专利名称：一种具抗β-乳球蛋白过敏效果的乳杆菌完整肽聚糖的制备方法、产品及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肽聚糖的制备方法和应用，特别涉及一种乳杆菌的完整肽聚糖的制备方法，还涉及由该完整肽聚糖制备成的微乳制剂，其制备方法及其在制备抗β-乳球蛋白过敏的免疫增强剂中的应用。属于生物制药领域。
背景技术：
牛乳营养丰富，是婴幼儿重要的食物蛋白来源。但据国外流行病学调查表明， 2% 6%的儿童对牛乳产生过敏反应，严重影响其对优质乳蛋白的吸收利用。β-乳球蛋白(β-lactglobulin)被视为最主要的牛乳过敏原蛋白之一，β-乳球蛋白对小牛具有类似免疫球蛋白的功能，但对于婴儿来说却是主要的过敏原，容易造成婴儿的过敏反应， β-乳球蛋白主要诱发特异性IgE抗体介导的I型超敏反应，可引起呕吐、腹痛和腹泻等胃肠不适。且过敏引起的胃肠道疾病(如婴幼儿结肠炎)常致儿童生长迟缓。如何减少乳球蛋白所致牛乳过敏症已成为现代乳制品生产中急待解决的问题。申请者三年来在益生菌调节Thl/Th2失衡缓解β -乳球蛋白过敏方面取得了一定的研究成果，筛选到一株对IgE介导的乳球蛋白过敏具有较好疗效的约氏乳杆菌 KLDS1. 7032，并新发现该约氏乳杆菌抗过敏的作用与细胞壁结构的完整性有关，其细胞壁肽聚糖是抑制过敏的主要成分。目前，对完整肽聚糖的生理功能及功能机制研究的较多，而对其产品制备方法的研究较少。现有细胞壁肽聚糖基本采用注射方式给药，存在口服生物利用度低及过高剂量会引起不良反应的问题。而微乳是一新型理想的药物释放载体。具有透明，稳定吸收完善， 靶向释药等特点，并提高了药物疗效，降低毒副作用。临床应用价值日益提高，具有很大的发展前景。因此，本发明将提取的乳杆菌完整肽聚糖制备成微乳制剂，其经口服到达体内后，可自发形成粒径小于IOOnm的0/W微乳，由于药物以分子形式分散于微乳中，可明显提高药物的释放度，稳定性增加，口服生物利用度是普通制剂的3 4倍，为新型免疫增强剂的工业化生产奠定了一定的理论基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是公开了乳杆菌完整肽聚糖微乳在制备抗 β-乳球蛋白过敏的免疫增强剂中的应用；特别是应用于制备抗IgE介导的乳球蛋白过敏的免疫增强剂中。所述的免疫增强剂可进一步用于抗β -乳球蛋白过敏的药物或食品制备中。优选的，所述的乳杆菌完整肽聚糖是从约式乳杆菌KLDS1. 7032中提取的。所述的约氏乳杆菌KLDS1. 7032，为乳杆菌(LactcAacillus johnsonii)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCCN0. 5050，保藏日期为2011年7月
48曰。本发明所要解决的技术问题之二是提供了一种制备乳杆菌完整肽聚糖的方法，具体的包括以下步骤(1)菌体的清洗与收集将约氏乳杆菌菌种活化传代后，接种于MRS液体培养基中，37°C静止培养18h ；培养完毕后迅速降温至4°C。在5000g、4°C离心20min，收集菌体沉淀；4°C蒸馏水反复洗涤至菌体白色，收集菌体，置于100°C沸水水浴箱中灭活30min，得到热致死菌泥；(2)去磷壁酸将步骤(1)所述的热致死菌泥悬浮于预热的质量分数为10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌体；冷却后，5000g、4°C离心15min，收集沉淀；(3)脱脂浓度为0. 02mol/L，pH值为4. 6的乙酸钠溶液，与氯仿、甲醇，三者按体积比4 5 10混合；用混合液溶解步骤( 得到的沉淀，所述混合液的体积比与沉淀体积比为15 1 ；室温搅拌18h，8000g、4°C离心20min，收集沉淀；(4)去蛋白上述步骤(3)得到的沉淀中加入15倍沉淀体积的含有;3mg/mL胰蛋白酶和;3mg/mL碱性蛋白酶的pH 8. 0的0. lmol/L磷酸缓冲液，37°C水浴振荡12h，以5000g、 4°C离心5min，沉淀用去离子水洗2次；(5)提纯步骤(4)得到的沉淀经0. Olmol化―1硫酸溶液85 95°C处理5min。冰水浴中立即冷却，12000g、4°C离心30min后弃上清，沉淀用去离子水在4°C条件下连续透析 7天，冷冻干燥后置4°C保存备用。本发明所要解决的技术问题之三是提供了一种按照以上所述的制备方法制备得到的完整肽聚糖。本发明所要解决的技术问题之四是提供了一种抗乳球蛋白过敏的微乳制剂， 其特征在于包括有效剂量的以上所述的完整肽聚糖微乳作为活性成分、还包括油相、表面活性剂、助表面活性剂和水。优选的，所述的表面活性剂为吐温-80，所述的助表面活性剂为无水乙醇，所述的油相为正丁酸乙酯和维生素E的混合物。更优选的，所述的微乳制剂包括以下重量分数的各物质以上任一所述的完整肽聚糖3. 00%，质量比为7 3的正丁酸乙酯和维生素E组成的混合物1.07% 13.59%， 质量比为2 8的吐温-80和无水乙醇组成的混合物2. 10% 25. 42%，及水58. 00% 89. 00%。本发明所要解决的技术问题之五是提供了制备所述的抗乳球蛋白过敏的微乳制剂的方法，其特征在于是由以下方法制备得到的将质量比为2 8的吐温-80和无水乙醇组成的混合物2. 10% 25. 42%分散于58. 00% 89. 00%水中成水相，质量比为7 3的正丁酸乙酯和维生素E的混合物1.07% 13. 59%为油相，所述的完整肽聚糖3. 00%加入油相中，两相分别预热至70°C，将油相和水相混合后经高速剪切乳化机在 BOOOrpm下剪切5min制得粗乳，加入5倍体积的生理盐水稀释6倍，再采用高压均质机在 70MPa的压力下均质6次，调节pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽灭菌15min，即得微乳制剂。本发明所要解决的技术问题之六是提供了所述的微乳制剂在制备抗乳球蛋白过敏免疫增强剂中的应用。本研究基于乳酸菌与抑制食物过敏的发生、发展之间的紧密联系，通过建立BLG致敏动物模型，研究给予肽聚糖微乳对致敏模型动物过敏反应的干预作用，说明了由完整肽聚糖制成的肽聚糖微乳制剂经口服到达体内后，能有效刺激淋巴细胞分泌IL-12和 IFN- γ，降低IL-4水平，逆转Th2细胞过度亢进，在抑制IgE介导的β -乳球蛋白过敏炎症中发挥了重要作用。在开发具有抗过敏性能的免疫增强剂等方面具有潜在应用价值，同时也为为乳酸菌及其菌体成分防治食物过敏提供实验依据。与现有技术相比，本发明的优点在于制备的乳杆菌完整肽聚糖微乳组合物，遇体液可自发形成纳米级粒径的微乳，可明显提高药物的溶解度，增加药物稳定性、提高药物的生物利用度；乳杆菌完整肽聚糖制备方法简单、性质稳定；制备得到的完整肽聚糖采用微乳作为药物载体制成口服完整肽聚糖微乳，在开发具有抗过敏性能的免疫增强剂等方面具有潜在应用价值。
图1为约氏乳杆菌的显微镜镜检图；图2为约氏乳杆菌的透视电镜图；图3Sekine提取肽聚糖的透视电镜图㈧与本发明的改良法提取肽聚糖的透视电镜图⑶；图4为肽聚糖微乳对BLG致敏小鼠血清中总IgE、BLG特异性IgE和总IgG的影响。1 空白微乳组；2 致敏组；3 肽聚糖组；4 肽聚糖微乳组
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1乳杆菌完整肽聚糖、完整肽聚糖微乳的制备1. 1. 1实验菌株约氏乳杆菌KLDS1. 7032由婴儿肠道中筛选得到，约氏乳杆菌KLDS1. 7032，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC 5050，保藏日期为2011年7月8日。1.1. 2实验试剂盐酸、浓硫酸、磷酸、氯化钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、无水乙醇(食用级)、正丁酸乙酯、甲醛、甲醇、丙酮、过氧化氢、高氯酸、抗坏血酸、乙酸、乙醚、乙酸内酮、苯酚、氯仿、葡萄糖、胆固醇、溶菌酶、Tris、乙酸钠、苯酚、Triton X-100, SDS，胰蛋白酶、碱性蛋白酶(均为分析纯，购自大连宝生物工程有限公司)。结晶紫、碘液、沙黄(均为分析纯，Sigma公司)。吐温-80、维生素E(市售，食品级)。对二甲氨基苯甲醉、氨基葡萄糖等(均为分析纯，购自南京博尔迪生物科技有限公司)。去离子水，实验室自制。1. 1.3实验仪器
阿贝折光仪上海光学仪器厂
FA25型高剪切分散乳化机上海弗鲁克流体机械制造有限公司
激光粒径仪
美国PSS公司
6
定氮仪KDN-04B上海新嘉电子有限公司
氨基酸分析仪835-50日本HITACHI
核酸蛋白检测仪HD-2上海沪西分析仪器
LGJ-I冷冻干燥机上海医用分析仪器厂
UV-2401PC分光光度计日本岛津林式会社
离子色谱DIONEX 1(^2500
倒相型系统光学显微镜奥林巴斯光学エ业林式会社
透射电镜日本日立H-7650
核酸/蛋白质分析仪DU-800Beckman Coulter
光学显微镜(OLYMPUS )奥林巴斯光学エ业林式公社
酸度计梅特勒-托利多仪器有限公司
高压均质机Niro Soavi-NS 1001L
恒温磁力撹拌器常州国华电器有限公司
电导率仪梅特勒-托利多仪器有限公司1. 2实验方法1. 2. 1乳杆菌完整肽聚糖的提取(1)菌体的清洗与收集将约氏乳杆菌菌种活化传代后，按3%接种于IOOOmLMRS 液体培养基中，37°C静止培养18h ；培养完毕后迅速降温至4°C。在5000g、4°C离心20min， 收集菌体沉淀；4°C蒸馏水反复洗涤至菌体白色，收集菌体，置于100°C沸水水浴箱中灭活 30min，得到热致死菌泥；(2)去磷壁酸将步骤(1)所述的热致死菌泥悬浮于200mL预热的质量分数为 10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌体；冷却后，5000g、4°C离心15min，收集沉 淀；(3)脱脂用浓度为0. 05mol/L乙酸调节浓度为0. 02mol/L乙酸钠溶液pH值至 4. 6，将上述溶液混合后再与氯仿、甲醇，三者按体积比4 5 10混合。用混合液溶解步 骤⑵得到的沉淀，体积比为15 1。室温搅拌18h，8000g、4°C离心20min，收集沉淀。(4)去蛋白上述步骤C3)得到的沉淀中加入15倍沉淀体积的胰蛋白酶和碱性蛋 白酶磷酸缓冲液(3mg/mL胰蛋白酶和:3mg/mL碱性蛋白酶；0. lmol/L磷酸缓冲液；pH 8. 0)， 37°C水浴振荡12h，以5000g、4°C离心5min，沉淀用去离子水洗2次。(5)提纯步骤(3)得到的沉淀经0. Olmol じ1硫酸溶液IOmL 95°C处理5min。冰 水浴中立即冷却，12000g、4°C离心30min后弃上清，沉淀用去离子水在4°C条件下连续透析 7d，冷冻干燥后置4°C保存备用。1. 2. 2肽聚糖提取物的化学鉴定(1)乳杆菌完整肽聚糖形态学检查采用显微镜(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室)和透射电镜(东北农业大学生命中心)观察。(2)乳杆菌完整肽聚糖化学组分分析i Morgan-Elson比色法测定氨基己糖取一定量的完整肽聚糖样品用经6mol/L 盐酸105°C水解lOhrs，用2mol/L碳酸钠中和至pH7.0。取IOmL带塞刻度试管，加入样液 2mL,加入ImL乙酞丙酮试剂，摇勻，沸水浴30min，取出冰水冷却，加入2mL无水乙醇、ImL对二甲氨基苯甲醛试剂，摇勻，用无水乙醇补至10mL，于60°C水浴保温1小时，冷却，在30min 内530nm下测定吸光值。同法以100 μ g/mL氨基葡萄糖为标准溶液绘制标准曲线，根据标准曲线和样品浓度计算一含量。 蛋微量凯氏定氮法测定蛋白质采用国标GB/T5009. 5-850测定蛋白质含量。iii中性糖的测定精密称取105°C干燥至恒重的葡萄糖10mg，置IOOmL容量瓶中，用蒸馏水溶解混勻，定容成lOOmg/mL的标准溶液。分别取此标准溶液0. lmL、0. 2mL、 0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 6mL、0. 7mL至IOmL带塞试管中，加入蒸馏水补足体积至ImL作为标准管，取蒸馏水ImL作为空白对照管，取检测样品ImL作为检测管，分别向各管加入1. 4mL 5%苯酚摇勻，浓硫酸5mL摇勻，置100°C水浴25min，在490nm处检测各管吸光度值，计算和绘制标准曲线并按以下公式推算出样品中的糖含量多糖含量(％) =CXDXV/WX100其中C为样品中葡萄糖浓度(yg/mL)，D为样品的稀释倍数，V为样品体积(mL)， W为样品重量(mg)iv总脂肪的测定绘制标准曲线将胆固醇标准液与乙醇摇勻后，分别取0. 2mL，加入浓硫酸混勻后 100°C水浴IOmin使脂类水解，冷却至室温后加入显色剂，室温静置20min，于525nm处测定光吸收，取两管平均值，以标准胆固醇含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。总脂测定程序同上，测得光吸收值，从标准曲线上查得总脂含量。ν氨基酸的测定测定方法采用国家标准GB/T14965-1994。取一定量的肽聚糖提取物，用6mol/L盐酸110°C真空水解20hrs，用日立835-50型氨基酸分析仪分别测定氨基酸组成。vi微量磷法测核酸根据核酸为含磷的有机化合物，其含磷量为9. 5%，因此，可以通过有机磷总磷一无机磷的含量来计算出核酸的含量。(3)溶菌酶溶解试验称取肽聚糖提取物，以pH6. 2的磷酸盐缓冲液配成lmg/mL溶液，加蛋清溶菌酶 200 μ g/mL,可见光分光光度计测A450后，37°C，120r/min震荡处理，分别于不同时间测A45(1。(4)提取乳杆菌完整肽聚糖得率的计算本试验用用三批生产菌粉提取肽聚糖，计算出kkine法和改良法提取约氏乳杆菌肽聚糖的得率。1. 2. 3肽聚糖微乳制备及其类型的鉴别方法本实验通过伪三元相图法研究肽聚糖微乳的形成条件，并对所制备肽聚糖微乳的粒径大小、分布范围、初步理化性质、微乳形态及体系类型等进行研究。(1)肽聚糖微乳的制备称取吐温-802. 348g，无水乙醇9. 392g，分散于79g水中成水相，称取4. 382g正丁酸乙酯，维生素E 1.878g混合成溶液做为油相，实施例1. 2. 1节制备得到的完整肽聚糖3g加入油相中，两相分别预热至70°C，将油相和水相混合后经高速剪切乳化机在6000rpm下剪切5min制得IOOg粗乳，加入5倍体积的生理盐水稀释6倍，再采用高压均质机在70MPa的压力下均质6次，调节pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽灭菌15min， 即得微乳制剂。(2)微乳的鉴别方法性状透明或略带乳光的溶液，偏光显微镜下无双折射现象。离心法采用lOOOOr/min离心15min，观察其是否分层及是否维持澄明，如仍维持澄明可判为微乳。染色法利用油溶性染料苏丹红和水溶性染料亚甲兰在微乳中红色或蓝色的扩散快慢来判断微乳的类型，若红色扩散快速于蓝色则为W/0型微乳；反之为0/W型。折光率按文献规定方法恒温20°C测定粒径取少量静置1周的微乳样品，用去离子水稀释至样品含水量约为98%，用旋涡混合器混合均勻，再经过0. 22 μ m微孔滤膜过滤，过膜后的样品注入纳米粒度分布仪的样品池中，设定温度为25°C和各种油相的折光率，进行粒径测定，每个样品平行测定3次。1. 3实验结果1.3. 1肽聚糖外观检查所得乳杆菌肽聚糖为乳白色外观呈棉絮状分布，在水中分布均勻易发生沉降。 显微镜镜检图如图1所示，透视电镜图如图2所示，本试验通过对提取工艺的摸索，对比 Sekine提取肽聚糖方法，确定了最佳提取约氏乳杆菌肽聚糖的改良法，由于条件温和，且整个纯化过程中不使用任何物理与化学方法破坏细胞壁的骨架结构，因此分离得到了细胞骨架完整的肽聚糖，通过透射电镜观察所提取到的细胞骨架呈现袋状结构，如图3所示。1. 3. 2约氏乳杆菌肽聚糖的主要成分本实验利用现行摸索的改良法提取约氏乳杆菌肽聚糖，其主要成分为蛋白质和中性糖，含量分别为和40%，其次为脂肪、氨基己糖、核酸。传统％1^1^法提取约氏乳杆菌肽聚糖，其主要成分为蛋白质和中性糖，含量分别为58%和42%，其次为脂肪、氨基己糖、核酸。所测改良法提取约氏乳杆菌肽聚糖各项成分与传统kkine法提取相比较，其品质没有降低。1. 3. 3约氏乳杆菌肽聚糖的提取得率通过溶菌酶溶解试验证实分离纯化步骤所得的提取物的主要成分确系肽聚糖。通过用三批不同批次工业化生产的约氏乳杆菌菌粉提取肽聚糖，采用质量比(终WPG质量/ 起始菌粉质量)比较改良法法提取完整肽聚糖得率。结果表明改良法的得率为 18%，而传统kkine法仅能获得3%的提取率。1. 3. 4肽聚糖微乳制备及其类型的鉴别选择食品级吐温-80为表面活性剂，选择正丁酸乙酯和维生素E的混合物为油相。 采用乙醇为助表面活性剂。由相图考察所得结果，按比例秤取一定量的肽聚糖、表面活性剂、助表面活性剂和油相混合均勻，滴加蒸馏水，搅拌混勻即得液滴直径在30 45nm的半透明状乳液产品。获得肽聚糖微乳经离心后，溶液均无分层。外观澄黄、透明、可见乳光、具有一定流动性。本实验结果显示亚甲基兰在微乳中的扩散速度明显快于苏丹IV，可以判定肽聚糖微乳为Ο/w型微乳。将3批配制的肽聚糖微乳于37°C烘箱中放置3个月，观察性状、分层、含量测定等指标表明各项指标无明显变化，该制剂的稳定性良好。透射电镜下呈圆球形，分布均勻，平均粒径为(39. 6 士 3. 3) nm。实施例2 口服完整肽聚糖微乳对致敏模型动物过敏反应的干预作用将实施例1制备得到的完整肽聚糖微乳及肽聚糖用于以下实验研究2. 1实验材料2. 1. 1实验动物雌性清洁级BALB/c小鼠，6 8周龄，购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心。饲养环境温度(23 士 2) °C，湿度50 % 75 %，标准小鼠饲料喂养。2. 1.2主要试剂实施例1制备得到的肽聚糖提取物、实施例1制备得到的肽聚糖微乳、IL-12、 IFN- y、IL-4ELISA试剂盒(美国R&D公司)、总IgE试剂盒(美国bethyl公司)、羊抗鼠IgE酶标二抗(英国AbD Serotec公司)、羊抗鼠IgG酶标二抗(中国中杉金桥公司)、 RPMI1640培养液(美国GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)、淋巴细胞分离液(Salarbio公司)、牛乳β -乳球蛋白标品和弗氏完全佐剂(Sigma公司)等。2. 1.3仪器设备
HF90型CO2培养箱 Model 680型酶标仪 EL104/00型电子天平 2~1 OOOpL可调定量移液器 96孔培养板 AE-30倒置生物显微镜 VD-1320型洁净工作台
LD4-2型低速离心机2. 2实验方法2. 2. 1灌服用的完整肽聚糖及其微乳的制备灌服用的完整肽聚糖的制备称取实施例1中1. 2. 1制备得到的完整肽聚糖4g， 加入20g无菌生理盐水(含0.9% (W/V)的氯化钠水溶液)溶解，即稀释6倍使用，制得混悬液。灌服用的完整肽聚糖微乳的制备取实施例1中1. 2. 3的制备得到的完整肽聚糖微乳灌服使用。灌服用空白微乳的制备称取吐温-802. 348g，无水乙醇9. 392g，分散于82g水中成水相，称取4. 382g正丁酸乙酯，维生素E 1. 878g混合成溶液做为油相，两相分别预热至 70°C，将油相和水相混合后经高速剪切乳化机在6000rpm下剪切5min制得粗乳100g，加入 5倍体积的生理盐水稀释6倍，再采用高压均质机在70MPa的压力下均质6次，调节pH至
香港力康公司美国 Beckman 梅特勒公司德国Eppendorf公司美国 Corning Incorporated costar 公司麦克奥迪实业集团有限公司北京东联哈尔仪器制造有限公司北京医用离心机厂6. 5 6. 8，流通蒸汽灭菌15min,即得空白微乳制剂。2. 2. 2动物模型建立小鼠购进后适应性喂养4天，随机分组(每组8只)，即空白组、致敏组、肽聚糖组以及肽聚糖微乳组。自第1天起，肽聚糖组以及肽聚糖微乳组小鼠分别灌服完整肽聚糖及其微乳0. ImL/只，每周3次，共4周，空白组同时以等量空白微乳灌服。致敏组、肽聚糖组以及肽聚糖微乳组小鼠在第7、21、观天给予腹腔注射0. ImL 0. 5mg/mL的过敏原(ImL弗氏佐剂+ImL lmg/mL BLG)，空白组小鼠腹腔注射等量生理盐水。于实验的第30天，即末次腹腔注射4 后检测指标。2. 2. 3ELISA法检测细胞因子无菌取各组小鼠脾脏，用玻璃针芯在200目筛网上研磨后，加入到RPMI1640培养液中制成单细胞悬液。加入淋巴细胞分离液进行离心，分离出淋巴细胞，再用RPMI1640培养液洗涤GOOOr/min) 2次。调细胞密度为2 X 106个/mL。将细胞与含有100mL/L小牛血清的RPMI1640培养基及BLG (终浓度lg/L)加入到96孔培养板中，每孔总体积200 μ L，每组设3个重复(n =幻。在37°C，50mL/LC02培养箱饱和湿度条件下培养4 后，离心收集上清。严格按照各ELISA试剂盒说明书进行操作，在波长450nm处用酶标仪测定各孔的吸光度(A)值，从相应的标准曲线查得各样品的IL-12、IFN-y、IL-4浓度。2. 2. 4ELISA法检测抗体水平各组小鼠摘除眼球放血，离心后吸取血清，严格按照各抗体试剂盒说明书检测小鼠血清中总IgE, BLG特异性IgE和总IgG浓度。2. 3实验结果2. 3. 1完整肽聚糖微乳对致敏小鼠Thl/Th2细胞平衡的影响由于Thl、Th2细胞的比例同IFN- γ和IL_4的分泌水平密切相关，益生菌肽聚糖通过纠正Thl/Th2细胞失衡来缓解过敏所致的炎症反应，故本实验以IFN- y /IL-4比值为代表研究乳酸菌肽聚糖微乳对淋巴细胞Thl/Th2平衡的影响。如表1所示，与致敏组相比， 肽聚糖微乳组小鼠的IL-4质量浓度显著下降(P < 0.05)，而IFN-Y分泌值明显增高(P < 0. 05)，其IFN- y /IL-4比值显著高于空白微乳组和致敏组(P < 0. 05)。表1肽聚糖微乳对BLG致敏小鼠Thl/Th2细胞分泌的影响pg/mL，n = 3)
权利要求
1.乳杆菌完整肽聚糖在制备抗乳球蛋白过敏免疫增强剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于是将所述的乳杆菌完整肽聚糖应用于制备抗 IgE介导的乳球蛋白过敏的免疫增强剂中。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的完整肽聚糖是从约氏乳杆菌 KLDS1. 7032中提取的，所述的约氏乳杆菌KLDS1. 7032，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC 5050。
4.一种制备权利要求3所述的完整肽聚糖的方法，其特征在于包括以下步骤(1)菌体的清洗与收集将约氏乳杆菌KLDS1.7032菌种活化传代后，接种于MRS液体培养基中，37°C静止培养18h，培养完毕后迅速降温至4°C ；在5000g、4°C离心20min，收集菌体沉淀；4°C蒸馏水反复洗涤至菌体白色，收集菌体，置于100°C沸水水浴箱中灭活30min， 得到热致死菌泥；所述的约氏乳杆菌KLDS1. 7032，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC 5050 ；(2)去磷壁酸将步骤(1)所述的热致死菌泥悬浮于预热的质量分数为10%三氯乙酸溶液中，沸水浴20min以裂解菌体；冷却后，5000g、4°C离心15min，收集沉淀；(3)脱脂浓度为0.02mol/L, pH值为4. 6的乙酸钠溶液，与氯仿、甲醇，三者按体积比 4:5: 10混合；用混合液溶解步骤( 得到的沉淀，所述混合液的体积与沉淀体积比为 15 1 ；室温搅拌18h，8000g、4°C离心20min，收集沉淀；(4)去蛋白上述步骤(3)得到的沉淀中加入15倍沉淀体积的含有:3mg/mL胰蛋白酶和:3mg/mL碱性蛋白酶的pH 8. 0的0. lmol/L磷酸缓冲液，37°C水浴振荡12h，以5000g、4°C 离心5min，沉淀用去离子水洗2次；(5)提纯步骤(4)得到的沉淀经0.Olmol -L"1硫酸溶液85 95°C处理5min，冰水浴中立即冷却，12000g、4°C离心30min后弃上清，沉淀用去离子水在4°C条件下连续透析7天， 冷冻干燥后置4°C保存备用。
5.按照权利要求4所述的制备方法制备得到的乳杆菌完整肽聚糖。
6.一种抗乳球蛋白过敏的微乳制剂，其特征在于包括有效剂量的权利要求3或5 所述的完整肽聚糖作为活性成分、还包括油相、表面活性剂、助表面活性剂和水。
7.如权利要求6所述的微乳制剂，其特征在于所述的表面活性剂为吐温-80，所述的助表面活性剂为无水乙醇，所述的油相为正丁酸乙酯和维生素E的混合物。
8.如权利要求7所述的微乳制剂，其特征在于微乳制剂包括以下重量分数的各物质 权利要求3或5所述的完整肽聚糖3. 00%，质量比为7 3的正丁酸乙酯和维生素E组成的混合物1. 07% 13. 59%，质量比为2 8的吐温-80和无水乙醇组成的混合物2. 10% 25. 42%及水 58. 00% 89. OOV0o
9.如权利要求8所述的微乳制剂，其特征在于是由以下方法制备得到的将质量比为 2 8的吐温-80和无水乙醇组成的混合物2. 10% 25. 42%分散于58. 00% 89. 00%水中成水相，质量比为7 3的正丁酸乙酯和维生素E的混合物1.07% 13. 59%为油相，权利要求3或5所述的完整肽聚糖3. 00%加入油相中，两相分别预热至70°C，将油相和水相混合后经高速剪切乳化机在6000rpm下剪切5min制得粗乳，加入5倍体积的生理盐水稀释 6倍，再采用高压均质机在70MPa的压力下均质6次，调节pH至6. 5 6. 8，流通蒸汽灭菌15min，即得微乳制剂。
10.权利要求6-9任一项所述的微乳制剂在制备抗乳球蛋白过敏免疫增强剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具抗β-乳球蛋白过敏效果的乳杆菌完整肽聚糖的制备方法、产品及其应用。本发明还涉及由本发明所得到的乳杆菌完整肽聚糖制备成的微乳制剂，其中乳杆菌完整肽聚糖作为主要功效成分，将完整肽聚糖、油相、表面活性剂、助表面活性剂、水在70℃边加热边搅拌使完整肽聚糖完全溶解，混匀即得液滴直径在30～45nm的半透明状乳液产品。本发明的乳杆菌完整肽聚糖微乳制剂经口服到达体内后，能有效刺激淋巴细胞分泌IL-12和IFN-γ，降低IL-4水平，逆转Th2细胞过度亢进，在抑制IgE介导的β-乳球蛋白过敏炎症中发挥了重要作用。在开发具有抗过敏性能的免疫增强剂等方面具有潜在应用价值。
文档编号A61P37/04GK102335413SQ201110236429
公开日2012年2月1日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者孟祥晨, 李艾黎, 杜鹏, 马冬雪 申请人:东北农业大学