重组人促卵泡激素及其制备的制作方法

专利名称：重组人促卵泡激素及其制备的制作方法
技术领域：
本发明属于蛋白质技术领域，具体而言，本发明涉及高比活性的重组人促卵泡激素和其制备方法。另外，本发明还涉及该制备方法中所用的中间体。
背景技术：
促卵泡激素(FSH)是调节雌性和雄性哺乳动物(包括人类)的生殖相关功能的重要激素，可用于治疗不排卵综合症、黄体缺陷以及不育症等。FSH是一个异源二聚体糖蛋白， 由非共价结合的α和β亚基结合而成。其中，α亚基和β亚基均为糖蛋白，各分布有2 个糖基化位点。FSH的糖基结构部分的存在及组分决定了其生物学功能的性能及稳定性。 而对于经历翻译、剪接和折叠才得到的蛋白质产物来说，其活性已经难以预料，而糖基化的存在与组分为预测蛋白质产物的性质带来了更大的难度，以至于美国FDA感叹道“生物制品的生产过程就是产品”。对于FSH的制备，中国专利第88103966号公开了采用免疫层析和逆相HPLC步骤从绝经后尿促性腺激素中纯化人FSH (hFSH)。此后，DNA重组制备的hFSH(rhFSH)的方法也有报道。例如，中国专利第98807811号致力于通过引入二硫键来稳定FSH，而中国专利第 99808813号和第20048003^65号则通过引入一些突变来提高性能及稳定性，但是这些蛋白结构的改变将增加该突变的FSH被机体识别为异源蛋白的隐患，从而在体内使用时带来免疫风险。中国专利第 200480036591 号、第 200580037591 号、第 200910048718 号和第 200910051483号通过后期纯化步骤的优化来提高hFSH的性能及稳定性，最终得到的高纯度的FSH的比活达到12104IU/mg。本发明人研制了不同于现有技术的FSH制备方法，在DNA水平上做了大幅度的优化，但不在最终产物的蛋白质水平上引入突变，即最终产物与天然hFSH的蛋白质一级结构相同，翻译产物正确，避免了体内用药时的免疫风险；另外在转染、培养以及后期纯化中进行了全面优化。最终，本发明人不但获得了表达水平高的rhFSH，更令人意想不到的是，获得的rhFSH的活性进一步得到了提高，比活高于现有技术所报道的。

发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供不同于现有技术的rhFSH的制备方法，该方法获得的最终产物正确，保留了 FSH的生物活性。另外，本发明还提供了该方法制备而得的 rhFSH以及该方法中使用的中间体。具体而言，在第一方面，本发明提供了高比活性的重组促卵泡激素，其比活性大于 12200IU/mg，优选大于 12300IU/mg，最优选为 12350 12400IU/mg，如 12390IU/mg。重组促卵泡激素优选是哺乳动物的重组促卵泡激素，最优选是重组人促卵泡激素(rhFSH)，该重组人促卵泡激素包括氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示的FSHa亚基蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示的FSHii亚基蛋白。在本文中，重组表示通过DNA重组技术获得的，而不是通过从天然来源分离提取的，例如不是从尿液中提取的。优选本发明第一方面的重组促卵泡激素由如下制备方法制备而得(1)将FSH α亚基基因和FSH β亚基基因可操作地插入真核表达载体中，获得能表达FSH α亚基蛋白和FSH β亚基蛋白的转染载体，其中，FSH α亚基基因包含编码FSH α亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，FSHβ亚基基因包含编码FSHi3亚基蛋白的外显子 2、内含子2和外显子3序列；(2)将转染载体转染入真核细胞并培养；和(3)将培养上清液依次经超滤、阴离子交换层析、疏水层析、阴离子交换层析、分子排阻层析和阴离子交换层析纯化。在本文中，可操作地插入表示根据基因序列和载体序列将基因插入载体从而能够进行表达。通常，将基因置于启动子序列和转录终止序列之间并保持阅读框一致。根据蛋白序列可以推导出大量的基因序列，但是不同基因序列的转录和表达的效率会有很大差异。尽管有基于表达宿主的密码子使用频率的优化手段，但是基因序列的优化仍旧带有很大的经验性。根据本发明人的经验，优选本发明第一方面中，亚基基因序列接近(或优选等于)其天然基因序列，优选FSHα亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO=I 所示，和/或，FSHii亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID Ν0:3所示。这些基因序列与现有报道的相应基因序列有差异，直接来自天然状态的基因序列，这可能是本发明的rhFSH能够高表达的原因之一。FSH的糖基对其生物活性有着至关重要的影响，因此需要在能够糖基化的真核生物细胞中表达的载体。优选本发明第一方面中，真核表达载体是哺乳动物表达载体，可以是串联表达载体，但更优选是双顺反子表达载体。在本发明的具体实施方式
中，真核表达载体是pIRES载体。本发明人发现，该载体与CHO-S细胞配合，表达获得的rhFSH的糖基化模式能够使得该rhFSH的比活性得到提高。优选本发明第一方面中，将FSHa亚基基因和FSHi^亚基基因分别插入pIRES载体中的Nhe I/EcoR I酶切位点之间和)(ba I/Not I酶切位点之间。这样的构建策略使得 FSHa亚基和β亚基的表达尽可能不相互干扰，由此可能提高表达量。FSH有两个亚基，通过多个二硫键相连，因此需要在海量的现有表达宿主细胞中选择出能够使FSH亚基正确连接的真核细胞，如哺乳动物细胞。根据本发明人的经验，优选本发明第一方面中，真核细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。在本发明的具体实施方式
中，真核细胞最优选是CHO-S细胞株。该细胞株相对于其他CHO细胞，表达上清液中rhFSH的纯度更高，表达量也更高，方便了下游的纯化工作。优选本发明第一方面中，阴离子交换层析选自DEAE-kpharose FF阴离子交换层析和/或Capto Q阴离子交换层析，更优选各步阴离子交换层析不完全相同；疏水层析是 Phenyl Sepharose HP疏水层析；分子排阻层析是kphacryl S-100HR分子排阻层析。这些下游纯化手段的组合能够生产出达到甚至大大超过药品标准所需纯度的rhFSH。在第二方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明第一方面的重组促卵泡激素和药学上可接受的载体。在本文中，“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、缓冲剂、保护剂、防腐剂、包裹材料或其他制剂辅料。优选在本发明第一个层面的各个方面中，通过注射途径来给药，尤其是皮下注射，因此所述药物组合物优选是粉针剂(如冻干粉针剂)和液体制剂。该药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，来治疗由于FSH不足而引起的疾病。可用给药方式包括，注射、口服、直肠、 舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药，优选胃肠道外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由临床医生根据受试者实际情况(如，病人的病情、体重、年龄、性别等)而方便地确定。在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的重组促卵泡激素的制备方法。优选所述制备方法包括(1)将FSH α亚基基因和FSHi^亚基基因可操作地插入真核表达载体中，获得能表达FSHa亚基蛋白和FSHii亚基蛋白的转染载体，其中，FSHa亚基基因包含编码FSHa 亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，FSHβ亚基基因包含编码FSHi3亚基蛋白的外显子2、内含子2和外显子3序列；(2)将转染载体转染入真核细胞并培养；和(3)将培养上清液依次经超滤、阴离子交换层析、疏水层析、阴离子交换层析、分子排阻层析和阴离子交换层析纯化。优选本发明第三方面中，亚基基因序列接近(或优选等于)其天然基因序列，优选 FSHa亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，和/或，FSH^亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。优选本发明第三方面中，真核表达载体是哺乳动物表达载体，可以是串联表达载体，但更优选是双顺反子表达载体。在本发明的具体实施方式
中，真核表达载体是PlRES载体。优选本发明第三方面中，将FSHa亚基基因和FSHi^亚基基因分别插入pIRES载体中的Nhe I/EcoR I酶切位点之间和)(ba I/Not I酶切位点之间。优选本发明第三方面中，真核细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。在本发明的具体实施方式
中，真核细胞最优选是CHO-S细胞株。优选本发明第三方面中，阴离子交换层析选自DEAE-kpharose FF阴离子交换层析和/或Capto Q阴离子交换层析，更优选各步阴离子交换层析不完全相同；疏水层析是 Phenyl Sepharose HP疏水层析；分子排阻层析是kphacryl S-100HR分子排阻层析。另外，本发明还提供了基因、载体、细胞以及细胞培养物等，其可以作为本发明第三方面的制备方法中的中间体。具体而言，在第四方面，本发明提供了 FSHa亚基基因，其包含编码FSHα亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，优选FSHa亚基蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。在本发明的具体实施方式
中，FSHa亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。在第五方面，本发明提供了 FSHii亚基基因，其包含编码FSHβ亚基蛋白的外显子 2、内含子2和外显子3序列，优选FSHii亚基蛋白的氨基酸序列如SEQID Ν0:4所示。在本发明的具体实施方式
中，FSHii亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID Ν0:3所示。在第六方面，本发明提供了载体，其包含本发明第四方面的基因和/或本发明第五方面的基因，优选包含本发明第四方面的基因和本发明第五方面的基因。在本发明的具体实施方式
中，最优选的载体是pIRES-FSH-α/β。
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在第七方面，本发明提供了细胞，其包含本发明第四方面的基因和/或本发明第六方面的基因，或者其转染入了本发明第六方面的载体。所述细胞的出发细胞优选是CHO 细胞，更优选是CHO-S细胞株。在第七方面，本发明提供了细胞上清液，其为培养本发明第七方面的的细胞所得的上清液。本发明的有益效果在于可以替代现有人FSH的使用和制备；本发明的rhFSH的活性高；本发明的制备方法能够表达具有适宜糖基化模式的高活性rhFSH，而且表达量高， 培养上清液纯度高。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修F和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。


图IAFSHa和β亚基基因序列的PCR产物电泳图，其中上样样品为，第1道 分子量标记，依次为 0. 5kb, 1. Okb, 1. 5kb, 2. Okb, 2. 5kb, 3. 0kb,4. Okb, 5. 0kb,6. 0kb,8. Okb, 10. Okb ；第 2 道FSH0 亚基基因[约 1. 96kb]；第 3 道FSHa 亚基 CDNA[约 0. 7kb]；第 4 道FSHα亚基基因的内含子[约2. IkbJ0图2本发明的pIRES-FSH-α/β载体的酶切电泳鉴定图谱，其中上样样品为，第 1 道分子量标记，依次为 0. 5kb, 1. Okb, 1. 5kb，2. 0kb，2. 5kb，3. 0kb，4. 0kb，5. 0kb，6. Okb, 8. Okb, 10. Okb ；第 2 道分子量标记，依次为 0. 25kb,0. 5kb, 1. Okb, 1. 5kb，2. Okb ；第 3 道未酶切的ρ IRES-FSH- α /β载体作为对照；第4道p IRES-FSH- α/β载体用Nhe I/EcoRI双酶切；第5道:pIRES-FSH- α/β载体用Xbal/NotI双酶切。图3WeStern Blot结果图，其中上样样品为，第1道蛋白质分子量标记；第2道 本发明的工程细胞株培养上清液10 μ 1 ；第3道现有5F5细胞培养上清液10 μ 1作为对照； 第4道从人尿提取的尿源性FSH 10 μ g作为对照。图4DEAE-kphar0Se阴离子交换层析图谱，其中箭头所示的峰经检测有FSH活性。图5Phenyl Sepharose HP疏水层析图谱，其中箭头所示的峰经检测有FSH活性。图6Capto Q阴离子交换层析图谱，其中箭头所示的峰经检测有FSH活性。图7S印hacryl S-100HR分子排阻层析图谱，其中箭头所示的峰经检测有FSH活性。图SDEAE-kpharose FF阴离子交换层析图谱，其中箭头所示的峰经检测有FSH活性。图9FSH蛋白的SEC-HPLC鉴定图谱。图10FSH蛋白亚基的RP-HPLC鉴定图谱。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory ^ ess)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《蛋白质技术手册》(科学出版社，2000)等手册和相关药物法规、规定以及本文所引用的参考文献和所用的试剂、载体等的厂商说明来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。实施例IrhFSH基因的克隆及表达1，人FSH α亚基基因中内含子序列的克隆本发明人研究发现，FSHa亚基基因中的多个内含子尽管不对最终表达的FSHa 亚基产生影响，但是对FSH α亚基的表达量产生影响，有的增加表达，有的却减少表达，其中FSHa亚基基因上游的内含子能够显著增加表达量，因此保留对这一内含子片段进行克隆。其克隆采用常规的PCR法，以人基因组DNA(Clontech公司)为模板进行扩增，扩增程序依次为95°C 5分钟，三十个循环(每循环94°C 1分钟，50°C 1分钟，72°C 1分钟)， 720C 10分钟；扩增所用的引物如下(分别引入NheI和I^stI酶切位点): 引物 a 1 5 ‘ AAGGTAAGTGCTAGCAAATT3 ‘NheI引物 a 2 5 ‘ TAATCCATGGCGCTCCTGCAGA3 ‘PstIPCR产物在0. 8%琼脂糖凝胶上进行电泳确认，其长度为2. Ikb左右(如图1所示)。用胶回收试剂盒(美国Qiagen公司)回收该DNA片段后，直接连接，克隆到pGEM -T 载体(美国Promega公司)中，获得的重组载体命名为TA-alpha-intron。2，人FSH α亚基前体cDNA序列的克隆本发明人研究发现，虽然FSH α亚基前体RNA(编码116个氨基酸)需要在细胞内多一步剪接过程才能产生成熟的人FSHa亚基(92个氨基酸)，但是用前体进行表达得到的成熟的人FSH α亚基表达量大于直接使用成熟的人FSH α亚基进行表达，因此保留对人 FSHa亚基前体的cDNA序列进行克隆。其克隆采用常规的PCR法，以从人垂体cDNA文库(Becton Dickinson Company, BD)为模板进行扩增，扩增程序依次为95°C 5分钟，三十个循环(每循环94°C 1分钟， 50°C 1分钟，72°C 1分钟)，72°C 10分钟；扩增所用的引物如下(分别引入I^stI和EcoRI酶切位点)

引物α 3
5' CATGTCTGTCTGCAGGAGCGCCATGGATTACTACACA 3' PstI
引物 α 4 5 ‘ AGAATTCAGCACTTGGTAAAACATTTAAGATTT3 ‘ EcoRI
PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳确认，其长度为600bp左右(如图1所示)。用胶回收试剂盒回收该DNA片段后，直接连接，克隆到pGEM -T载体中，获得的重组载体命名为TA-alpha-cDNA。
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3，人FSH β亚基基因序列的克隆本发明人研究发现，直接对包含FSHii基因的外显子2、内含子2和外显子3的序列的DNA序列进行表达，其中包括了 FSHii的前体以及内含子等冗余序列，但是获得的人 FSH^亚基的产量将显著提高，因此保留对这一 DNA序列的克隆。其克隆采用常规的PCR法，以人基因组DNA(Clontech公司)为模板进行扩增，扩增程序依次为95°C 5分钟，三十个循环(每循环94°C 1分钟，50°C 1分钟，72°C 1分钟)， 720C 10分钟；扩增所用的引物如下(分别引入^CbaI和NotI酶切位点):引物β :5， ATCTAGACCAGACCAGGATGAAGACACTC3’XbaI引物β2:5’ AAGCGGCCGCAAATGTCCACTGATCTTTATTCTT3‘NotIPCR产物在0. 8%琼脂糖凝胶上进行电泳确认，其长度为1. 96kb左右(如图1所示)。用胶回收试剂盒回收该DNA片断后，直接连接，克隆到pGEM -T载体中，重组载体命名为 TA-beta。4，重组人FSH双顺反子表达载体的构建对上述构建的TA-alpha-intron载体以NheI和PstI (内切酶均购自美国 NewEngland Biolabs)双酶切后，以胶回收试剂盒回收该约2. Ikb的FSHa亚基内含子片段；同样，对上述构建的TA-alpha-cDNA载体以I^stI和EcoRI双酶切后，以胶回收试剂盒回收该约0. 7kb的FSH α亚基cDNA片段。用"Γ4连接酶(美国Promega公司)将上述两个双酶切片段与用NheI//EcoRI双酶切的pIRES载体(美国CL0NTECH公司，Cat. No. 631605)连接，获得的重组载体命名为pIRES-alpha，然后转化大肠杆菌DH5ci。抽提转化阳性菌株中的pIRES-alpha，以Nhe I/EcoRI双酶切，验证有约2. 7kb的插入片段；测序分析发现，插入片段具有SEQ ID N0:1所示的DNA序列，我们预计最终表达产物是序列如SEQ ID NO :2所示的成熟的FSH α亚基的氨基酸序列。该DNA序列与Genbank等公共数据库中的序列有所差异，包括序列中缺失数据库中相当于第10-15位的TCTAGA以及第978-979位的CA，而第186位为T (数据库中为Α)，第769位为G (数据库中为Α)，第1559位为C (数据库中为 Τ)，第1762位为G(数据库中为Α)。对上述构建的TA-beta载体以^CbaI和NotI双酶切后，以胶回收试剂盒回收该约1. 96kb的FSHii亚基片段。用T4连接酶将该双酶切片段与用)(baI/N0tI双酶切的pIRES-alpha载体连接，获得的重组载体命名为pIRES-FSH- α/β,然后转化大肠杆菌 DH5 α。抽提转化阳性菌株中的pIRES-FSH- α t/ β，分别以Xba I/NotI和Nhe I/EcoR I双酶切，验证确有约2. 7kb和约1. 96kb的插入片段(如图2所示)；测序分析发现，约1. 96kb 的插入片段具有SEQ ID NO :3所示的DNA序列，我们预计最终表达产物是序列如SEQ ID NO :4所示的成熟的FSHii亚基的氨基酸序列。该DNA序列与Genbank等公共数据库中的序列有所差异，包括序列中的数据库中相当于第44位为A(数据库中为G)。5，rhFSH表达细胞株的建立rhFSH需要得到适当的糖基化才能保证其活性及实际生产所需的蛋白表达量，因此，经本发明人研究，需要选用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的CHO-S细胞(可购自Gibco公司)。采用经本发明人优化的Lipofectamine2000法将pIRES-FSH- α /β转染入CHO-S 细胞中。具体而言，将CHO-S细胞培养在IOml CHO无血清培养液(JRHBiosciences公司) 中，待其长至1 X IO6个/ml的密度时，以IOOOrmp离心2min，弃去培养液，用CHO无血清培养液洗涤三次，洗涤后离心去除培养液，然后将细胞用anl CHO无血清培养基重悬；将15 μ g pIRES-FSH- α /β 质粒 DNA 和 4δ μ lLipofectamine2000 (购自 hvitrogen 公司)混勻，室温置10分钟后，加到上述细胞悬液中，将该混合液在37°C温箱中培养6小时后，以SOOrmp 离心5min，弃去上清液，再加8ml新鲜的CHO无血清培养液，继续培养M小时。然后将培养获得的细胞用37°C预热的30ml CHO无血清培养液稀释成细胞悬液， 取IOml细胞悬液，用CHO无血清培养液稀释为40ml，从中取10ml，用CHO无血清培养液继续稀释为50ml，以50 μ 1/孔接种于96孔板(接种细胞数为5 X IO2/孔)。以上培养板放入37°C培养箱培养Mh，然后各孔中加入150ul含G418(购自 Amresco公司)的选择性培养液(即，将G418溶解于CHO无血清培养液中)，其中G418的起始浓度为200μ g/ml。将细胞重新放置37°C培养箱中继续培养，每隔3天换选择性培养液，换的选择性培养液中G418浓度依次为200 μ g/ml,400 μ g/ml和1000 μ g/ml。G418浓度递加至lmg/ml培养14 18天，对照的CHO-S空白细胞全部死亡时，转染的CHO细胞出现存活的克隆。收集细胞克隆并更换G418浓度为800 μ g/ml的选择性培养液培养，作为表达FSH的工程细胞株。经FSH检测ELISA试剂盒(美国R&D公司)检测，存活的克隆表达水平高，其rhFSH的表达水平为2 μ g/106细胞/24hr，远远高于现有5F5细胞的表达量；经 Western Blot检测，其表达的rhFSH为单一条带，均一性优于提取自人尿的尿源性FSH(如图3所示)。重复该培养步骤均能获得工程细胞株。实施例2rhFSH的纯化及鉴定取实施例1的工程细胞株的培养上清液1000ml，过截留分子量为IOkD的超滤膜， 取滤液上样于用含 0. lmol/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)平衡的 DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱(GE Healthcare公司)并收集流穿液(见附图4)；增加此步骤收集的流穿液的盐离子浓度使之达到0. 5mol/L NaCl，上样Phenyl Sepharose HP层析柱(GE Healthcare公司)进行层析，并用20mmol/LTriS-HCl (pH 8.0)缓冲液洗脱，收集洗脱液中 ELISA法检测含FSH的峰(见图幻；将收集的洗脱液上样Capto Q层析柱(GE Healthcare 公司)进行层析，并分别用含 0. 02mol/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)及含 0. Imol/ LNaCl的20mmOl/LTriS-HCl(pH 8.0)进行阶段洗脱，并收集洗脱液，ELISA法检测后活性级分为用含0. Imol/LNaCI的20mmol/LTriS-HCl (pH 8. 0)洗脱的洗脱液(见图6)，并收集；将收集液直接上样于已经用10mmol/LTris-HCl(pH 8. 0)平衡好的kphacryl S-100HR 层析柱(GE Healthcare公司)并按照紫外吸收值进行收集洗脱液中FSH纯度较高部分 (见图7)，将收集液上样于DEAE Sepharose FF层析柱，分别用含0. 02M NaCl的IOmmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)及含 0. 08mol/LNaCl 的 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)进行阶段洗脱，并收集洗脱液(见图8)。即获得了纯化的rhFSH，任选可进一步冷冻干燥而浓缩。该纯化的rhFSH水解后经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定，经上述过程纯化得到的 rhFSH经SEC-HPLC(Agilent Technologies公司)鉴定(图9)，峰位与我们预测的理论值一致，纯度达到99%;经反相HPLC鉴定(图10)，产物中的两个亚基分子量都与我们预测的理论值一致，表明通过筛选得到的FSH工程细胞能够正确剪接并且转化前体蛋白，具有正确的亚基结构，而其糖基化后的产物的分子量在43KD左右，表明经上述纯化过程能够保留 rhFSH的糖基化模式，从而保证了表达FSH的高活性。 采用常规的大鼠卵巢增重法(刘志勇，等.高纯度卵泡刺激素效价及相关指标的检测.江西医学院学报，2004年，第1期)，通过比较FSH标准品(WHO生物活性标准品 96/642)与经上述过程纯化得到的rhFSH对雌性幼大鼠卵巢增重的程度，以确定本发明的糖基化模式的rhFSH的效价。结果显示，该rhFSH的体内生物学比活为12390IU/mg。
权利要求
1.高比活性的重组促卵泡激素，优选是重组人促卵泡激素(rhFSH)，其比活性大于 12200IU/mg，优选大于 12300IU/mg，最优选为 12350 12400IU/mg，如 12390IU/mg。
2.权利要求1所述的重组促卵泡激素，其由如下制备方法制备而得(1)将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因可操作地插入真核表达载体中，获得能表达 FSHa亚基蛋白和FSHii亚基蛋白的转染载体，其中，FSHa亚基基因包含编码FSHa亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，FSHβ亚基基因包含编码FSHβ亚基蛋白的外显子2、 内含子2和外显子3序列；(2)将转染载体转染入真核细胞并培养；和(3)将培养上清液依次经超滤、阴离子交换层析、疏水层析、阴离子交换层析、分子排阻层析和阴离子交换层析纯化。
3.权利要求2所述的重组促卵泡激素，其中，FSHa亚基基因的多核苷酸序列如SEQID NO :1所示，和/或，FSH^亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.权利要求2所述的重组促卵泡激素，其中，真核表达载体是哺乳动物表达载体，优选是PlRES载体。
5.权利要求4所述的重组促卵泡激素，其中，将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因分别插入PlRES载体中的Nhe I/EcoR I酶切位点之间和)(ba I/Not I酶切位点之间。
6.权利要求2所述的重组促卵泡激素，其中，真核细胞是哺乳动物细胞，优选是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，更优选是CHO-S细胞。
7.权利要求2所述的重组促卵泡激素，其中，阴离子交换层析选自DEAE-kpharoseFF 阴离子交换层析和/或Capto Q阴离子交换层析，疏水层析是Wienyl Sepharose HP疏水层析，分子排阻层析是kphacryl S-100HR分子排阻层析。
8.药物组合物，其包含权利要求1-7之任一所述的重组促卵泡激素和药学上可接受的载体。
9.如权利要求2-7之任一所述的重组促卵泡激素的制备方法。
10.可用于权利要求9所述的重组促卵泡激素的制备方法中的中间体，其选自(a)FSH α亚基基因，其包含编码FSH α亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，优选其多核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；(b)FSH^亚基基因，其包含编码FSHβ亚基蛋白的外显子2、内含子2和外显子3序列， 优选其多核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；(c)载体，其包含(a)和/或(b)所述的基因，优选其为pIRES-FSH-α/β；(d)细胞，优选是CHO细胞，更优选是CHO-S细胞，其包含(a)和/或(b)所述的基因， 或者其转染入了(c)所述的载体；或(e)细胞上清液，其为培养(d)所述的细胞所得的上清液。
全文摘要
本发明提供了高比活性的重组人促卵泡激素和其制备方法。另外，本发明还提供了该制备方法中所用的中间体，包括基因、载体和细胞。
文档编号A61K38/24GK102295695SQ201110269900
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者丁丽艳, 刘洪霞, 尉继征, 石欣欣, 郝鹏, 金磊 申请人:长春金赛药业股份有限公司