专利名称：三种α型芋螺多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种α型芋螺多肽及其应用。
背景技术：
芋螺属腹足纲软体动物，全世界约有500余种，遍布世界各暖海区，我国有芋螺 100多种，主要分布在我国的西沙群岛、海南岛及台湾海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌，每种芋螺的毒液中含50-200个活性多肽，不同品种芋螺所含的活性肽各不相同，即使同种芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差异，理论上估计约存在5万多种不同活性的多肽(Mcintosh, J. Μ.，Jones, R. Μ. (2001). Cone venom-from accidental stings to deliberate injection. Toxicon,39,1447-1451. Nelson, L. (2004). Venomous snails :0ne slip, and you，re dead. Nature，429，798-799.)。芋螺多肽能特异性作用于乙酰胆碱等神经递质的各种受体亚型，以及钙、钠和钾等多种离子通道，不仅可以直接作为药物，还可以作为理想的分子模型用于开发新药的先导化合物。其中，ω型芋螺多肽MVIIA 已被FDA批准作为治疗HIV和晚期癌症痛的药物进入市场；从中国南海线纹芋螺中发现的 S0-3 也具有很强的镇痛活性(Dai qy et al. J Nat Prod 2003，66 (9) 1，276-9 ；专利 Zl 00128525. 4)。但上述两种芋螺多肽作用于中枢神经的N-型钙通道，给药方式为鞘内，不方便使用。α -芋螺多肽(α -CTX)属于芋螺多肽A超家族(按信号肽保守序列及二硫键排列模式芋螺多肽分为Α，Μ, 0，P，I，J，S，T等超家族)，特异作用于肌肉型及神经元型nAChRs。 绝大多数α-芋螺多肽含12-18个氨基酸、两对二硫键(CCXmCXnC,连接方式为1_3，2_4)。 根据m，η的数目不同，α -芋螺多肽细分为α 3/5，α 4/3，α 4/4，α 4/6，α 4/7亚家族。目前发现某些α-芋螺多肽具有镇痛活性，其中α-芋螺多肽vci. i(gccsdprcnydhpeiconh2) 是来自维多利亚芋螺(Conus Victoriae)，由16个氨基酸组成，含两对二硫键(二硫键的排列方式为 1-3，2-4) (Sandall et al. Biochemistry2003，42，6904-6911.)。研究表明 Vcl. 1在神经性疼痛动物模型中表现出了较好的镇痛活性并具有加速损伤神经恢复的作用 (Satkunanathan et al. Brain Res 2005，1059，149-158)，2006 年已进入临床研究阶段。另一种α型芋螺多肽RgIa在动物模型中同样表现出镇痛作用。由此可见，α型芋螺多肽中存在某些具有较好镇痛活性的多肽，它们对于开发新一代神经性疼痛的治疗药物具有重要意义，而且这些多肽可以采用皮下、肌肉或腹腔等给药方式，大大方便了应用。根据神经损伤的病因、性质和程度不同，在临床上分为中枢神经疼痛和外周神经损伤所致的周围神经疼痛两大类。其中，中枢神经疼痛简称中枢痛，为中枢神经系统的疼痛传导通路发生损害或功能障碍而引起的原发性疼痛，常见于脊髓的创伤、脑血管疾病或多发性硬化症和肿瘤等。周围神经疼痛系外伤、缺血、压迫、感染、炎症或代谢等因素损伤外周神经所致，如幻肢痛、带状疱疹后神经痛、多发性神经炎、糖尿病性周围神经痛等。神经性疼痛的典型症状包括感觉异常、痛觉过敏和痛觉超敏等。临床上常用的药物主要有抗惊厥药(如莱提西酞、奥卡西平)、阿片类药(如吗啡)和各种抗抑郁药的联用，但是由于毒副作用以及长期用药带来的耐受性、成瘾性等问题，治疗效果不佳(Dray et al, Br J Anaesth. 2008,101(1),48-58 ；Gilron et al, Expert Opin Emerg Drugs. 2007,12(1), 113-26.)。因此，发现新一代高活性、低耐受和非成瘾的镇痛药物十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种α型芋螺多肽及其应用。本发明提供的α型芋螺多肽为通式I所示的多肽；X^-Χ200Χβ—Χ4_-^-14^- ^通式 I通式I中&选自G、R中任意一个氨基酸或空缺；&选自G、N、K中任意一个氨基酸；&选自S、T、D、M中任意一个氨基酸；&选自N、R、I、F中任意一个氨基酸；&选自P、S、H中任意一个氨基酸；&选自A、F、D、T中任意一个氨基酸；X7选自M、K、Y、P、N中任意一个氨基酸；&选自L、R、N、I中任意一个氨基酸；X9选自K、I、D、Y中任意一个氨基酸；X10选自Y、N中任意一个氨基酸；X11选自P、R、S、K中任意一个氨基酸；)(12选自N、D、E、R、L中任意一个氨基酸；X13选自L、Q、F中任意一个氨基酸或空缺；X14选自N、Y中任意一个氨基酸或空缺；β选自酰胺基、或羧基；上述字母定义如下D_天冬氨酸；E-谷氨酸；I-异亮氨酸；K-赖氨酸；L-亮氨酸； M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-丝氨酸；T-苏氨酸；G-甘氨酸；F-苯丙氨酸；P-脯氨酸；H-组氨酸；A-丙氨酸；Y-酪氨酸。所述多肽具体可为如下七种多肽中的任意一种多肽I 氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽II 氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽III 氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽IV 氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽V 氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VI 氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VII 氨基酸序列如序列表的序列13所示。
7个多肽的氨基酸序列如下
多肽tlnh2-gccsnpacmlknpnlc-conh2 ；
多肽t2:nh2-ncctrsfckriypdlc-conh2 ；
多肽t3nh2-gccdipdcynknreqc-conh2 ；
多肽jmnh2-nccmfhtcpidysrfnc-conh2 ；
多肽t5nh2-gnccmfhtcpidysrfnc-conh2 ；
多肽t6nh2-gnccmfhtcpιdysrfyc-conh2 ；
多肽t7nh2-rkccsnpacnrynklc-cooh。
所述多肽ii的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列8所示且最后一-位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3缓冲液中，用氨水调节pH
值为8. 2，磁力搅拌Μ-4 !，得到多肽II。所述多肽III的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列9所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0. IM的 NH4HCO3缓冲液中，用氨水调节pH值为8. 2，磁力搅拌对-4他，得到多肽III。所述多肽IV 的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列10所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3缓冲液中，用氨水调节pH值为8. 2，磁力搅拌 Μ-4 !，得到多肽IV。所述多肽V的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3缓冲液中， 用氨水调节PH值为8. 2，磁力搅拌M-4 !，得到多肽V。所述多肽VI的制备方法具体如下 化学合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽， 溶解于0. IM的NH4HCO3缓冲液中，用氨水调节pH值为8. 2，磁力搅拌对-4他，得到多肽VI。 所述多肽I的制备方法具体如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列7所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，置于PH7. 70. IM Tris-HCl缓冲液中氧化^h，然后加入醋酸终止反应，脱盐冻干，然后与IOmM碘溶液避光反应lOmin，得到多肽I。所述多肽VII的制备方法具体如下化学合成序列表的序列13所示的线性多肽，置于pH7. 70. IM Tris-HCl 缓冲液中氧化^h，然后加入醋酸终止反应，脱盐冻干，然后与IOmM碘溶液避光反应lOmin， 得到多肽VII。所述多肽的编码基因也属于本发明的保护范围。所述多肽的编码基因具体可为如下七种DNA片段中的任意一种(1)序列表的序列1自5’端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2自5’端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表的序列3自5’端第133至180位核苷酸所示的DNA分子；(4)序列表的序列4自5，端第139至189位核苷酸所示的DNA分子；(5)序列表的序列5自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(6)序列表的序列6自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(7)序列表的序列7自5’端第133至180位核苷酸所示的DNA分子。本发明还保护一种用于镇痛的药物，其活性成分为以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽在制备用于镇痛的药物中的应用也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种镇痛剂，为以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽或均可应用于制备镇痛剂。
上述α型芋螺多肽可采用Fmoc法固相合成，用高效液相色谱技术纯化。经过活性测定发现通式I的7个多肽具有镇痛作用，其中α芋螺多肽T_l、Τ_2、 Τ-3、Τ-4具有显著的镇痛活性，Τ5-Τ7也有明显镇痛活性，在抑制镇痛方面具有应用价值。所述的α型芋螺多肽的衍生物也属于本发明的保护范围。所述的α型芋螺多肽的衍生物可为如下(I)、(II)、(III)或(IV)(I)将所述α型芋螺多肽进行一个或多个氨基酸的插入和/或替换和/或缺失， 得到的α型芋螺多肽的衍生物；(II)将所述α型芋螺多肽或⑴α型芋螺多肽的衍生物进行环化、脂化或PEG化修饰，得到的α型芋螺多肽的衍生物；(III)将所述α型芋螺多肽或⑴α型芋螺多肽的衍生物与载体联接，得到的α 型芋螺多肽的衍生物；(IV)将一个或几个所述α型芋螺多肽或(I) α型芋螺多肽的衍生物连接为多聚体，得到的α型芋螺多肽的衍生物。所述的α型芋螺多肽中，可对侧链氨基酸进行修饰，这些残基的修饰可以增强肽的生物活性或者靶向的选择性。所述取代还可以是“保守性取代”或“非保守性取代”。取代可以是一个氨基酸的取代，也可以是多个氨基酸的取代，可以是连续的取代，也可以是分散的取代。“保守性取代”将所述的α型芋螺多肽中的一个或多个氨基酸残基用构象为D-型的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸替换，以增加生物利用度及提高抑制活性；D-型的氨基酸指与组成蛋白质的L-型的氨基酸相对的氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、Y -氨基丁酸、高丝氨酸等；人工修饰的氨基酸指经过甲基化，磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见 L-型氨基酸。“非保守性取代”多肽中的一个氨基酸或多个氨基酸残基被不同性质的氨基酸所取代，或者被非常规氨基酸所取代。所述添加，可以是一个氨基酸或者多个天然的或者非常规的氨基酸。所述缺失，也包括一个或者多个氨基酸的缺失。所述载体包括但是不局限于蛋白质、聚乙二醇、脂类物质等。几个(1-4个)相同的α型芋螺多肽可通过氨基酸，如赖氨酸、半胱氨酸，或者其他的分子连接在一起形成多聚体。所述药物中还可含有阿片受体拮抗剂、阿片受体部分激动剂、去甲肾上腺素受体拮抗剂、α 2去甲肾上腺素受体激动剂、胆碱能神经拮抗剂、钙通道阻断剂或NMDA受体拮抗剂中的任意一种或几种，以增强其镇痛的效果。所述药物中可添加药剂学可接受的辅料，制成针剂、口服剂、直肠体给药剂或皮肤吸收剂等不同剂型。本发明的α型芋螺多肽具有以下特点1、本发明的α型芋螺多肽具有很强的镇痛活性，其中Τ-2、Τ-3、Τ_4四个肽在肌肉注射剂量在很低的情况下(lOnmol/kg)既可使痛阈率提高40%以上，T-I可使痛阈率提高 80%以上，T-5、T-6、T-7也可使痛阈提高20%以上。2、本发明的α型芋螺多肽来自中国南海芋螺，具有全新的氨基酸组成，与目前报道的α型芋螺多肽在氨基酸组成上具有显著差异。3、本发明的α型芋螺多肽作用于外周神经系统，给药方式为皮下、肌肉或腹腔注射，与现有的镇痛药物MVIIA的鞘内给药方式相比，应用更便利。
图1为Τ-2、Τ-3、Τ-4、Τ-5、Τ_6和Vcl. 1折叠24h后的色谱分析图；A :T_2折叠图； B :Τ-3折叠图；C :Τ-4折叠图；D :Τ-5折叠图；E :Τ_6折叠图；F =Vcl. 1折叠图。图2为T-l、Τ-7第一步折叠和第二步折叠后的色谱分析图；A =T-I第一步氧化折叠图；B =T-I第二步氧化折叠图；C :Τ-7第一步氧化折叠图；D :Τ-7第二步氧化折叠图。图3 为 T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T_7、Vcl. 1 多肽纯化后的色谱分析图；A =T-I 纯化分析图；B :T-2纯化分析图；C :Τ-3纯化分析图；D :Τ-4纯化分析图；E :Τ_5纯化分析图；F :Τ-6纯化分析图；G :Τ-7纯化分析图；H =Vcl. 1纯化分析图。图4 为 T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T_7、Vcl. 1 多肽的镇痛活性。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、α型芋螺多肽的发现1、芋螺总RNA的提取从西沙群岛、海南三亚等地采集6种芋螺活体作为样本材料，分别采用Trizol 法提取6种芋螺的总RNA。6种芋螺大理石芋螺(Conus marmoreus)、堂皇芋螺(Conus imperial is) > fW ^ili (Conus litteratus) > H ^ili (Conus emaciatus)、少女宇 累 (Conus eberneus)、小牛芋螺(Conus vitulinus)。Trizol法提取总RNA的具体步骤①先于冰上取芋螺毒腺管，将其置于液氮中冷冻并用研磨器研成粉末，倒入事先冰浴的微量勻浆器中。②吸取1. 2ml Trizol加入勻浆器并进一步研磨使芋螺组织裂解释放RNA。③将研磨好的浆液倒入1. 5ml的离心管中，室温静置5min。④加入20%氯仿240 μ 1，剧烈震荡15s后，放于冰上lOmin。⑤4°C、12000rpm离心15min，小心转移上清到一新的离心管中，加入高盐沉淀液 250 μ 1、异丙醇250 μ 1，反复颠倒30次左右，再放于冰上IOmin。⑥ 4°C、12000rpm，离心 lOmin，弃去上清。⑦加入1. 2ml 75% 乙醇混勻，4°C、9045rpm 离心 5min。⑧弃去上清，空气中干燥lOmin，加入50-80 μ 1 DEPC溶解沉淀，溶液即为RNA溶液，于-80°C保存备用。2、cDNA 的合成采用大连iTaKafci公司的 3，Full_RACE 试剂盒(3，-Full RACE Core Set Ver 2. 0)进行cDNA的合成，具体方法如下按下列比例混合样品
RNase Free ddH204. 5 μ 1
3，RACE Adaptor (5 μ Μ)1 μ 1
RNA (1. 5 μ g total RNA)1 μ 1 混匀后，70° C变性lOmin，冰上急冷^iin。
上述反应溶液6. 5 μ 1
dNTP MixturedOmM each)1 μ 1
RNase Inhibitor0.25 μ 1
Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)0. 25 μ 15 X M-MLV Buffer2 μ 1混勻后，42°C反应lh，70°C反应15min，反应结束后的反转录产物于_20°C保存。3、芋螺毒素cDNA的3，-RACE扩增以步骤2合成的cDNA为模板，根据芋螺多肽A超家族α芋螺多肽信号肽区域设计α -CTX外侧引物Fl和内侧引物F2，分别和3，-RACE外侧引物Rl，3 ’ -RACE内侧引物R2 进行巢式PCR。Fl :5’ -ATGGGCATGCGGATGATGTTC-3，；F2 :5， -CTGTTGGTTGTCTTGGCAACCAC-3，；Rl :5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3，；R2 5 ’ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’。具体步骤第一轮PCR反应体系包括反转录的cDNA模板3 μ 1，1 X cDNA Dilution Buffer 117 μ 1，上游引物 Fl 2 μ 1，3，-RACE 夕卜侧弓| 物 Rl 2 μ 1，10XLA PCR Buffer II (Mg2+plus) 5 μ LTaKaRa LA Taq (5U/ μ 1)0. 25 μ 1，用灭菌的去离子水补齐总体积 50 μ 1。 进行PCR的循环条件为94°C预变性4分钟；94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒 (桶形芋螺及密码芋螺为lmin)，30个循环，最后在72°C延伸lOmin，4°C保温。第二轮PCR 反应体系包括第一轮 PCR 产物 1 μ 1，dNTP Mixture (各 2. 5mM) 8 μ 1， 10XLA PCR Buffer II (Mg2+plus) 5 μ 1，3，-RACE 内侧引物 R2 2口1，下游引物卩2 2μ 1, TaKaRa LA Taq (5U/μ 1) 0. 5 μ 1，用灭菌的去离子水补齐总体积50 μ 1。进行PCR的循环条件为94°C预变性4分钟；94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒(桶形芋螺及密码芋螺为lmin)，30个循环，最后在72°C延伸10min，4°C保温。PCR产物取8 μ L点样，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，在图像分析仪下紫外透射观察分析照相。4、PCR产物的克隆与测序用胶回收试剂盒回收上述特异PCR产物(300bp-800bp)与载体连接，6种PCR产物与pGM-T载体(TIANGEN生物公司)连接；转化大肠杆菌DH5 α，利用氨苄青霉素抗性挑选单克隆，37°C、220rpm进行摇菌，再通过PCR法挑选阳性克隆进行测序，PCR反应体系为反应菌液 1 μ 1，3，_RACE 内侧引物 R2 1口1，下游引物卩2 1 μ l,2XTaq PCRMaster Mix (Τ IANGEN 生物公司)12. 5 μ 1，ddH20 9. 5 μ 1，总反应体系为25 μ 1，反应条件同第二轮PCR的循环条件，阳性克隆进行测序，经过序列的分析和比对，获得了本发明所述通式I的新型α芋螺多肽序列。通式I的新型α芋螺多肽序列是根据前肽及芋螺毒素特点推测而来，前肽是根据前体基因推测而来。6种α芋螺多肽前肽序列见表1，6种α芋螺多肽前肽编码的多核苷酸序列见表2。表1前肽序列
权利要求
1.如下(1)或(2)或(3)所示多肽(1)氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；(2)氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；(3)氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽的制备方法如下化学合成氨基酸序列如序列表的序列10所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3缓冲液中，用氨水调节pH值为8. 2，磁力搅拌对-4他，得到⑴ 所示多肽；化学合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3缓冲液中，用氨水调节pH值为8. 2，磁力搅拌对-4他，得到⑵ 所示多肽；化学合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸残基酰胺化的线性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3缓冲液中，用氨水调节pH值为8. 2，磁力搅拌对-4他，得到(3) 所示多肽。
3.权利要求1或2所述多肽的编码基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于所述多肽的编码基因为如下(1)序列表的序列4自5，端第139至189位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列5自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表的序列6自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子。
5.一种用于镇痛的药物，其活性成分为权利要求1或2所述的多肽。
6.权利要求1或2所述的多肽在制备用于镇痛的药物中的应用。
7.一种镇痛剂，为权利要求1或2所述的多肽。
8.权利要求1或2所述的多肽在制备镇痛剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种α型芋螺多肽及其应用。本发明提供了七种多肽多肽I氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽II氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽III氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽IV氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽V氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VI氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸残基酰胺化；多肽VII氨基酸序列如序列表的序列13所示。经过活性测定发现通式I的7个多肽具有镇痛作用，其中α芋螺多肽T-1、T-2、T-3、T-4具有显著的镇痛活性，T5-T7也有明显镇痛活性，在镇痛方面具有应用价值。
文档编号A61P29/00GK102304171SQ20111025834
公开日2012年1月4日 申请日期2010年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者于正, 刘珠果, 吴巧玲, 孙婷, 戴秋云, 胡洁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所