专利名称：叶酸修饰的o-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种叶酸修饰的O-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，及其制备方法， 以及其作为介导靶向壳聚糖载药纳米胶束在制备抗肿瘤药物受体靶向纳米胶束制剂中的应用，属于药物制剂领域。
背景技术：
目前，肿瘤已成为严重威胁人类健康的常见病、多发病，其死亡率占全球人类死亡总数的12%。因此，近半个世纪以来攻克肿瘤一直是各国政府与科研、医疗机构的主要任务之一。化疗作为肿瘤三大常规治疗方法之一，已成为肿瘤治疗不可缺少的手段。目前临床上常用的抗肿瘤化疗用药多以细胞毒性型药物为主。肿瘤化疗的根本目的是在保证患者安全的情况下以药物消灭肿瘤细胞，即要求所使用的药物对机体正常细胞无损害而对肿瘤细胞呈敏感的杀灭作用，达到安全、有效治愈肿瘤的目的。然而，实际上临床使用的抗肿瘤化疗药物均有不同程度的毒副作用，有些严重的毒副反应是限制药物用药剂量和使用的直接原因。发生这些毒副反应的主要原因在于化疗药物缺乏对肿瘤部位的特异性，大剂量给药时产生非特异性毒性，甚至对正常组织造成严重的损伤。例如紫杉醇(PaclitaXel，PTX)是从红豆杉属植物中分离提取的一种含有紫杉烷结构的高效的细胞毒类新型抗癌药，自1992 年FDA批准PTX用于卵巢癌的临床治疗以来，由于其独特的微管稳定作用已被广泛应用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤、非小细胞肺癌以及与艾滋病相关的KaPosi肉瘤的治疗。但是由于PTX溶解度极低(仅约为1 μ g/mL)、治疗指数窄、口服生物利用度差，因而临床上唯一可获得的PTX制剂为泰素注射液。上市注射液的增溶溶媒聚氧乙烯蓖麻油易产生诸如神经毒性、肾毒性、心脏毒性、高敏性等毒副作用，加之PTX对心脏和肾亦有一定毒副作用，因此，PTX在临床上的应用受到了很大的限制。同样的情况也发生在其它抗肿瘤药物的注射剂中。所以，人们希望寻找出可以增加难溶性抗肿瘤药物溶解度并且提高肿瘤组织内药物浓度而正常组织中药物浓度较低的一种制剂形式，从而提高疗效、降低药物带来的毒副反应。药物靶向技术就是为了解决这些问题而提出的并已成为整个药学研究领域的执占之一。纳米给药系统是近年来抗肿瘤药物载体研究中的热点。它具有改善药物的溶解性，延长药物在肿瘤部位的滞留时间，提高药物生物利用度和具有一定靶向性等优点，从而可提高抗肿瘤药物的疗效和减少化疗中的非特异性不良反应，尤其适用于肿瘤的治疗。近年来，由亲水基和疏水基团组成的两亲性纳米胶束在生物工程和药物制剂领域受到了广泛的研究。在水溶液中，各种两亲性聚合物为了减小表面自由能，通过疏水基团的分子内或分子间的促进作用自发的形成胶束或自聚物。这些聚合物的胶束或自聚物由疏水性的内核和亲水性的外壳组成，由于疏水性的内核能够作为许多水溶性差的生物活性剂的容器，故而这种核壳结构被认为是一种有前途的药物传输载体。再者，这些聚合物胶束显示了特殊的性质，诸如不同的流变学特征、小的流体半径和热力学的稳定性。因此，在过去的十年里，在开发新型的两亲聚合物诸如两亲性嵌段共聚物和疏水修饰的聚合物方面做了很大的努力。 近年，诸如壳聚糖、葡聚糖和普鲁兰糖等天然多糖受到了广泛的关注，它们能够被烷基链和胆汁酸疏水性修饰，形成纳米大小的胶束或自聚物作为药物传输系统。特别地，疏水修饰的壳聚糖在水溶液中形成的自聚物，作为疏水性药物或基因的载体显示了很好的潜力。壳聚糖，甲壳素的N-脱乙酰基衍生物，是葡糖胺和N-乙酰葡糖胺通过β_(1，4) 糖胺键连结的聚合物。近来，由于壳聚糖好的生物相容性、生物可降解性、和低的毒性，壳聚糖作为药物或基因的载体吸引了科研人员很大的兴趣。然而，壳聚糖在生理溶液中水溶性差是其在药物传输中广泛应用的主要缺陷。据报道，壳聚糖的水溶性可通过许多途径得以提高，诸如氨基的季氨化作用、羧甲基化和PEG化。PEG修饰的壳聚糖显示出好的水溶性和生物相容性，在生理条件下具有稳定结构的纳米粒。羧甲基化被认为是一种提高许多多糖水溶性的好方法。0-羧甲基壳聚糖(OCMC)，一种壳聚糖的羧甲基衍生物，其好的生物相容性、生物活性、抗肿瘤活性和水溶性在早期的文献中已有报道，若将其进行化学修饰的疏水改性，可在水性介质中自聚集形成纳米胶束。脱氧胆酸(DOCA)是一种最常用的疏水改性剂，其分子中既包含像碳原子侧链末端的羧基和3α、12α位的羧基这样的亲水基，又包含环戊烯菲这样的疏水基。因而，期望在OCMC中引入DOCA可通过自联作用形成具有疏水核心的自聚物。然而，这种自聚物不能够从网状内皮系统(REQ逃逸，可被单核巨噬细胞系统 (MPS)清除。再者，自聚物在肿瘤部位的不充分摄取降低了给药剂量的药物疗效，非特异的相关的正常组织毒副作用限制了最大给药剂量的安全使用。这些限制条件阻碍了载药自聚物完成潜在治疗作用的可能性。为了完成肿瘤靶向给药，研究人员已经尝试了很多方法，一个策略就是利用在肿瘤组织特定过渡表达的独特的分子标记物。众所周知，叶酸受体(FR) 即叶酸偶联蛋白，在许多人类实体肿瘤(卵巢癌、肾癌、子宫癌、结肠癌、肺癌)细胞表面过渡表达，但在正常细胞表面很少发现。叶酸(FA)作为配基用于靶向细胞膜并通过叶酸受体促进纳米粒的内吞作用。重要的是，叶酸轭合物即通过叶酸Y羧基的共价衍生物，能够保持很强的受体亲和性，并且细胞通过叶酸受体摄取叶酸和叶酸轭合物的机制是一样的。叶酸受体在靶细胞的再循环能导致吸收更多的叶酸轭合物。到目前为止，许多研究已经报道了叶酸聚合物胶束、大分子纳米粒和脂质体作为抗癌剂或基因的靶向载体。叶酸类化合物作为肿瘤靶向的生理性配体，与肿瘤特异性单克隆抗体相比，具有费用低、高度的化学和生物学稳定性、无免疫原性、与受体的高度亲和性、较快的肿瘤细胞内摄取等优点；再者，叶酸类化合物与其配体结合具有高亲和性、选择性、饱和性和生物效应明显等优点，且叶酸受体仅在肿瘤细胞高表达，在正常组织无或很少表达，故具有很好的肿瘤组织特异性。因此，这种利用叶酸为靶弹头，将叶酸连结到聚合物胶束表面，通过与叶酸受体特异结合而将药物靶向投递到肿瘤组织的方法，可以提高药物在病灶局部的浓度， 提高疗效、降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。综上所述，研制一种可逃避巨噬细胞吞噬的叶酸受体靶向纳米胶束作为难溶性抗肿瘤药物的载体，可以改变药物分布，增加药物在体内的滞留时间，提高抗癌药物的肿瘤组织靶向性，在肿瘤的诊断和靶向治疗中具有很大的研究开发前景。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，其可以作为介导靶向聚合物纳米胶束，用于包载难溶性抗肿瘤药或抗肿瘤药物增敏剂，制得的载药聚合物纳米胶束可有效逃避巨噬细胞的吞噬，延长药物在体内的滞留时间， 并可通过叶酸受体途径有效摄入肿瘤细胞，增加药物在肿瘤组织的分布，从而提高疗效、降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。本发明是通过以下技术方案实现的一种叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，是以叶酸、0-羧甲基壳聚糖和脱氧胆酸为原料制备而成的主动靶向的纳米胶束载体材料，其是通过以下制备方法得到的(1) ο-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联①称取250mg的O-羧甲基壳聚糖溶解在25ml蒸馏水中，然后加入75ml甲醇稀释；②将制备量的(35 ^Omg)脱氧胆酸溶解于IOml无水二甲基亚砜中，然后加入相当于脱氧胆酸1. 5倍摩尔量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和相当于脱氧胆酸1. 5倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌池以活化脱氧胆酸；③将步骤②中活化的脱氧胆酸加入步骤①中溶解有0-羧甲基壳聚糖的溶液中， 强烈搅拌至溶液呈光学透明，然后使混合液在室温下反应36h，得到反应溶液；④将上述得到的反应溶液在甲醇与水的混合溶液(体积比4 1)中透析(透析袋截留相对分子质量14k) 3天，以除去未反应的脱氧胆酸及反应副产物，然后冷冻干燥，即得两亲性的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物，即DOMC ；(2) 0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸与叶酸偶联①将制备量的(0. 8 2. 4mol)的叶酸或叶酸衍生物溶解于IOml无水二甲基亚砜中，然后滴加3 5滴三乙胺，并加入相当于叶酸2倍摩尔量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和相当于叶酸2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下连续搅拌2h， 制成叶酸活性酯溶液；②称取250mg的O-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物(DOMC)溶解于25ml蒸馏水中，然后加入25ml甲醇，搅拌至溶液光学透明；③将叶酸活性酯溶液滴加到步骤②得到的DOMC溶液中，在室温下搅拌36h，使叶酸偶联到壳聚糖分子上；然后滴加0. IM的氢氧化钠溶液至pH值为9. 0，终止反应，得反应液；④将上述得到的反应液在pH值为7. 4的磷酸缓冲盐溶液以及蒸馏水中各透析3 天，冷冻干燥，得叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，即D0MC-FA。所述0-羧甲基壳聚糖为壳聚糖衍生物，其脱乙酰度> 85%，羧甲基取代度 ^ 80%，分子量为 50，000-150，000。所述脱氧胆酸的取代度范围在2%-15% (实际应用时，根据所需的取代度调整脱氧胆酸的用量)。所述叶酸衍生物为叶酸、亚叶酸、四氢叶酸或二氢叶酸，并且叶酸基的取代度范围在 5% -15%。一种叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物的制备方法，步骤如下(1)0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联
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①称取250mg的O-羧甲基壳聚糖溶解在25ml蒸馏水中，然后加入75ml甲醇稀释；②将制备量的(35 ^Omg)脱氧胆酸溶解于IOml无水二甲基亚砜中，然后加入相当于脱氧胆酸1. 5倍摩尔量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和相当于脱氧胆酸1. 5倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌池以活化脱氧胆酸；③将步骤②中活化的脱氧胆酸加入步骤①中溶解有0-羧甲基壳聚糖的溶液中， 强烈搅拌至溶液呈光学透明，然后使混合液在室温下反应36h，得到反应溶液；④将上述得到的反应溶液在甲醇与水的混合溶液(体积比4 1)中透析(透析袋截留相对分子质量14k) 3天，以除去未反应的脱氧胆酸及反应副产物，然后冷冻干燥，即得两亲性的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物，即DOMC ；(2) 0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸与叶酸偶联①将制备量的(0. 8 2. 4mol)的叶酸或叶酸衍生物溶解于IOml无水二甲基亚砜中，然后滴加3 5滴三乙胺，并加入相当于叶酸2倍摩尔量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和相当于叶酸2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下连续搅拌2h， 制成叶酸活性酯溶液；②称取250mg的O-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物(DOMC)溶解于25ml蒸馏水中，然后加入25ml甲醇，搅拌至溶液光学透明；③将叶酸活性酯溶液滴加到步骤②得到的DOMC溶液中，在室温下搅拌36h，使叶酸偶联到壳聚糖分子上；然后滴加0. IM的氢氧化钠溶液至pH值为9. 0，终止反应，得反应液；④将上述得到的反应液在pH值为7. 4的磷酸缓冲盐溶液以及蒸馏水中各透析3 天，冷冻干燥，得叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，即D0MC-FA。所述0-羧甲基壳聚糖为壳聚糖衍生物，其脱乙酰度> 85%，羧甲基取代度 ^ 80%，分子量为 50，000-150，000。所述脱氧胆酸的取代度范围在2% -15% (实际应用时，根据所需的取代度调整脱氧胆酸的用量)。所述叶酸衍生物为叶酸、亚叶酸、四氢叶酸或二氢叶酸，并且叶酸基的取代度范围在 5% -15%。所述叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物可以作为介导靶向壳聚糖载药纳米胶束，用于制备抗肿瘤药物受体靶向纳米胶束制剂。具体应用时，制备方法可以为 称取25mg叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物(DOMC-FA)，超声分散于5ml去离子水中，然后加入5 20g的抗肿瘤药物，或抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂，在室温下搅拌3小时；然后用探头式超声在90w功率下冰浴处理三次，每次两分钟，每次间隔2min，为了阻止溶液温度升高，超声脉冲开4s停2s ；然后将所得的混合物在3000r/min离心20min， 以除去游离的药物和载体材料，接着过0. 45um的滤膜，即得抗肿瘤药物受体靶向纳米胶束制剂，溶液中，药物浓度范围在0. 02-4mg/ml ；4°C冰箱贮存或冷冻干燥。所述抗肿瘤药物选择紫杉醇、阿霉素、喜树碱等；所述抗肿瘤药物增敏剂选自维拉帕米、三苯氧胺、奎尼丁、环孢菌素A等。本发明的叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，采用水溶性的0-羧甲基壳聚糖，将其进行化学修饰的疏水改性，可得到两亲性的聚合物，可在水性介质中自聚集形成纳米胶束，具有以下优点1、本发明制备的载体材料叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物具有良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性，而且各种原料廉价易得，制备工艺简单方便，条件温和，是一种优良的肿瘤靶向的载体材料。2、本发明制备的载药纳米胶束形态呈球形，粒径较小，分布均勻，具有较高的载药量和包封率，具有稳定性好，缓释性好等优点。3、该载药纳米胶束通过叶酸-叶酸受体靶向进入肿瘤细胞，从而增加了药物在肿瘤组织的分布，提高了疗效，降低了毒副作用，达到了靶向治疗肿瘤的目的。
图1为载体材料DOMC-FA的1H-NMR结构谱图。图2为载体材料DOMC-FA、DOMC分别对MCF-7细胞产生的毒性结果。图3MCF-7细胞对载罗丹明B的DOMC、DOMC-FA纳米胶束温育不同时间摄取的荧光电镜照片，其中，A 游离罗丹明B ；B 载罗丹明B的DOMC纳米胶束溶液；C 载罗丹明B的 DOMC-FA纳米胶束溶液；D 载罗丹明B的DOMC-FA纳米胶束溶液+ImM的游离叶酸。图4为载紫杉醇DOMC-FA纳米胶束粒径分布图。图5为载紫杉醇DOMC-FA纳米胶束透射电镜照片。图6为载紫杉醇、维拉帕米DOMC-FA纳米胶束体外释放的释放百分率-时间曲线。图7为载紫杉醇DOMC-FA、DOMC纳米胶束分别对MCF-7细胞的毒性结果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 叶酸修饰靶向壳聚糖载体材料(叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物)的合成(1)0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联称取250mg的O-羧甲基壳聚糖溶解在25ml蒸馏水中，然后加入75ml甲醇稀释； 将153mg脱氧胆酸溶解于IOml无水二甲基亚砜中，加入1 Umg 1_乙基_3_3_ 二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐(l-Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) carbodiiamideHydrochloride) 和68mgN-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应池；将活化的脱氧胆酸加入0-羧甲基壳聚糖的溶液中，强烈搅拌至溶液呈光学透明。混合液在室温下反应3 后，纯化，冷冻干燥，得两亲性的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物，即D0MC。紫外法测得脱氧胆酸的取代度为8. 9%。(2) 0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸与叶酸偶联取M^iig叶酸溶解于IOml无水二甲基亚砜中，滴加5滴三乙胺，并加入2IOmgl-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和126mgN-羟基琥珀酰亚胺，室温下连续搅拌2h， 制成叶酸活性酯溶液；称取230mgD0MC溶解于25ml蒸馏水中，然后加25ml甲醇，搅拌至溶液光学透明。然后将叶酸活性酯溶液滴加到DOMC溶液中，在室温下搅拌3 使叶酸偶联到壳聚糖分子上。然后滴加0. IM的氢氧化钠溶液至pH值为9.0终止反应。分离纯化，冷冻干燥，得叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物即D0MC-FA。紫外法侧得叶酸的取代度为11.5%。所得叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物的1H-NMR结构谱图见图1。 在DOMC-FA的1H-NMR谱图中，0. 5-1. 2ppm处的吸收峰分别对应于脱氧胆酸残基上18、19和 21位的角甲基，6. 5-9. Oppm的峰归属于叶酸芳香环质子的特征峰，说明脱氧胆酸和叶酸分别成功的偶联到了羧甲基壳聚糖上。实施例2 载体材料细胞毒性检测将对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞5000cells/well/100y L，接种于96孔板，24 小时后分别给予胶束材料DOMC、DOMC-FA配置成的0. 01-lmg/mL的胶束溶液，置于37°C的培养箱中孵育72小时后，加入15 μ 1 5mg/ml MTT溶液，37°C继续培养4小时后将培养液替换成200 μ 1的DMS0，震荡lOmin，用酶标仪在570nm测定吸光度值。以不载体材料的肿瘤细胞为对照，计算细胞抑制率。载体材料DOMC_FA、DOMC分别对MCF-7细胞产生的毒性结果见图2。结果显示，在 0. 01-lmg/mL范围内，DOMC、DOMC-FA的细胞存活率均大于85%，说明载体材料本身对细胞的毒性作用很小，仅仅是药物的载体，对接下来的药物敏感试验影响很小。实施例3 体外培养MCF-7细胞对载罗丹明B纳米胶束的摄取
制备包载罗丹明B的DOMC、DOMC-FA纳米胶束。取对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞接种于6孔板，培养M小时后，去掉培养液， 用冷的PBS清洗一次，再用载罗丹明B的DOMC、DOMC-FA纳米胶束溶液Iml孵育0. 5h, 2h， 4h (罗丹明B浓度为5 μ Μ)，相同浓度游离罗丹明B作为对照，用PBS液三次，在荧光显微镜下观察罗丹明B的摄取情况。结果见图3。图3为MCF-7细胞对载罗丹明B的D0MC、D0MC_FA 纳米胶束温育不同时间摄取的荧光电镜照片，A 游离罗丹明B，B 载罗丹明B的DOMC纳米胶束溶液，C 载罗丹明B的DOMC-FA纳米胶束溶液，D 载罗丹明B的DOMC-FA纳米胶束溶液+ImM的游离叶酸。结果表明，纳米胶束在MCF-7肿瘤细胞中的摄取能力均随时间的延长而增强。其中，叶酸修饰的纳米胶束在细胞中的蓄积程度要高于非叶酸组，DOMC-FA纳米胶束的摄取可被过量游离叶酸所抑制，说明叶酸修饰的纳米胶束有良好的肿瘤细胞靶向作用，且纳米胶束的摄取主要通过叶酸受体途径。实施例4 制备载紫杉醇DOMC-FA纳米胶束称取25mg DOMC-FA聚合物超声分散于5ml去离子水中，加入15mg紫杉醇，室温下搅拌3小时。然后用探头式超声在90w功率下冰浴处理三次，每次两分钟，每次间隔2min， 超声脉冲开4s停2s。将所得的混合物在3000r/min离心20min以除去游离的药物和载体材料，接着自聚物溶液过0. 45um的滤膜，即得载紫杉醇DOMC-FA纳米胶束溶液，4°C冰箱贮存或冷冻干燥。将制备的纳米胶束溶液稀释后，以ktasizer 3000 HS型激光粒度分布仪测定粒径分布，测得平均粒径为258. 2nm，多分散性系数为0. 132，如图4所示；以H-7000型透射电子显微镜观测其形态，如图5所示。由图4可知，所得载药纳米胶束溶液大小均一、形态圆整、成型性好、粒径在250nm左右。实施例5 制备联合载紫杉醇、维拉帕米的DOMC-FA纳米胶束称取25mg DOMC-FA聚合物超声分散于5ml去离子水中，加入15mg紫杉醇、15mg维拉帕米，室温下搅拌3小时。然后用探头式超声在90w功率下冰浴处理三次，每次两分钟， 超声脉冲开4s停2s。将所得的混合物在3000r/min离心20min以除去游离的药物和载体材料，接着自聚物溶液过0. 45um的滤膜，即得联合载紫杉醇、维拉帕米DOMC-FA纳米胶束溶液，4°C冰箱贮存。高效液相色谱法依次测得紫杉醇的包封率和载药量分别为84. 43%和33. 61% ； 维拉帕米的包封率和载药量分别为82.和33. 42%，说明该载药纳米胶束有疏水性内核，具有很高的载药量和包封率。载药纳米胶束4°C冰箱贮存3个月，其外观形态、粒径及其分布、包封率和载药量几乎没有变化，说明该载药纳米胶束具有良好的稳定性。实施例6 载紫杉醇、维拉帕米DOMC-FA纳米胶束的体外释放称取25mg DOMC-FA聚合物超声分散于5ml去离子水中，加入170. 8 μ g紫杉醇和 22. 73mg维拉帕米，室温下搅拌3小时。然后用探头式超声在90w功率下冰浴处理三次，每次两分钟，超声脉冲开4s停2So将所得的混合物在3000r/min离心20min以除去游离的药物和载体材料，接着自聚物溶液过0. 45um的滤膜，即得联合载紫杉醇、维拉帕米DOMC-FA纳米胶束溶液，4°C冰箱贮存。采用反向动态透析法测定药物的释放度取Iml纳米胶束溶液装在截留分子量为 12，000的透析袋中，以含0. 5% Tween 80的PH为7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS) 150ml为释放介质，搅拌速度为lOOr/min，温度为37士0. 5°C，在预定的时间取Iml透析介质并加入等量新鲜的释放介质。取样后进样20μ 1进行HPLC测定，计算累积释放百分率，如图6所示。结果显示，载药纳米胶束有良好的缓释特性。实施例7 载紫杉醇DOMC-FA、DOMC纳米胶束分别对MCF-7细胞抑制试验将对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞5000CellS/Well/100l·! L，接种于96孔板，培养M小时后，将培养液替换为200 μ 1的叶酸偶联载紫杉醇纳米胶束(DOMC-FA/PTX)、无叶酸载紫杉醇纳米胶束(D0MC/PTX)、游离紫杉醇药物(Free PTX)三种制剂，置于37°C的培养箱中孵育72小时后，加入15 μ 1 5mg/ml MTT溶液，37°C继续培养4小时后将培养液替换成 200 μ 1的DMS0，震荡lOmin，用酶标仪在570nm测定吸光度值。以不加药的肿瘤细胞为对照，计算细胞抑制率及IC5Q。紫杉醇制剂对MCF-7细胞产生的毒性结果见图7。结果显示，叶酸偶联载药纳米胶束有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，三种制剂的IC5tl值依次为14.01 士 0. 5nM、 11. 78士0. SnM和6. 61 士0. 9nM，抑制作用为叶酸偶联胶束>无叶酸胶束>游离药物。结果表明，叶酸偶联载药纳米胶束有良好的肿瘤细胞靶向性和抑制肿瘤细胞生长的作用。
权利要求
1.一种叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，其特征在于是以叶酸、0-羧甲基壳聚糖和脱氧胆酸为原料制备而成的主动靶向的纳米胶束载体材料，其是通过以下制备方法得到的(1)0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联①称取250mg的0-羧甲基壳聚糖溶解在25ml蒸馏水中，然后加入75ml甲醇稀释；②将35 ^Omg脱氧胆酸溶解于IOml无水二甲基亚砜中，然后加入相当于脱氧胆酸 1. 5倍摩尔量的1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和相当于脱氧胆酸1. 5倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌池；③将步骤②中活化的脱氧胆酸加入步骤①中溶解有0-羧甲基壳聚糖的溶液中，强烈搅拌至溶液呈光学透明，然后使混合液在室温下反应36h，得到反应溶液；④将上述得到的反应溶液在甲醇与水的混合溶液中透析3天，然后冷冻干燥，即得两亲性的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物；(2)0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸与叶酸偶联①将0.8 2. 4mol叶酸或叶酸衍生物溶解于IOml无水二甲基亚砜中，然后滴加3 5滴三乙胺，并加入相当于叶酸2倍摩尔量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和相当于叶酸2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下连续搅拌池，制成叶酸活性酯溶液；②称取250mg的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物溶解于25ml蒸馏水中，然后加入 25ml的甲醇，搅拌至溶液光学透明；③将叶酸活性酯溶液滴加到步骤②得到的DOMC溶液中，在室温下搅拌36h，然后滴加氢氧化钠溶液至PH值为9. 0，终止反应，得反应液；④将上述得到的反应液在PH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液以及蒸馏水中各透析3天，冷冻干燥，得叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物。
2.根据权利要求1所述的叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，其特征在于所述0-羧甲基壳聚糖的脱乙酰度> 85%，羧甲基取代度> 80%，分子量为 50，000-150，000。
3.根据权利要求1所述的叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，其特征在于所述脱氧胆酸的取代度范围在2% -15%。
4.根据权利要求1所述的叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，其特征在于所述叶酸衍生物为叶酸、亚叶酸、四氢叶酸或二氢叶酸，并且叶酸基的取代度范围在 5% -15%。
5.权利要求1所述的叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物的制备方法，其特征在于，步骤如下(1)0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联①称取250mg的0-羧甲基壳聚糖溶解在25ml蒸馏水中，然后加入75ml甲醇稀释；②将35 ^Omg脱氧胆酸溶解于IOml无水二甲基亚砜中，然后加入相当于脱氧胆酸 1. 5倍摩尔量的1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和相当于脱氧胆酸1. 5倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌池；③将步骤②中活化的脱氧胆酸加入步骤①中溶解有0-羧甲基壳聚糖的溶液中，强烈搅拌至溶液呈光学透明，然后使混合液在室温下反应36h，得到反应溶液；④将上述得到的反应溶液在甲醇与水的混合溶液中透析3天，然后冷冻干燥，即得两亲性的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物；(2) 0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸与叶酸偶联①将0.8 2. 4mol叶酸或叶酸衍生物溶解于IOml无水二甲基亚砜中，然后滴加3 5滴三乙胺，并加入相当于叶酸2倍摩尔量的1-乙基-3-3- 二甲基氨丙基碳化二亚胺盐酸盐和相当于叶酸2倍摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下连续搅拌池，制成叶酸活性酯溶液；②称取250mg的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸偶联物溶解于25ml蒸馏水中，然后加入 25ml的甲醇，搅拌至溶液光学透明；③将叶酸活性酯溶液滴加到步骤②得到的DOMC溶液中，在室温下搅拌36h，然后滴加氢氧化钠溶液至PH值为9. 0，终止反应，得反应液；④将上述得到的反应液在PH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液以及蒸馏水中各透析3天，冷冻干燥，得叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述0-羧甲基壳聚糖的脱乙酰度 ^85%,羧甲基取代度> 80%，分子量为50，000-150, 000 ；所述脱氧胆酸的取代度范围在 2% -15%。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述叶酸衍生物为叶酸、亚叶酸、四氢叶酸或二氢叶酸，并且叶酸基的取代度范围在5% -15%。
8.权利要求1所述的叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物作为介导靶向壳聚糖载药纳米胶束在制备抗肿瘤药物受体靶向纳米胶束制剂中的应用。
9.一种制备抗肿瘤药物受体靶向纳米胶束制剂的方法，其特征在于，步骤为称取 25mg叶酸修饰的0-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，超声分散于5ml去离子水中，然后加入5 20mg的抗肿瘤药物，或抗肿瘤药物和抗肿瘤药物增敏剂，在室温下搅拌3小时；然后用探头式超声在90w功率下冰浴处理三次，每次两分钟，每次间隔2min，超声脉冲开如停 2s ；然后将所得的混合物在3000r/min离心20min，接着过0. 45um的滤膜，即得抗肿瘤药物受体靶向纳米胶束制剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述抗肿瘤药物为紫杉醇、阿霉素或喜树碱；所述抗肿瘤药物增敏剂为维拉帕米、三苯氧胺、奎尼丁或环孢菌素A。
全文摘要
本发明公开了一种叶酸修饰的O-羧甲基壳聚糖-脱氧胆酸复合物，是以叶酸、O-羧甲基壳聚糖和脱氧胆酸为原料制备而成的主动靶向的纳米胶束载体材料，本发明采用O-羧甲基壳聚糖为载体材料，用脱氧胆酸进行疏水性改造，然后用叶酸表面修饰，制成叶酸介导肿瘤组织靶向的聚合物胶束。以紫杉醇为模型药物采用自组装法制备载药纳米胶束，经试验证实，该载药纳米胶束载药量和包封率高，具有缓释性，通过叶酸受体途径有效摄入肿瘤细胞，增加药物在肿瘤组织的分布，从而提高疗效、降低毒副作用，达到靶向治疗的目的。该发明为难溶性抗肿瘤药物提供了一种理想的新型药物载体和制剂形式。
文档编号A61K9/00GK102319436SQ201110236200
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月17日 优先权日2011年8月17日
发明者刘光璞, 刘悦, 张典瑞, 段存贤, 王飞虎, 贾乐姣, 陈瑀璇 申请人:山东大学