专利名称：唾液酸衍生物在制备peg脂质衍生物修饰制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，具体涉及唾液酸衍生物在制备PEG脂质衍生物修饰制剂中的应用，该制剂能消除或减弱PEG化制剂的加速血液清除现象。
背景技术：
聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)别名聚氧乙烯醇或聚氧乙烯二醇,系环氧乙烷与单乙二醇(或双乙二醇)在碱性催化剂催化之下聚合而成，分子质量因聚合度不同而异,通常在200 35 000之间，其化学通式为HOCH2(CH2 OCH2)n CH20H。聚乙二醇水溶性良好并能与很多有机物组分较好的相容，还具有低毒、对机体无刺激性、免疫原性低的特点，因此在药剂学领域具有广泛的应用。如可以作为溶剂增加药物的溶解度，作为片剂的润滑剂和黏合剂，作为缓控释制剂的骨架材料，作为软膏剂的基质，或是作为蛋白类药物的稳定剂。PEG是经美国食品药品管理局(FDA)批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一，1991年第I种用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG腺苷脱氨酶获得FDA批准上市，用于治疗儿童免疫缺陷症，目前已经有多种PEG修饰蛋白药物上市，如PEG化天冬酰胺酶、PEG化干扰素a-2b和PEG化粒细胞集落刺激因子等(胡永祥，牛津梁，张文博，等.聚乙二醇修饰药物技术的研究进展[J].中国生化药物杂志，2004，25 ￠):369.373)。将聚乙二醇或其衍生物用于药物分子的修饰，可以降低蛋白多肽类药物的免疫原性和抗原性；增加药物的稳定性，降低酶降解作用；延长药物的血浆半衰期，减小血药浓度波动；改善体内药物分布，增强靶向性等。若将聚乙二醇或其衍生物修饰于载体表面也可获得相似的效果。例如，脂质体具有良好的生物相容性，可改变所包封药物的体内分布而提高药物的治疗指数，但普通脂质体进入体内后较易被单核巨噬细胞系统(mononuclearphagocyte system, MPS)摄取,导致其迅速从血液中清除并在MPS相关器官(如肝和脾)蓄积。若将聚乙二醇脂质衍生物修饰于脂质体表面(称为PEG化脂质体)，从而形成“构象云”(conformational clouds)和水化膜,为脂质体提供了较大的空间位阻并掩盖其表面疏水性结合位点，降低MPS对脂质体的识别和摄取，延长其体内循环时间，从而可以更好地借助 EPR (enhanced permeability and retention effect)效应或祀向基团的作用实现脂质体药物的靶向分布，同时也使药物的物理、化学和生物学稳定性得到改善。1995年底，PEG化的阿霉素脂质体Doxif经FDA批准在美国上市用于乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、艾滋病引起的卡波氏肉瘤的治疗。鉴于PEG化载体/药物的独特优势，以及上市产品所带来的可观社会效益和经济效益，世界各国政府都投入大量的人力、财力和 资源，进行诸如PEG化脂质体、PEG化树枝状(dendrimer)给药系统、PEG化纳米粒、PEG化胶束、PEG化药物、PEG化酶等方面的研究，特别是PEG化结合主动靶向配体、基因转染、细胞穿透肽、RNA干扰治疗等21世纪主攻方向的研究。由于大多数PEG化制剂在临床应用上需要多次给药，Dams等(Dams ETM, LavermanP, Oyen WJG, et al.Accelerated blood clearance and altered biodistribution ofrepeated injections of sterically stabilized liposomes [J].J Pharmacol expTher, 2000，292: 1071 - 1079)以"mTc标记脂质体，研究大鼠重复注射PEG化脂质体后的药动学参数和组织分布变化情况，意外的发现第二次注射的脂质体血浆水平表现出极大降低(20分钟时的浓度约为首次注射的10%)，且肝摄取量从8.1±0.8%骤升至46.2±9.8%，此即为加速血液清除(Accelerated Blood Clearance, ABC)现象。目前的研究认为PEG化脂质体引起ABC现象的可能机理如下:首次注射的PEG化脂质体，作为T1-2抗原激活脾脏边缘区特异性B细胞，该B细胞增殖分化为浆细胞后分泌“抗-PEG IgM",此特异性抗体与几天后注射的脂质体表面的PEG结合，随后激活补体系统，通过补体C3片段对PEG化脂质体的调理作用而加快了 MPS对其的摄取，使PEG化脂质体快速从血液中清除(佘振南，翟文君，邓意辉，“加速血液清除”现象中的免疫机制分析[J].沈阳药科大学学报，2011.28(9): 760-768.)。更多的 研究表明，ABC现象并不是PEG化脂质体所专有的，Lu等(LU，W.,WAN, J., SHE, Z., et al., Brain delivery property and accelerated bloodclearance of cationic albumin conjugated pegylated nanoparticle[J].Journalof Controlled Release, 2007, 118(1): 38-53.)的研究发现阳离子牛血清白蛋白修饰的PEG与PLA交联形成的纳米粒(CBSA-NP)在小鼠体内的重复注射时也产生了 ABC现象；KOIDE 等(K0IDE，H., ASAI, T., HATANAKA, K., et al., Particle size-dependenttriggering of accelerated blood clearance phenomenon[J].1nternational Journalof Pharmaceutics, 2008, 362 (1-2): 197-200.)发现 PEG 化的胶束亦能诱导 ABC 现象的产生；我们课题组的研究也证明PEG化的胶束和固体脂质纳米粒对于大鼠和比格犬的重复注射可以产生强烈的ABC现象(国家自然科学基金资助项目81072602)。由此可见，ABC现象是PEG化纳米载体所共有的。虽然目前对ABC现象的研究主要集中于PEG脂质体、PEG纳米粒等PEG化的药物载体,但Cheng等(Cheng, T.L., P.Y.Wu, et al.(1999)."Accelerated clearance of polyethylene glycol-modified proteins byant1-polyethylene glycol IgM, Bioconjug Chem 10(3): 520-528.)发现PEG化蛋白能产生抗PEG抗体，从而导致蛋白药物在体内的存留时间缩短。此现象与ABC现象可能具有接近甚至相同的产生机理，所以ABC现象可能是PEG化载体甚至是PEG化药物存在的共性问题。ABC现象所引发的PEG化制剂药动学特性的改变在其临床应用中是一个不容忽视的问题，会严重影响药物治疗的的安全性、有效性和患者的顺应性。Semple等(SempleSC, Harasym TO, Clow KA, et al.1mmunogenicity and rapid blood clearance ofliposomes containing polyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic acid [J].J Pharmacol Exp Ther, 2005, 312: 1020 - 1026)的研究证明，重复注射包封寡核苷酸(0DN)、pDNA或RNA核酶的PEG化脂质体会诱导强烈的免疫应答，导致制剂血液循环时间缩短和小鼠死亡率显著增加。我们在研究工作中发现，比格犬在重复注射PEG化乳剂、纳米粒和脂质体时，ABC现象的产生往往伴随着严重的过敏现象，如呕吐、腹泻、面部充血水肿和困倦等。为了寻找ABC现象的解决方法，研究者们对ABC现象的产生机制和影响因素做了大量研究。目前认为注射制剂的磷脂剂量、注射间隔、载体表面PEG修饰密度、PEG链长、PEG化载体的粒径、PEG化载体的的荷电情况等均会对ABC现象的产生及强度产生影响(徐缓，王凯乾，黄微崴，et al.,聚乙二醇修饰脂质体的ABC现象研究进展[J].药学学报，2010.45(6): 677-683.)。磷脂的剂量 Ishida等发现PEG化脂质体的首剂量与ABC现象发生的程度存在明显的反相关(Ishida T, Masuda K, Ichikawa T, et al.Accelerated clearance ofa second injection of PEGylated liposomes in mice [J].1nt J Pharm, 2003, 255:167 - 174)。大鼠首次注射PEG化脂质体，磷脂剂量分别为O (HEPES盐缓冲液)、0.001、0.01、0.1、1、5 ymol/kg，5天后注射放射标记的PEG化脂质体(磷脂剂量为5 μ mol/kg),结果表明二次注射PEG化脂质体的血液清除程度与肝聚集量随首剂量的降低而明显增加。当首剂量磷脂高于I μ mol/kg时，二次注射的PEG化脂质体血液清除速度与肝聚集量不再继续增加。而Laverman等的研究与上述Ishida的结果存在一定矛盾:首次注射磷脂剂量分别为0.05,0.5,5.0 μ mol/kg的PEG化脂质体，二次注射PEG化脂质体(磷脂剂量5.0μ mol/kg)时均能产生ABC现象(Laverman P, Carstens MG, Boerman 0C, et al.Factorsaffecting the accelerated blood clearance of polyethylene glycol—liposomes uponrepeated injection [J].J Pharmacol Exp Ther, 2001, 298: 607 - 612)。当固定首次注射剂量为5.0 μ mol磷脂/kg，二次注射的PEG化脂质体剂量为15或50 μ mol磷脂/kg时，产生的ABC现象比5.0 μ mol磷脂/kg组明显减弱。最近文献(Repeated Injection ofHigh Doses of Hemoglobin-Encapsulated Liposomes (Hemoglobin Vesicles) InducesAccelerated Blood Clearance in a Hemorrhagic Shock Rat Model DRUG M ETAB0LISMAND DISPOSITION 2011,39 (3):484 - 489)报道，即使高剂量也会产生ABC现象。PEG-DSPE的浓度目前能够诱导产生ABC现象的PEG化脂质体均以PEG-DSPE为长循环材料，因此有 研究者专门对PEG-DSPE在处方中的比例对ABC现象的影响进行考察。首次注射PEG化脂质体中PEG-DSPE占处方脂质摩尔比分别为0、5、10、15% (磷脂剂量为0.001 μ mol/kg), 5天后注射PEG化脂质体(磷脂剂量为5.0 μ mol/kg, PEG-DSPE在处方中的摩尔比例为5%)，结果发现ABC现象发生的程度与PEG-DSPE的比例存在明显的反相关:含有0% PEG-DSPE的脂质体(即普通脂质体)不产生ABC现象；含有5% PEG-DSPE的脂质体可以诱导产生明显的ABC现象，且伴随肝聚集量显著增加。进一步增加PEG-DSPE的含量(10、15%)，与5%组相比，二次注射脂质体的清除速率与肝聚集呈现降低趋势，但仍显著高于对照组(P〈0.01) (Ishida T, Harada M, Wang XY, et al.Accelerated blood clearanceof PEGylated liposomes following preceding liposome injection: Effects of lipiddose and PEG surface-density and chain length of the first-dose liposomes [J].J Control Release, 2005, 105: 305 - 317)。Ishida 等也发现增加 PEG-DSPE 的比例能减弱PEG化脂质体对ABC现象的诱导。与首次剂量中PEG-DSPE含量低(小于5 mol%)的脂质体相比，若首次注射脂质体中PEG-DSPE含量高(大于10 mol%)，则其后注射的PEG化脂质体的肝脏蓄积量减少(Ishida T, Ichikawa T, Ichihara M, et al.Effect of thephysicochemical properties of initially injected liposomes on the clearance ofsubsequently injected PEGylated liposomes in mice [J].J Control Release, 2004,95: 403 - 412)。PEG的分子量有研究表明，首次注射摩尔比均为5%的PEG2000-DSPE和PEG5000-DSPE修饰脂质体(0.001 μ mol磷脂/kg)，5天后注射PEG2000-DSPE修饰的标记脂质体(5 μ mol磷脂/kg)，均产生明显的ABC现象(未考察二次注射PEG5000-DSPE修饰脂质体)(Ishida T, Maeda R, Ichihara M, et al.Accelerated clearance of PEGylatedliposomes in rats after repeated injections [J].J Control Release, 2003, 88:35 - 42)，因此认为PEG的分子量对诱导ABC现象没有影响。Ishida等的结论恰恰相反:首次注射PEG5000-DSPE修饰脂质体诱导ABC现象的程度远远低于首次注射PEG2000-DSPE修饰脂质体，PEG5000-DSPE和PEG2000-DSPE修饰脂质体组的肝聚集量分别为35.3±3.8%和78.7±8.8%，表明首次注射脂质体中PEG分子量的增加可以减弱ABC现象。粒径 Dams等的研究表明:ABC现象与首次注射PEG化脂质体的粒径、表面性质和放射性标记均无关。未标记的小(85 nm)或大(400 nm)PEG化脂质体均会引起二次注射PEG化脂质体的血液清除速度显著增加，产生明显的ABC现象。注射时间间隔以及连续注射 Dams等发现能够诱导ABC现象的两次注射最小时间间隔为5天；Ishida等证明两次注射间隔为7天时ABC现象最为强烈。另有研究报道，大鼠间隔35天第二次注 射PEG化脂质体后，间隔4天或7天进行第三次注射PEG化脂质体，其血液清除速度虽略有增加，但无显著性差异，而肝脾聚集量没有变化，说明多次重复注射并不能继续引发ABC现象。而每天注射PEG化脂质体直至第四次均未产生ABC现象。不同动物模型已见报道的用于研究ABC现象的动物包括大鼠、小鼠与恒河猴。Dams等的研究表明，大鼠和恒河猴均可以产生ABC现象，小鼠则不能；而Ishida等的结果表明小鼠体内能够产生明显的ABC现象。相关文献及我们的实验表明，通过延长两次注射给药的间隔或者是调整注射剂量可以减轻甚至避免二次注射的PEG化药物发生ABC现象。此外，某些细胞毒类药物装载于PEG化脂质体中时亦能避免ABC现象的产生。但通过这些手段来克服ABC现象将大大限制PEG化修饰技术的应用范围。我们还发现通过可断裂PEG脂质衍生物修饰脂质体或囊泡可以消除或减轻 ABC 现象(Xu H, Wang KQ, Deng YH, et al.Effects of cleavablePEG-cholesteroI derivatives on the accelerated blood clearance of PEGylatedliposomes.Biomaterials, 2010; 31 (17): 4757-63.)，但可断裂 PEG 脂质衍生物对于延长脂质体的血液循环时间效果不大。可以说，现在并未寻找到解决PEG化载体/药物ABC现象的理想手段。本发明中所述的唾液酸(Sialic acid, SA)，学名叫作“N-乙酰基神经氨酸”，又称糖酸，是一类九碳单糖，同时也是所有神经氨酸或酮基-脱氧壬酮糖酸(KDN)的N-或O-衍生物的总称，唾液酸的分子通式为:
权利要求
1.唾液酸衍生物在制备PEG脂质衍生物修饰制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的唾液酸衍生物的结构如式(I)所示:
3.根据权利要求1的应用，式(I)化合物是GMpGM2、GM3> GM4或GM5。
4.根据权利要求1的应用，式(I)化合物是^iGM1'epiGM2, epiGM3> epiGM4或印iGM5。
5.根据权利要求1的应用，其中式(I)化合物中R1是-OCH2CHOH,其中与羟基相连的碳跟7号碳相连；R2是N -乙酰基、N -羟乙酰基；R3是H ;R4是H ；R5是单糖、二糖、低聚糖或多糖单元、糖脂、脂类；其中2号碳上的糖苷键或是酮苷键为α构型；η为f 100间的一个整数。
6.根据权利要求1的应用，其中式(I)化合物中R1是-OCHCH2OH,其中与醚键相连的碳与7号碳相连；R2是N -乙酰基、N -羟乙酰基；R3是H ;R4是H ；R5是单糖、二糖、低聚糖或多糖单元、糖脂、脂类；其中2号碳上的糖苷键或是酮苷键为α构型；η为f 100间的一个整数。
7.根据权利要求1的应用，其中的PEG脂质衍生物修饰制剂是PEG化乳剂，PEG化微乳，PEG化脂质体，PEG化固体脂质纳米粒，PEG化纳米结构载体，PEG化胶束或PEG化囊泡。
全文摘要
本发明属于药物制剂领域，具体涉及使用唾液酸衍生物消除或减弱PEG化制剂的加速血液清除现象。PEG化脂质体、PEG化乳剂、PEG化纳米粒等PEG化制剂在重复注射时，二次注射制剂从血液中的清除速度会大大加快，即ABC现象。将唾液酸衍生物修饰于PEG化制剂表面后可以消除甚至减弱ABC现象。
文档编号A61K9/127GK103157112SQ20111042603
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者邓意辉, 佘振南, 王龙, 严米娜, 王春玲, 赵永雪 申请人:沈阳药科大学