专利名称：甲型流感病毒保守肽M2e与病毒样颗粒的缀合物及应用的制作方法
技术领域：
本发明 属于生物技术领域，具体涉及免疫学将免疫靶向治疗载体与甲型流感病毒保守短肽M2e偶联形成的缀合物。所述缀合物能交叉保护各亚型甲型流感病毒的攻击。
背景技术：
制备通用流感疫苗是目前流感疫苗研究的热点。流感是一种严重危害人类健康的急性呼吸道传染病，接种流感疫苗是最有效的防护手段。目前生产的流感疫苗主要针对诱导产生中和抗体的表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)但是有两个因素制约了季节性流感疫苗在防控流感大流行中的应用:一个是疫苗株与流行毒株是否匹配的问题，因为季节性流感疫苗主要通过诱发血凝素HA和神经氨酸酶NA的抗体起免疫保护，毒株不匹配就不会有好的保护效果；另一个是从确定疫苗毒株到最终获得疫苗所需的较长周期和对鸡胚的依赖。因此，利用甲型流感病毒的保守抗原，研制不同亚型间具有交叉保护作用的广谱流感疫苗，就成为流感疫苗研究的重要内容。甲型流感病毒基质蛋白2 (Mat rixprotein 2，M2)是除HA和NA以外的第3个外膜蛋白，M2的胞外区(M2ectodomain，M2e)是M2蛋白N端23个氨基酸，M2e在甲型流感病毒特别是人源的甲型流感病毒不同亚型间高度保守，M2尤其是M2e已成为广谱流感疫苗研究中常用的靶抗原。目前，已有四种基于M2e的疫苗进入I期临床研究，这些疫苗的研究结果为早日研制成功防控流感大流行的广谱流感疫苗提供了大量的实验资料。病毒样颗粒(VLP)是由病毒的衣壳蛋白装配成的不含病毒核酸的空壳结构，具有病毒的外形和免疫原性，可通过和病毒感染的途径诱导机体产生以体液免疫为主的反应，从而诱导产生抗体，由于VLP缺少遗传物质核酸，故避免了病毒感染的风险。VLP可以使外源表位以有序、阵列方式呈现，还能增加抗原的稳定性和免疫原性，如大肠杆菌表达的HBc、番木瓜花叶病毒(PapMV)、人乳头瘤病毒(HPV)、噬菌体Q β等VLP已作为载体应用于M2e-VLP疫苗研究。噬菌体V LP也是一种可将多肽抗原呈现在颗粒表面的载体。Q β-VLP可用作鼻腔免疫载体，有利于诱发局部和系统性免疫反应。目前国外已经制备出Q β噬菌体VLP病毒样颗粒用于降压疫苗的IIa临床实验。并已有M2e化学偶联或者基因融合的VLP进入临床I期实验。目前已有4家公司报道了 I期的基于M2e的流感疫苗的临床实验结果，这四家公司分别 Acambis Inc.(英国)，Cytos BiotechnologyU^fi), Merck & CoInc.(美国)，and VaxInnate Corp.(美国)。有基于融合的M2e_HBcVLP和M2e_flagellin,也有化学偶联的M2e-0MPC和M2e_AP205VLP。Q β噬菌体和ΑΡ205噬菌体都属于RNA病毒，其外形成球形，由衣壳蛋白组成的病毒颗粒非常适合用作疫苗载体。
发明内容
本发明目的是构建一种基于人甲型流感基质蛋白M2的保守序列M2e的病毒样颗粒偶联物(M2e)n-Qi3-VLP通用流感疫苗，偶联的方法可以为化学偶联或者是基因融合。偶联的M2e肽段可以串联为M2e-M2e或者(M2e)n其中η为1、2、3、4、5、6、7、8。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下:1.病毒样颗粒的制备:本发明 利用了已经公开的发明专利(专利申请号:201010028904.7)Q β噬菌体VLP作为偶联用载体。这种突变的VLP具有以下特点:(I)Qii噬菌体CP延伸蛋白基因第72位至73位密码子间，插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸序列AAGCTT (或者插入编码M2e的单基因序列或者重复串联的M2e基因序列)。并将CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后克隆到原核表达载体上。(2)插入在第72位和73位氨基酸为赖氨酸和亮氨酸是Q β噬菌体衣壳蛋白刺突顶端，是机体免疫系统识别的主要部门，即病毒样颗粒的免疫优势决定区。(3)该VLP是由大肠杆菌可溶性表达的。制备噬菌体病毒样颗粒Q β-VLP的具体步骤:菌种大肠杆菌DH5a/pETQ β-CP接种到LB培养基培养至适当菌液达到OD值，加入诱导剂IPTG诱导数小时后，收集菌液，使用超声破碎细胞，裂解后，离心分别收集上清和沉淀。对形成的多聚体，使用SepharoseCL-4B层析柱纯化。2.人甲型流感病毒基质蛋白M2保守序列M2e肽段的合成:采用固相合成法利用多肽合成仪自动人甲型流感病毒基质蛋白M2的保守肽段M2e 的氨基酸序列为 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro He Arg Asn Glu Trp GlyCys Arg Cys Asn AspSer SerAsp Cys (GenBank:ACA49877.1),其中 M2e 的 C末端加入半月光氨酸Cys以便于Q β -VLP偶联。偶联的M2e肽段可以串联为M2e_M2e或者(M2e)n其中η为 1、2、3、4、5、6、7、8。3.肽段M2e分别与噬菌体病毒样颗粒Q β _VLP、钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联:步骤:取50mg的Q β -VLP和5mg/mL的Sulfo-SMCClOml混合，室温反应2小时，并持续低速搅拌。使用0.1ΜρΗ7.2的PBS透析过夜，次日更换透析液，继续透析4小时后用于偶联。取100mgM2e肽溶于5ml偶联缓冲液(83mM磷酸钠缓冲液，0.1MEDTA,
0.9MNaCl，0.02% NaN3, ρΗ7.2)中，后将其与结合 Sulfo-SMCC 的 Q β -VLP 混合，室温反应2小时后，PBS透析过夜，次日更换透析液，继续透析4小时后_80°C保存，此即为制备好的M2e-QP VLP。本发明的优点在于:1.甲型流感病毒保守肽M2e与病毒样颗粒的缀合物具有交叉保护各亚型甲型流感病毒的攻击的能力，为通用型流感疫苗的研制打下基础。2.甲型流感病毒保守肽M2e与病毒样颗粒通过化学方法偶联，制备时间短，且易于大规模生产，克服了传统的用鸡胚生产流感疫苗在研制、生产技术路线方面的不足。
图1实施例二中小鼠抗血清滴度曲线。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:实施例一、M2e-Q β -VLP缀合物和对照品M2e_钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物的制备
步骤1、噬菌体病毒样颗粒Q β -VLP的制备:将菌种大肠杆菌DH5 a /pETQ β -CP接种到LB培养基培养至适当菌液达到OD值，加入诱导剂IPTG诱导数小时后，收集菌液，使用超声破碎细胞，裂解后，离心分别收集上清和沉淀。对形成的多聚体，使用SepharoseCL-4B层析柱纯化。步骤2、M2e多肽的合成:采用固相合成法利用多肽合成仪自动合成人甲型流感病毒M2蛋白保守序列M2e步骤3、肽段M2e分别和噬菌体病毒样颗粒Q β -VLP和钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联。分别取50mg的Q β -VLP和KLH，和5mg/mL的Sulfo-SMCClOml混合，室温反应2小时，并持续低速搅拌。使用0.1ΜρΗ7.2的PBS透析过夜，次日更换透析液，继续透析4小时后用于偶联。取100mgM2e肽溶于5ml偶联缓冲液(83mM磷酸钠缓冲液，0.1MEDTA，0.9MNaCl,
0.02% NaN3,pH7.2)中，后将其分别与结合Sulfo-SMCC的Q β -VLP和KLH混合，室温反应2小时后，PBS透析过夜，次日更换透析液，继续透析4小时后_80°C保存，此即为制备好的M2e-Q β VLP和M2e_KLH。M2e_KLH为检测M2e_Q β -VLP缀合物抗原性的对照品。实施例二、ELISA法检测小鼠血清抗体滴度6周龄C57BL/6雌鼠，20只随机分为4组，每组平均5只。组别分为M2e多肽组、M2e-Q0VLP组以及M2e-KLH组以及对照组。免疫方法、剂量、时间间隔、次数见下表I。表1:免疫策略
权利要求
1.甲型流感病毒保守肽M2e与病毒样颗粒的缀合物，其特征在于，采用人甲型流感病毒基质蛋白M2的胞外区M2e多肽作为半抗原，以已经公开的发明专利(专利申请号:201010028904.7) Q β噬菌体病毒样颗粒(Q β-VLP)作为载体，将I个M2e或多个M2e串联体与Q β -VLP结合制备成缀合物(M2e)n-Q β -VLP, η为I至8的自然数。
2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e与病毒样颗粒的缀合物，其特征在于，所述的M2e多肽来自于人甲型流感病毒株基质蛋白M2胞外区部分，所述的M2e多肽序列如SEQ N0.1所示。
3.根据权利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e与病毒样颗粒的缀合物，其特征在于，载体部分(Q β-VLP)采用的是已经公开的发明专利(专利申请号:201010028904.7)Qβ噬菌体病毒样颗粒(QP-VLP)制备技术。
4.根据权利要求1所述的甲型流感病毒保守肽M2e与病毒样颗粒的缀合物，其特征在于，所述的缀合物能用于 保护不同亚型人甲型流感病毒的攻击。
全文摘要
本发明涉及一种具有免疫靶向治疗的短肽载体Q β噬菌体病毒样颗粒VLP与人流感病毒M2蛋白保守肽M2e的缀合物。所述缀合物主要用于预防人甲型流感。所述缀合物的偶联方法采用Sulfo-SMCC方法。第一步制备Q β噬菌体的病毒样颗粒VLP，第二步制备sulfo-SMMC活化的病毒样颗粒VLP，第三步制备缀合物M2e-VLP。所述缀合物在小鼠体内产生高滴度保护性抗体，并能交叉保护各亚型甲型流感病毒的攻击。
文档编号A61K39/145GK103083656SQ20111033089
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者姬云, 昇文国, 刘红海, 许峰, 马严, 堵芸倩 申请人:苏州科贝生物技术有限公司