专利名称：灯盏花素在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属中药领域，具体涉及灯盏花素在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
背景技术：
灯盏花素是从灯盏细辛中分离出的一类黄酮类成分，结构式鉴定为4，5，6_三羟基黄酮_7葡萄糖醛酸苷，具有广泛的药理作用和临床应用，研究发现其有改善心、脑血管血流量、抗血小板凝聚、抗氧自由基、增强肝脏解毒功能，保护糖尿病性肝脏、肾脏等作用。吉明柱等将肝硬化患者随机分为2组，结果表明灯盏细辛对肝硬化具有抗损害和抗纤维化的作用，治疗组肝功能显著改善(P <0.05)，肝纤维化5项指标明显降低(P <0.05)，显 著优于对照组(P < O. 05)。陈咏萍观察静脉滴注灯盏花素注射液对38例肝炎后肝硬肝纤维化指标的影响，灯盖花素治疗后血清透明质酸(Hyaluronic Acid, HA)、III型前胶原(procollagen III，PIIIP)、层粘蛋白(Laminin, LN)较对照组明显降低。体内灯盖花素能抑制CCl4诱导的大鼠血清ALT和AST升高，阻止CCl4诱导的大鼠肝脏SOD (Super OxideDimutese,超氧化物歧化酶)、P0D (Peroxidase,辣根过氧化物酶)降低,并降低肝脏轻脯氨酸、胶原、MDA (Malonic dialdehyde，丙二醛)及TGF-β I (转化生长因子-β I)含量。各种肝脏疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病，自身免疫性肝病，药物性肝病，慢性血吸虫病以及一些代谢性或先天性慢性肝病都可通过肝纤维化发展成肝硬化。肝星状细胞Ofepatic Stellate Cell，HSC)在肝纤维化的发生发展中起着关键作用。在肝脏炎症状态下，HSC经多种细胞因子如血小板衍生生长因子(TOGF)和转化生长因子β UTGF-β I)的激活，活化为肌成纤维细胞并大量增殖，表达α-平滑肌肌动蛋白、合成分泌大量细胞外基质，细胞可以收缩，亦可从Disse腔内向肝细胞坏死区域迁移聚集。肝纤维化进程中，HSC所表现出的迁移特性，可导致炎症区域活化的HSC数目增多，而加重病灶局部的纤维化程度，促使疾病进展。所以，如能抑制HSC在肝损伤时向炎症区域迁移，就可能干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的目的。而HSC的迁移受到多种细胞因子和细胞外基质成分的调控，如，H)GF、TGF-13 I等；其中TOGF是最强的促进HSC增殖迁移的刺激因子。为此，本发明设计了以TOGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出灯盏花素抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。目前，对灯盏花素在抑制肝星状细胞迁移中的作用尚未见相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供灯盏花素的新用途。为解决上述技术问题，本发明提供灯盏花素在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。所述灯盏花素抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为10_4mOl/L liTmol/L，优选为104mol/L。本发明设计了以TOGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出灯盏花素抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。实验证明10_4mOl/L、10_5mOl/L、10_6mol/L和10_7mol/L4个浓度梯度的灯盏花素均可抑制I3DGF诱导的LX-2迁移。但10_4mol/L灯盏花素抑制迁移效果最佳与其它3个浓度相比均有统计学差异。在与迁移实验同等条件下培养细胞时，4个浓度的灯盏花素对细胞形态均无影响。遵从药物筛选原则，应首先选择有统计学差异者，即抑制迁移效率最佳者；因此，灯盏花素最佳药物浓度为ΙθΛιοΙ/L。从而本发明验证了 ΙθΛιοΙ/L l(T7mol/L的灯盖花素均可抑制F1DGF诱导的HSC的迁移，从而可干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的效果，即本发明验证了灯盏花素可用于制备抑制肝星状细胞迁移的药物。·
图1是本发明试验例中细胞迁移杯(Transwell)的示意图；细胞迁移杯为一个可放置在孔板里的小杯子，其关键部分就是杯底层一张半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有密度均一的许多微孔，孔径为8. O μ m。将Transwell放入24孔培养板中形成Transwell与培养板的双腔系统，Transwell内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以半透膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，上层中的细胞亦可迁移至下层，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。图2是本发明试验例中不同浓度灯盏花素对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图2A表示对TOGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，X 200)；图2B表示对LX-2形态的影响，X 200。
具体实施例方式以下通过试验例对本发明灯盏花素的药理活性试验及结果作进一步的阐述试验例一、材料与方法(一)材料灯盏花素Breviscapi，分子式(C41H68O51)，分子量785，纯度彡 95% (by HPLC)，购自于南京泽朗医药科技有限公司。人肝星状细胞株LX-2，其制备方法为约15g重正常人肝脏组织先后经链酶蛋白酶和胶原酶消化后，由8. 2% Nycodenz离心分离得肝星状细胞(HSC)。细胞用含10%胎牛血清的M199培养液培养。当细胞长满培养皿后，用胰蛋白酶和EDTA消化传代，每7_10传代一次。当HSC培养传到4代，将SV40T-抗原DNA转染入HSC，获得细胞株LX-1。该细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养7代后，与原代细胞相比形态发生明显变化，增殖加快。LX-2是以含I %胎牛血清的DMEM培养液培养半年后筛选得到的耐低血清(2%胎牛血清)培养的细胞株(具体参见L Xu, A Y Hui, E Albanis,M J Arthur, S M 0’Byrne,WS Blaner, PMukherjee,S L FriedmaniF J Eng. Human hepatic stellate cell lines,LX-1and LX-2 new tools for analysis of hepatic fibrosis Gut 2005 ;54 :142-151.)。
O. 1% I 型胶原溶液(Col I，lot 107K2331)(美国 sigma 公司)。PDGF(血小板衍生生长因子)，分子量12. 4kDa, Cat. No. 220BB，纯度> 97% (SDSPAGE)购于 R&D Systems, Inc。( 二 )方法1.灯盏花素浓度配制灯盏花素均取20mg。灯盏花素溶于4. 3ml DMSO (二甲基亚砜)中，成10 _2mol/L储存液。上述灯盏花素储存液均分别经O. 45 μ m滤膜过滤除菌，以含3 % FBS的DMEM培养基依次稀释为 ΙθΛιοΙ/L，l(T5mol/L，l(T6mol/L，l(T7mol/L 共 4 个浓度梯度。2.细胞迁移筛选实验(采用如图1所示的细胞迁移杯)(I)细胞培养与药物孵育将LX-2用含10% FBS DMEM在OlOOmm的培养皿中培养至细胞密度达到80 %左右。于迁移实验开始前24h，将细胞按表I或表2分组，每组I皿并将培养液更换为3%FBSDMEM。于迁移实验开始12h前，按照分组情况加入培养液或相应药物的浓度进行孵育，药物孵育时间为12h。表1.灯盏花素筛选实验细胞分组和孵育用药
~ 空白对~PDGF 组 PDGFPDGFPDGFPDGF
组照组+IO-4 mol/L组 +IO-5 mol/L组 +10_6 mol/L组 +10_7 mol/L组
用 3%FBS 3%FBS IU4 mol/L灯 IfJ5 mol/L灯 IfJ6 mol/L灯 IfJ7 mol/L灯
药盏花素盏花素盏花素盏花素表2.灯盏花素的最佳浓度统一筛选实验细胞分组和孵育用药
分组空白对照组 PDGF组PDGF +灯盏花素组
用药^3%FBS3%FBS 灯盏花素(2)以I型胶原包被细胞迁移杯半透膜将I型胶原用DMEM以1: 100稀释至10 μ g/ml (Col I溶液)。取24孔板，加入Col I溶液600 μ I/孔；用无菌镊子取细胞迁移杯放入加有Col I溶液的培养孔内，在每个细胞迁移杯内加入Col I溶液400μ1。放入恒温箱，37°C，45min。(3)接种细胞从恒温箱中取出孵育培养24h的LX-2，用胰蛋白酶传代细胞后，用含3% FBS的DMEM重悬细胞并调整细胞数为2 4X IO5个/ml。取出已包被Col I溶液的细胞迁移杯，吸弃细胞迁移杯内液体并用DMEM清洗2次，移入另一 24孔板(每孔预加0. 5ml含3% FBS的DMEM)。每个细胞迁移杯内加入300 μ I细胞悬液，放入CO2培养箱，37°C，lh。(4)药物配制与添加
①TOGF的添加将接种有LX-2的细胞迁移杯取出，吸弃上层培养液后移入另一24孔板，并依照表I或表2加药(每组3孔)；含TOGF各组中加入TOGF并使其终浓度为10ng/mlο②灯盏花素筛选将灯盏花素依照表3加药(每组3孔)。本实验重复3次。表3灯盏花素筛选实验药物添加表
权利要求
1.灯盏花素在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灯盏花素抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为 10 4mol/L 10 7mol/L0
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述灯盏花素抑制肝星状细胞迀移的有效浓度为 10—4mol/L。
全文摘要
本发明公开了灯盏花素在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。本发明设计了以PDGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，发现10-4mol/L～10-7mol/L的灯盏花素均可抑制PDGF诱导的肝星状细胞(HSC)的迁移。
文档编号A61K31/7048GK102988375SQ20111027465
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者徐列明, 张展 申请人:上海中医药大学附属曙光医院