专利名称：一个芪类活性成分及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物中提取、分离纯化具有生物活性的化合物的一种方法，属于天然产物领域。具体是从木豆[Cajanus cajan L.Millsp.]叶中提取、分离纯化一种新的芪类化合物。该化合物12-羟基木豆芪酸，化学名为:3，12-二羟甚-4-异戊二烯基-5-甲氧基芪-2-羧酸。
背景技术：
木 [Cajanus cajan L.Millsp.]，为菜 族(Phaseoleae) 科(Leguminosae)、蝶形花亚科(Papilionaceae)、木豆属(Cajanus) —年生或多年生矮灌木,是木豆属中唯一的一个木本栽培作物，因其豆荚结于树冠枝梢上，故称木豆，别名鸽子豆、黄豆树、豆蓉树、观音豆、赤小豆、大木豆、三叶豆、花螺树豆、千年豆、树豆、蓉豆、柳豆、花豆、米豆等。木豆民间药用历史悠久，Morton和Duke总结了木豆在中国、印度、阿根廷等许多亚非国家的民间医药应用，其中木豆的叶用来治疗褥疮、膀胱结石、黄疸、痢疾、牙痛和生殖系统感染；其花用于支气管炎、咳嗽、肺炎(Morton J.F.，1976 ；Duke J.A.，1981)。据《陆川本草》记载，木豆叶性味平、淡，有小毒，有解痘毒，消炎肿等功效。可治小儿水痘，痈肿。该植物在我国多种地方药志中也有药用阐述,如《泉州本草》中就记载木豆清热解毒，补中益气，利水消食，排痈肿，止血止痢，且疗效显著。近年来，海南人民医院基于民间用药经验，用木豆叶治疗外伤、烧伤感染和褥疮等取得了较好的疗效。
目前，国内外对木豆生物学活性内容研究广泛，通过动物学模型以及细胞分子生物学手段证实木豆提取物及其化学成分能够治疗骨质疏松、股骨头坏死等骨相关疾病，具有降血糖和血脂、抗脑缺血缺氧损伤、抗氧化、保肝、抗炎、抗疟疾、抗菌]以及抗镰刀型贫血症等生理活性。但有效成分、作用机理等研究还不够清晰，限制其临床上的应用。国内外关于木豆叶的报道中，12-羟基木豆芪酸未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从木豆叶中提取分离的新芪类化合物(12-羟基木豆芪酸)及其制备方法。该成分具有体外抗氧化和抗肿瘤活性。该新化合物的制备方法:以木豆新鲜或干燥叶为原料，将木豆叶粉碎后用溶剂提取，提取液浓缩至干，然后超声波振荡絮凝、静置，所得絮凝物进行负压空化混悬液固萃取、大孔吸附树脂富集和正相硅胶中压柱层析，再结合低温析晶和重结晶技术，大量获得所述新芪类化合物。该方法简单、快速、目标化合物损失较少。本发明提供的新的芪类活性化合物——12-羟基木豆芪酸是通过以下方案来获得的:(I)以木豆新鲜或干燥叶为原料，将木豆叶粉碎后用溶剂提取，所用的提取方法包括浸泡、热回流、负压空化和超声波辅助提取等提取技术，采用的溶剂为氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇或醇水混合体系，提取液回收溶剂后得到粗提物。(2)提取得到的粗提物，加入5 10倍质量40 60°C的温水，在40 60KHz条件下超声波振荡10 30min,静置15 20min,得到富含该苗类化合物的絮凝物。
(3)超声波震荡絮凝得到的絮凝物，以10 15mL/g絮凝物的量加入乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一种，然后以0.01 0.07MPa负压为动力进行负压空化混悬液固萃取，持续5 15min，萃取2 4次，萃取液浓缩至干，得到目标物粗品。(4)将负压空化混悬液固萃取所得到的固形物部分用30 40%乙醇溶液配制成料液浓度为40 60mg/mL混悬液，同时将大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将混悬液通过AB-8、NKA-9、HPD-800、DlOl吸附柱的一种，上样量为1.0 3.5BV,以流速2 4BV/h、PH = 4条件下过吸附柱，吸附后用30 40%乙醇3BV洗去杂质，然后用50 80%乙醇4 8BV解吸，收集解吸液，浓缩至干，所得固形物为目标物。(5)将树脂解析后所得固形物用200 800目正相硅胶进行正相硅胶中压柱层析，流动相为石油醚或正己烷中的一种与二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的一种按照体积比5:1 50:1混合体系。再结合结晶和重结晶技术，得到纯度大于95%目标成分单体。结晶和重结晶所用溶剂为石油醚或正己烷中的一种与二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮或甲醇中的一种按照体积比15:1 1:1混合体系。本发明所得的活性成分成分经过UV，IR，MS, IHNMR和13CNMR等现代的物理手段和化学方法确定结构，见图1。该化合物名称为:3，12-二羟基-4-异戊二烯基-5-甲氧基芪-2-羧酸。因其与木豆芪酸结构相近，将其命名为:12-羟基木豆芪酸。该化合物为无色棱晶，三氯化铁反应呈现绿色(含有酚羟基)，浓硫酸/乙醇溶液加热反应有芳香气味产生(含羧基)。紫外吸收光谱(图2)显示该化合物中存在共轭发色团。红外光谱(图3)显示该化合物含有羟基、苯环、α，β不饱和酸。高分辨质谱HR-ES1-MS分析得到其分子量为354.2242，确定分子式为C21H22 05。如图4所示，ES1-MSm/z 353.4Μ-Η]-，377.6[M+H]+，731.8[2M+Na]+，在 m/z 353.4 的二级负离子质谱分析给出309 [M-44] -，239 [M-44-70] -，335 [M-H20] -，293 [M-60]-，其裂解规律与木豆芪酸相似。该化合物的ID-NMR谱如图5、6所示，IH NMR(500MHz, DMS0-d6)谱给出3个甲基信号 5 3.83(s,3H)U.63(s,3H)和 1.50 (s，3H)，I 个亚甲基信号 δ 3.17 (2Η)、I 个烯质子信号4.88 (d, J = 26.9Hz，1H)，综合分子式、1H-NMR、13C-NMR 数据与化合物 Longistyline C(C.J.Cooksey, 1982)、木豆苗酸(P.ff.Green, 2003) >3-hydroxy-5-methoxystilbene-2-carboxylic acid (Y.0hwaki, 1993)以及白藜芦醇衍生物(D.Koh, 2001)的相关谱图比较,推测该化合物为芪类物质。IH NMR(500MHz, DMS0-d6): δ 8.04 (br s，2H，H_7，H_8)，7.60-7.45 (m，4H，H-10，H-ll，H-13，H-14)，6.51(s，1H，H-6)，4.88(t，1H，H-2 ' ),4.67 (br s, 1H,12-0H) ,3.83(s，3H，-0CH3)，3.17 (d, J = 5.2Hz，2H，H_l' )，1.63(s，3H，H_5' )，1.50 (s,3H, H-4 ' )。13C NMR(125MHz，DMS0-d6): δ 173.2(-C00H)，170.0(C-5)，161.8(C-3)，142.8 (C-12)，137.6 (C-1)，133.7 (C_3 ' ),131.4 (C_8)，130.8 (C_9)，129.1 (C—10，C-14)，128.3(C-7)，125.9 (C_2 ' )，123.4 (C_4)，122.6(C_13)，121.9(C_11)，107.3 (C_2)，98.6 (C-6)，56.30 (-0CH3)，25.8 (C_4' ), 24.9 (C_l' ), 18.0 (C_5')。与化合物木豆芪酸相比，在H化学位移4.67 (br s，lH，12-0H)有所不同，其NMR谱图同样显示异戊二烯基团存在，但7.60-7.45(m，4H，H-10, H-1I, H-13，H-14)表明该化合物的苯环为单取代，故确定该化合物为3,12- 二轻基-4-异戍二烯基-5-甲氧基苗-2-羧酸(3,12-dihydroxy-4-prenyl-5-methoxystilbene-2-carboxylic acid)，与化合物木豆苗酸比较，命名为12-轻基木豆芪酸。本发明中的12-羟基木豆芪酸通过DPPH模型和MTT (噻唑蓝)方法分别检测其抗氧化活性和抗肿瘤活性。其在DPPH模型中的活性(IC5Q160.33±2.92μ8/πι1)比阳性对照药物抗坏血酸强，并且抑制人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺腺癌细胞(Α549)和人肝癌细胞(HepG2)的IC5tl值分别为10.13、12.01和12.78 μ g/mL，优于对照白藜芦醇。结果表明该活性成分具有良好的自由基清除活性和体外抗肿瘤活性。
图1:12_羟基木豆芪酸的结构式图2:12_羟基木豆芪酸的紫外光谱图3:12_羟基木豆芪酸的红外光谱。图4:12_羟基木豆芪酸的ES1-MS谱其中，A为负离子扫描模式下所得化合物的一级质谱TIC图，353.4[M-H]-为分子离子峰为负离子扫描模式下所得化合物的二级质谱图，图中显示了该化合物相应的分子碎片图5:12-羟基木豆芪酸的IH-NMR谱图6:12_羟基木豆芪酸的13C-NMR谱
具体实施例方式
实施例1.木豆叶中新的芪类活性化合物的分离称取木豆干叶的3.0kg，用80%乙醇超声波辅助提取2小时，提取3次。提取液合并、浓缩至干后，加入4升60°C温水中，于超声波提取器中40KHz条件下振荡絮凝25min，静置20mm，取粘稠絮凝物，以12mL/g絮凝物的量加入乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一种，以0.03MPa负压为动力进行负压空化混悬液固萃取，持续15min，萃取3次，萃取液浓缩至干，得到的固形物用40%乙醇溶液配制成料液浓度为55mg/mL混悬液，上样量为2.5BV,在流速3BV/h、PH = 4条件下过AB-8型大孔吸附树脂柱，吸附后用40%乙醇3BV洗去杂质，然后用80 %乙醇6BV解吸，收集解吸液，浓缩至干后用少量的无水甲醇溶解，加入IOOg目数为300 400硅胶拌匀、减压蒸干。预先称取提取物质量9倍的500 800目硅胶，采用正己烷湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，依次以正己烷:三氯甲烷(10: I)、正己烷:三氯甲烷(5: I)、三氯甲烷连续中压洗脱，TLC监测收集富含目标化合物的流分，浓缩后低温析晶得到产品，再进行重结晶后得目标化合物46.8mg,纯度为95.8%。实施例2.DPPH自由基清除活性测定将DPPH溶于无水乙醇配成0.004%溶液。将0.1mL不同浓度的样品溶液和0.1mL不同浓度的抗坏血酸对照品溶液分别加入ImL的DPPH溶液中，迅速混匀，然后再加入1.4mL无水乙醇，待70min后，置于紫外分光光度计中，以空白溶剂为对照，在517nm波长下测定溶液的吸光度。以抗坏血酸为阳性对照，用下面的公式计算样品清除自由基的能力:抗氧化能力(Ip)= [ (AB-AA) /AB] X 100式中:AB、AA分别为70min后空白和待测样的吸光度。实验结果统计处理计算自由基清除活性的IC5tl值。结果表明12-羟基木豆芪酸(IC5Q160.33±2.92 μ g/ml)DPPH自由基清除活性优于阳性对照抗坏血酸(IC50194.18 ±3.82 μ g/ml)。实施例3.MTT (噻唑蓝)法抗肿瘤活性测定(I)细胞培养:收集处于对数生长期的肿瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液稀释至细胞浓度为2 X 104个/mL (活细胞^95%),以每孔200 μ L接种于96孔板中，置于37°C、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养 24h。(2)加入药物:将药物用DMSO溶解，按照实验设计的药物加入96孔板中，用RPMI1640细胞维持液稀释至设定的不同工作浓度。以不含药物的等量DMSO为阴性对照、不加细胞液的等量药物为空白对照。加入药物后，置于37°C、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养72h。(3)加入MTT:将取MTT用无血清RPMI1640培养液配成浓度为5mg/mL的溶液，
0.22 um过滤除菌。加药物培养后，每孔加入MTT溶液20 μ L，置于37°C、5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中继续孵育4h。终止培养，吸弃孔内上清液，沉淀物用培养液洗涤3次后，每孔加入100 μ L DMSO振荡使之充分溶解。在酶标仪上测定各孔OD57tl值。(4)数据计算:按照下述公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，
权利要求
1.一种新的芪类生物活性成分，其特征在于:以木豆叶为原料，提取后经负压空化混悬液固萃取、大孔吸附树脂富集、结合柱层析技术分离得到，采用紫外、红外、质谱和核磁共振等光谱分析技术，确定该化合物为12-羟基木豆芪酸:3，12- 二羟基-4-异戊二烯基-5-甲氧基苗~2~羧酸。
2.按照权利要求1所述的新的芪类活性成分的制备方法，其特征在于:以木豆新鲜或干燥叶为原料，将木豆叶粉碎后用溶剂提取，提取液浓缩至干，然后超声波振荡絮凝、静置，所得絮凝物进行负压空化混悬液固萃取、大孔吸附树脂富集和正相硅胶中压柱层析，再结合低温析晶和重结晶技术得到所述单体化合物。
3.按照权利要求2所述的新的芪类活性成分的制备方法，其特征在于:所述的提取方法包括浸泡、热回流、负压空化和超声波辅助提取等提取技术，所述溶剂为氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇或醇水混合体系。
4.按照权利要求2所述的新的芪类活性成分的制备方法，其特征在于:所述的超声波振荡絮凝技术为木豆叶提取物中加入40 60°C温水的量为提取物质量的5 10倍，超声波振荡絮凝时间为10 30min，频率为40 60KHz，静置时间为15 20min。
5.按照权利要求2所述的新的芪类活性成分的制备方法，其特征在于:所述的负压空化混悬液固萃取技术以负压为动力，利用气泡产生的空化效应、湍流效应对超声波振荡絮凝得到的絮凝物进行强化液固萃取，所用溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷，萃取所用的溶剂体积为10 15mL/g絮凝物，所用压力为0.01 0.07MPa,持续时间为5 15min，萃取次数为2 4次，回收有机相溶剂后所得固形物为目标物粗品。
6.按照权利要求2所述的新的芪类活性成分的制备方法，其特征在于:所述的大孔吸附树脂富集法所用树脂包括AB-8、NKA-9、HPD-800、DlOl吸附树脂中的一种，该方法中大孔树脂吸附步骤采用湿法装柱，保留液面，将负压空化混悬液固萃取所得到的固形物部分用30 40%乙醇溶液配制成料液浓度为40 60mg/mL混悬液，上样量为1.0 3.5BV,以流速2 4BV/h、PH = 4条件下过吸附柱，吸附后用30 40%乙醇3BV洗杂质，然后用50 80%乙醇4 8BV解吸，收集解吸液，浓缩至干，所得固形物为目标物。
7.按照权利要求2所述的新的芪类活性成分的制备方法，其特征在于:所述的正相硅胶中压柱层析以大孔吸附树脂富集后得到的固形物为分离样品，所用硅胶为200 800目，所用硅胶量为样品质量的8 10倍，所用流动相为石油醚或正己烷中的一种与二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的一种按照体积比5:1 50:1混合体系。
8.按照权利要求2所述的新的芪类活性成分的制备方法，，其特征在丁:所述的重结晶技术所用的溶剂为石油醚或正己烷中的一种与二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的一种 按照体积比15:1 1:1混合体系。
9.权利要求1中所述的新的芪类化学成分在制备抗氧化活性药物中的用途。
10.权利要求1中所述的新的芪类化学成分在制备抗肿瘤活性药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种从木豆叶中提取纯化新的芪类活性成分-12-羟基木豆芪酸及其提取纯化方法与应用。该化合物结构见图1。所采取的技术方案为以木豆叶为原料，经溶剂提取后，将提取液浓缩至干并超声波振荡絮凝分散于水中，然后采用负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术以及正相硅胶中压柱层析技术，再结合低温析晶和重结晶技术得到纯度达95％以上的所述成分。通过DPPH模型和MTT方法检测该化学成分的抗氧化活性和抗肿瘤活性。结果表明该活性成分具有良好的自由基清除活性和体外抗肿瘤活性。本发明中12-羟基木豆芪酸的制备方法简单、易行，产品得率高、纯度高、附加值高，适用于产业化生产和应用，可进一步研制开发为新型抗氧化剂和抗肿瘤药物。
文档编号A61P39/06GK103159621SQ201110423178
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者付玉杰, 祖元刚, 孔羽, 魏作富, 王微, 罗猛 申请人:东北林业大学, 付玉杰