细胞体系内成功证实血吸虫LGL蛋白和血吸虫抱雌沟蛋白之间存在着相互作用。而抱雌沟蛋白是一种在血吸虫雄虫抱雌沟部位表达并通过雌雄合抱传递给雌虫的具有影响血吸虫雌雄虫合抱功能的性别特异性物质，且具有发育调节功能。研究证明哺乳动物中与抱雌沟蛋白同源的 Periostin蛋白作为重要的发育调节因子在心脏发育、骨骼和牙齿发生及维持方面发挥重要作用；临床研究还发现Periostin蛋白与人类多种肿瘤的发生、发展及转移有关，这一点与LGL蛋白在人类肿瘤中的作用有一定的相关性。LGL与血吸虫抱雌沟蛋白之间的相互作用预示着二者功能上的相关性，因此研究LGL基因的功能以及LGL基因与其他基因间的相互作用具有十分重要的意义。RNA干扰(RNAi)技术目前已经在功能基因组学、基因治疗、微生物学研究和药物研发等领域里取得了令人瞩目的进展。RNA干扰是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是双链RNA(dsRNA)介导的、序列特异的靶基因转录后基因沉默的过程。将与靶基因转录的产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。所谓的小分子干扰RNA (small interfering RNAs, siRNAs)，是为能够以同源互补序列mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片段双链RNA分子，通常由20多个核苷酸组成，能进行特异性的转录后基因沉默。SiRNA 已经广泛应用于基因表达调控机制研究等领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫SjLGL基因的siRNA，该siRNA可明显抑制SjLGL基因的转录，可用于制备治疗血吸虫病的药物。此外，还需要提供一种日本血吸虫SjLGL基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫SjLGL基因的siRNA，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；SEQ ID NO. 5和SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列。优选的，所述siRNA为SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供了一种治疗血吸虫病的药物，所述药物的活性成分为 通过RNA干扰抑制日本血吸虫SjLGL基因表达的siRNA。优选的，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列；SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示的核苷酸序列；SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6所示的核苷酸序列。更优选的，所述siRNA为SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列。在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫SjLGL基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫SjLGL基因的siRNA在制备预防血吸虫病的疫苗中的应用。本发明日本血吸虫SjLGL基因的siRNA，可用于干扰日本血吸虫SjLGL基因转录、 表达及血吸虫的生长发育，小鼠的体内RNA干扰实验表明，该siRNA能显著降低感染小鼠肝脏虫卵孵化率，适于制备治疗血吸虫病的药物。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例1实时定量PCR分析各处理组SjLGL基因的转录结果图；图2是本发明实施例2实时定量PCR分析各处理组SjLGL基因的转录结果图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京科学出版社，200 中所述的方法进行。实施例1体外RNA干扰1.方法步骤1. 1童虫培养基的配制
兔血清10%水解乳蛋白0.1%胰岛素0.2unit/ml氢化可的松0.000001mol/l5-羟色胺0.000001mol/l次黄嘌呤0.0000005mol/l青霉素100unit/ml硫酸链霉素100ug/ml溶解于RPMI-1640中，定容至IOOOml，用孔径为0. 22 μ m滤器过滤，4°C保存。1. 2兔红细胞的制备(1)在无菌的1. 5ml离心管中加入少许含0. 肝素钠的高压灭菌的PBS溶液并
震荡数次，使其涂布管壁；(2)新西兰大白兔耳缘静脉采血1ml，迅速转移入含有肝素的离心管中；轻轻摇动离心管，使抗凝剂混勻；(3) 40C，1500rpm 离心 lOmin，弃上清；(4)向管中加入Iml灭菌PBS和少量双抗，用微量移液器轻轻吹吸混勻；(5) 40C，1500rpm 离心 lOmin，弃上清；(6)重复步骤0)、( 三次，然后吸掉大部分上清，于4°C保存。1. 3siRNA分子和SjLGL基因实时定量PCR引物的准备在NCBI 网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找出血吸虫 LGL 基因序列 (AY812588)。设计并合成三对dsRNA。同时，合成一对无关对照dsRNA(NC dsRNA)为sense :5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3，(SEQ ID NO. 7)，Anti-sense :5，-AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3，(SEQ ID NO. 8)；三对日本血吸虫LGL基因的dsRNA小分子为sIdsRNA :sense :5，-GGUCGACUUUAAAGUUCAATT-3，(SEQ ID NO. 1)，Anti-sense :5，-UUGAACUUUAAAGUCGACCTT-3，(SEQ ID Ν0· 2)，该第一对 siRNA 针对的靶点序列是GGUCGACUUUAAAGUUCAA ；s2dsRNA sense :5，-GCUUGUUGCUGUUGAUUUATT-3，(SEQ ID N0. 3)，Anti-sense :5，-UAAAUCAACAGCAACAAGCTT-3，(SEQ ID N0. 4)，该第二对 siRNA 针对的靴点序列是GCUUGUUGCUGUUGAUUUA ；s3dsRNA sense :5，-AGCU⑶UA⑶GAUCAACUATT-3，(SEQ ID N0. 5)，Anti-sense :5，-UAGUUGAUCACUAACAGCUTT-3，(SEQ ID N0. 6)，该第三对 siRNA 针对的靶点序列是AG⑶⑶UA⑶GAUCAACUA。根据SjLGL的基因序列，设计实时定量PCR引物，然后送公司(Invitrogen)合成。Sense 5' -CTGATTTTCCATTCGTTTG-3，(SEQ ID N0. 9)，
Anti-sense :5，-GTTGTCTACCATGAAGGCA-3，(SEQ ID NO. 10)。1. 4日本血吸虫12天童虫的收集和培养新西兰大白兔腹部人工贴片感染日本血吸虫尾蚴，每只感染8000条，于感染后的 12天剖杀，无菌静脉灌注冲虫，收集虫体。用加有双抗的PBS冲洗三次，放入无菌离心管中， 盖上管盖，70%酒精喷施后，立即转入超净工作台中，再用37°C预热过的童虫培养基洗一次，添加童虫培养基和新鲜的兔红细胞于十二孔培养板进行体外培养。每孔培养基为:3ml， 虫体约为100条。实验共分空白组，无关对照组(NC组)，si、s2、s3dsRNA处理组。培养箱设定二氧化碳浓度为5%，分别于培养的处、2他、7他三次更换培养基。1. 5虫体的处理每种siRNA分子分别加入到培养基中(终浓度均为IOOnM)，持续干扰虫体7天。1. 6体外RNA干扰效果的实时定量PCR验证以Trizol试剂盒提取各处理组日本血吸虫虫体的总RNA，消化基因组，反转录为 cDNA，进行实时定量PCR分析。2.结果如图1所示，三种不同的dsRNA分子均显著地降低了 SjLGL基因的转录水平，其中 sldsRNA组小分子降低的转录水平最低，选取sldsRNA组小分子作为体内RNA干扰用小分子。NC组和空白组相差不多。实施例2体内RNA干扰1.方法步骤(1) dsRNA 注射试验共设对照组、无关对照组(NC组)和sldsRNA处理组，每组共三只小鼠。于感染后的13天、14天、15天和16天分别尾静脉快速注射Iml DEPC水，Iml NC dsRNA (40 μ g) DEPC 水和 Iml SjLGL 基因 sldsRNA(40 μ g)DEPC 水。(2)肝脏虫卵孵化率剖杀后的小鼠，取肝脏称重，加去氯水定容至20ml，用勻浆机混勻后，取細1搅碎液加入鸡心瓶中(鸡心瓶中加入去氯水至瓶颈上3-5cm)，在鸡心瓶液面上塞入棉花，棉花上加入8ml去氯水，孵化2h，2h后将棉花上层8ml液体转移至15ml尖底离心管中， 加入900 μ 1甲醛固定毛蚴，4000rpm水平离心5min，用5ml移液枪吸走上清，管底留少量液体，加入一滴碘酊染液，显微镜下计数。(3)体内RNA干扰效果的实时定量PCR验证以Trizol试剂盒提取各处理组日本血吸虫虫体的总RNA，消化基因组，反转录为 cDNA，进行实时定量PCR分析。2.结果与分析(1)体内RNA干扰效果的RT-PCR分析如图2所示，对照组和处理组小鼠虫体RT-PCR分析表明处理组SjLGL基因的转录水平显著降低，而注射无关dsRNA分子的对照组未见影响。(2) RNA干扰后对肝脏虫卵孵化率的影响Balb/c小鼠于感染日本血吸虫13、14、15、16天尾静脉注射dsRNA，22天剖杀小鼠， 收集小鼠肝脏，称重，虫卵计数，孵化池，计数毛蚴数。计算RNA干扰后的减孵化率，结果表明RNA干扰后处理组的虫卵孵化率较对照组明显降低，减孵化率达80%左右，说明 RNA干扰对日本血吸虫的孵化率有较大的影响(见下表1)。
权利要求
1.一种日本血吸虫SjLGL基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列； SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列； SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述日本血吸虫SjLGL基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA为 SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.一种治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为通过RNA干扰抑制日本血吸虫SjLGL基因表达的siRNA。
4.根据权利要求3所述治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列； SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列； SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述siRNA为SEQID NO. 1 和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
6.权利要求1所述日本血吸虫SjLGL基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。
7.权利要求1所述日本血吸虫SjLGL基因的siRNA在制备预防血吸虫病的疫苗中的应
全文摘要
本发明公开了日本血吸虫SjLGL基因的siRNA，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。本发明还公开了日本血吸虫SjLGL基因的siRNA的应用。本发明日本血吸虫SjLGL基因的siRNA，可明显抑制SjLGL基因的转录，并能显著降低血吸虫感染小鼠的肝脏虫卵孵化率，适用于制备治疗血吸虫病的药物。
文档编号A61P33/12GK102220326SQ201110139530
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者刘萍萍, 刘金明, 杨云霞, 林矫矫, 石艳丽, 金亚美 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所