专利名称：红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属中药领域，具体涉及红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
背景技术：
红景天苷是从红景天中分离提纯的天然产物,具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基、增强记忆、改善睡眠、消除忧郁感和保护心血管等多种药理作用。经年来研究发现红景天苷还有抗肝纤维、改善肝脏损伤的作用。王晓东等分别以CC14、D2半乳糖胺及卡 介苗加脂多糖诱导小鼠肝脏损伤模型，以ALT、NO和MDA、甘油三酯(Triglyceride，TG)含量为指标，观察红景天苷对肝脏损伤的保护作用，结果表明红景天苷能明显降低肝损伤模 型的血清ALT、NO和肝匀浆MDA、TG含量，从而证明了其具有明显的保肝作用。各种肝脏疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病，自身免疫性肝病，药物性肝病，慢性血吸虫病以及一些代谢性或先天性慢性肝病都可通过肝纤维化发展成肝硬化。肝星状细胞Ofepatic Stellate Cell，HSC)在肝纤维化的发生发展中起着关键作用。在肝脏炎症状态下，HSC经多种细胞因子如血小板衍生生长因子(TOGF)和转化生长因子β UTGF-β I)的激活，活化为肌成纤维细胞并大量增殖，表达α-平滑肌肌动蛋白、合成分泌大量细胞外基质，细胞可以收缩，亦可从Disse腔内向肝细胞坏死区域迁移聚集。肝纤维化进程中，HSC所表现出的迁移特性，可导致炎症区域活化的HSC数目增多，而加重病灶局部的纤维化程度，促使疾病进展。所以，如能抑制HSC在肝损伤时向炎症区域迁移，就可能干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的目的。而HSC的迁移受到多种细胞因子和细胞外基质成分的调控，如，H)GF、TGF-13 I等；其中TOGF是最强的促进HSC增殖迁移的刺激因子。为此，本发明设计了以TOGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出红景天苷抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。目前，对红景天苷在抑制肝星状细胞迁移中的作用尚未见相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供红景天苷的新用途。为解决上述技术问题，本发明提供红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。所述红景天苷抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为10_4mol/L 10_7mol/L，优选为105mol/L。本发明设计了以TOGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出红景天苷抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。实验证明10_4mol/L、10_5mol/L、10_6mol/L和10_7mol/L 4个浓度梯度的红景天苷均可抑制TOGF诱导的LX-2迁移；10_5mol/L红景天苷抑制LX-2迁移的作用最强，且与10_4mol/L无统计学差异，这2组与10_6mol/L和10_7mol/L之间有统计学差异。在迁移同等条件下培养细胞时，4个浓度红景天苷对细胞形态均无影响。遵从药物筛选原则，首先选择有统计学差异者，即抑制迁移效率最佳者；因此，选择红景天苷最佳药物浓度为l(T5mol/L。从而本发明验证了 ΙθΛιοΙ/L l(T7mol/L的红景天苷均可抑制TOGF诱导的肝星状细胞(HSC)的迁移，从而可干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的效果，即本发明验证了红景天苷可用于制备抑制肝星状细胞迁移的药物。同时通过对比实验发现l(T4mol/L l(T7mol/L青蒿琥酯、l(T4mol/L l(T7mol/L灯盖花素、lCT4mol/L lCT7mol/L 红景天式、lCT5mol/L lCT7mol/L 丹参酌■酸 B 盐、lCT6mol/L和l(T7mol/L粉防己碱、l(T5mol/L l(T7mol/L黄芪总甙等6种中药组分均可抑制I3DGF诱导的HSC的迁移；其中10_5mol/L红景天苷抑制迁移作用最佳，与其它各浓度的各组分组比较均有显著性差异。
图1是本发明试验例中细胞迁移杯(Transwell)的示意图；细胞迁移杯为一个可·放置在孔板里的小杯子，其关键部分就是杯底层一张半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有密度均一的许多微孔，孔径为8. O μ m。将Transwell放入24孔培养板中形成Transwell与培养板的双腔系统，Transwell内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以半透膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，上层中的细胞亦可迁移至下层，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。图2是本发明试验例中不同浓度青蒿琥酯对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图2A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200)；图2B表示对LX-2形态的影响，X 200。图3是本发明试验例中不同浓度灯盏花素对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图3A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200)；图3B表示对LX-2形态的影响，X 200。图4是本发明试验例中不同浓度红景天苷对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图4A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200)；图4B表示对LX-2形态的影响，X 200。图5是本发明试验例中不同浓度丹参酚酸B盐对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图5A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200);图5B表示对LX-2形态的影响，X 200。图6是本发明试验例中不同浓度粉防己碱对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图6A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200)；图6B表示对LX-2形态的影响，X 200。图7是本发明试验例中不同浓度黄芪总甙对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图7A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200)；图7B表示对LX-2形态的影响，X 200。图8是本发明试验例中各最佳浓度的青蒿琥酯、灯盏花素、红景天苷、丹参酚酸B盐、粉防己碱、黄芪总甙抑制I3DGF致LX-2迁移的比较示意图(苏木素染色，X200)。
具体实施例方式以下通过试验例对本发明红景天苷的药理活性试验及结果作进一步的阐述试验例一、材料与方法(一)材料青蒿琥酯Artesunatum,分子式(C19H28O8),分子量384，纯度彡 ％ % (by HPLC)；灯盏花素Breviscapi，分子式(C41H68O51)，分子量785，纯度彡95% (by HPLC);红景天苷:Salidroside，分子式(C14H2tlO7)，分子量 300. 30，纯度彡 95 % (by HPLC);丹参酚酸 B 盐Salvianolic acid Β-Mg2+，分子式(C36H3tlO16Mg)，分子量 742，纯度彡 95 % (by HPLC);粉防己碱Tetrandrine,分子式(C38H42N2O6),分子量623,纯度彡95 % (byHPLC);黄苗总式Astragaloside，分子式(C41H68O51)，分子量 785，纯度彡 95% (by HPLC)。以上除丹参酚酸B盐由中国科学院上海药物研究所提供外，其它均购自于南京泽朗医药科技有限公司。人肝星状细胞株LX-2，其制备方法为约15g重正常人肝脏组织先后经链酶蛋白酶和胶原酶消化后，由8. 2% Nycodenz离心分离得肝星状细胞(HSC)。细胞用含10%胎牛血清的M199培养液培养。当细胞长满培养皿后，用胰蛋白酶和EDTA消化传代，每7_10传代一次。当HSC培养传到4代，将SV40T-抗原DNA转染入HSC，获得细胞株LX-1。该细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养7代后，与原代细胞相比形态发生明显变化，增殖加快。LX-2是以含I %胎牛血清的DMEM培养液培养半年后筛选得到的耐低血清(2 %胎牛血清)培养的细胞株(具体参见L Xu, A Y Hui,E Albanis,M J Arthur, S M 0’Byrne,WS Blaner,PMukherjee, S L Friedman,F J Eng. Human hepatic stellate cell lines,LX-1and LX-2 new tools for analysis of hepatic fibrosis Gut 2005;54:142-151·)。0. 1% I 型胶原溶液(Col I，lot 107K2331)(美国 sigma 公司)。
PDGF (血小板衍生生 长因子)，分子量12. 4kDa, Cat. No. 220BB,纯度> 97% (SDSPAGE)购于 R&D Systems, Inc。( 二 )方法1.各中药组分浓度配制各中药组分均取20mg。青蒿琥酯溶于5.2ml DMSO (二甲基亚砜)中，成10_2mOl/L储存液；灯盏花素溶于4. 3mlDMS0中，成10_2mol/L储存液；红景天苷溶于6. 7ml DMSO中，成10_2mol/L储存液；丹参酚酸B盐溶于3.7ml DMSO中，成10_2mOl/L储存液；粉防己碱溶于3. 2ml DMSO中，成10_2mOl/L储存液；黄芪总甙溶于2. 5ml DMSO中，成10_2mOl/L储存液。 上述各组分储存液均分别经0. 45 μ m滤膜过滤除菌，以含3 % FBS的DMEM培养基依次稀释为 ΙθΛιοΙ/L，l(T5mol/L，l(T6mol/L，l(T7mol/L 共 4 个浓度梯度。2.细胞迁移筛选实验(采用如图1所示的细胞迁移杯)(I)细胞培养与药物孵育将LX-2用含10% FBS DMEM在Φ 100_的培养皿中培养至细胞密度达到80 %左右。于迁移实验开始前24h，将细胞按表I或表2分组，每组I皿并将培养液更换为3 %FBSDMEM。于迁移实验开始12h前，按照分组情况加入培养液或相应药物的浓度进行孵育， 药物孵育时间为12h。
表1.单一中药组分筛选实验细胞分组和孵育用药
权利要求
1.红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红景天苷抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为 10 4mol/L 10 7mol/L0
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述红景天苷抑制肝星状细胞迀移的有效浓度为 10—5mol/L
全文摘要
本发明公开了红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。本发明设计了以PDGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，发现10-4mol/L～10-7mol/L的红景天苷均可抑制PDGF诱导的肝星状细胞(HSC)的迁移。
文档编号A61K36/41GK102988459SQ20111027465
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者徐列明, 张展 申请人:上海中医药大学附属曙光医院