专利名称：一种消除或减弱加速血液清除现象产生的方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种消除或减弱加速血液清除现象产生的方法，具体涉及一种通过改变给药间隔来消除或减弱加速血液清除现象。
背景技术：
活性化合物的体内药动学行为对其治疗效果有决定性影响，一些在体外实验中显示出优秀药理活性的候选化合物正是由于其体内药动学性质的不理想而被中止开发。所以将活性化合物载体化，从而改善其体内药动学参数的策略在药物制剂的开发过程中得到了广泛而深入的应用。其中，使用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对活性化合物进行修饰(又称为药物分子的PEG化)或将活性分子载入聚乙二醇化载体(又称为PEG化载体)是最为常用的手段，并获得了一些非常成功的案例。例如，将血液中消除极快的蛋白多肽(如腺苷脱氨酶、天冬酰胺酶、干扰素a-2b或粒细胞集落刺激因子等)进行PEG修饰后，其血液循环半衰期显著延长，可以在降低给药频率的同时保证疗效(胡永祥，牛津梁，张文博，等.聚乙二醇修饰药物技术的研究进展[J].中国生化药物杂志，2004，25 ￠):369.373);将血液中代谢较快且具有严重心脏毒性的阿霉素装载于PEG化脂质体中(Doxil )，不仅大大降低了其心脏毒性，而且其疗效得到显著提升。鉴于PEG化载体/药物的独特优势，被FDA认可的静脉注射安全性，以及上市产品所带来的可观社会效益和经济效益，世界各国政府都投入大量的人力、财力和资源，进行诸如PEG化脂质体、PEG化树枝状(dendrimer)给药系统、PEG化纳米粒、PEG化胶束、PEG化药物、PEG化酶等方面的研究，特别是PEG化结合主动靶向配体、基因转染、细胞穿透肽、RNA干扰治疗等21世纪主攻方向的研究。但是自 2000年以来，PEG化制剂给药的安全性和治疗的有效性受到了挑战。鉴于大多数PEG化制剂在临床应用上需要多次给药，Dams等(Dams ETM, Laverman P, OyenWJGj et al.Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeatedinjections of sterically stabilized liposomes [J].J Pharmacol exp Therj 2000，292: 1071 - 1079)以99mTc标记脂质体，研究大鼠重复注射PEG化脂质体后的药动学参数和组织分布变化情况，意外的发现第二次注射的脂质体血浆水平出现极大降低(20分钟时的浓度约为首次注射的10%)，且肝摄取量从8.1±0.8%骤升至46.2±9.8%，即为加速血液清除(Accelerated Blood Clearance, ABC)现象。目前研究者对ABC现象的机制还不十分明确，其可能的机理是:首次注射的PEG化脂质体，作为抗原激活脾脏B细胞，该B细胞增殖分化为浆细胞后分泌相应抗体，此抗体与之后注射的脂质体表面的PEG结合，随后激活补体系统，通过补体C3片段对PEG化脂质体的调理作用而加快单核巨噬细胞系统对其的摄取，导致PEG化脂质体快速从血液中清除(佘振南，翟文君，邓意辉，“加速血液清除”现象中的免疫机制分析[J].沈阳药科大学学报，2011.28(9): 760-768.)。更多的研究表明，ABC现象并不是PEG化脂质体所专有的，Lu等(LU，W.,WAN, J., SHE, Z., et al., Brain delivery property and accelerated bloodclearance of cationic albumin conjugated pegylated nanoparticle[J].Journalof Controlled Release, 2007, 118(1): 38-53.)的研究发现阳离子牛血清白蛋白修饰的PEG与PLA交联形成的纳米粒(CBSA-NP)在小鼠体内的重复注射时也产生了 ABC现象；KOIDE 等(K0IDE, H., ASAI, T., HATANAKA, K., et al., Particle size-dependenttriggering of accelerated blood clearance phenomenon[J].1nternational Journalof Pharmaceutics, 2008, 362(1-2): 197-200.)发现 PEG 化的胶束亦能诱导 ABC 现象的产生；我们课题组的研究表明PEG化的乳剂和固体脂质纳米粒对于小鼠、大鼠或比格犬的重复注射均可以产生强烈的ABC现象(国家自然科学基金资助项目81072602)。一些研究甚至证明PEG化蛋白也能诱导机体产生抗PEG抗体，从而导致蛋白药物从血液中快速清除(Cheng, T.L., P.Y.ffu, et al.(1999)."Accelerated clearance of polyethyleneglycol-modified proteins by ant1-polyethylene glycol IgM.〃 Bioconjug Chem10(3): 520-528.)，这可以被认为是PEG化蛋白药物的ABC现象。所以，我们认为ABC现象是PEG化制剂(即PEG化药物载体和PEG化药物)存在的共性问题。ABC现象所引发的PEG化制剂药动学特性的改变在其临床应用中是一个不容忽视的问题，会严重影响药物治疗的的安全性、有效性和患者的顺应性。Semple等(SempleSC, Harasym TO, Clow KA, et al.1mmunogenicity and rapid blood clearance ofliposomes containing polyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic acid [J].J Pharmacol Exp Ther, 2005, 312: 1020 - 1026)的研究证明，重复注射包封寡核苷酸(0DN)、pDNA或RNA核酶的PEG化脂质体会诱导强烈的免疫应答，导致制剂血液循环时间缩短和小鼠死亡率的显著增加。我们在研究工作中发现，比格犬在重复注射PEG化乳剂、PEG化纳米粒和PEG化脂质体时，ABC现象的产生往往伴随着严重的类似过敏的反应，如困倦、呕吐、腹泻、面部严重水肿等，某些反应严重的比格犬甚至因此死亡。现有文献已证明小鼠、大鼠、家兔、比格犬、恒河猴等试验动物均会在重复注射PEG化制剂时产生ABC现象，由此推知，人类在重复注射PEG化制剂时亦能产生ABC现象，所引起的相应后果。在寻找ABC现象解决方法的过程中，研究者们发现PEG化制剂的注射剂量、PEG修饰密度、PEG分子量、制剂粒径等因素均可以影响ABC现象的产生及强弱程度。注射剂量Ishida等发现PEG化脂质体的首剂量与ABC现象发生的程度存在明显的反相关(Ishida T, Masuda K, Ichikawa T, et al.Accelerated clearance of asecond injection of PEGylated liposomes in mice [J].1nt J Pharm, 2003, 255:167 - 174)。大鼠首次注射PEG化脂质体，磷脂剂量分别为O (HEPES盐缓冲液)、0.001、0.01、0.1、1、5 μ mol/kg，5天后注射放射标记的PEG化脂质体(磷脂剂量为5 μ mol/kg),结果表明二次注射PEG化脂质体的血液清除程度与肝聚集量随首剂量的降低而明显增加。当首剂量磷脂高于I μ mol/kg时，二次注射的PEG化脂质体血液清除速度与肝聚集量不再继续增加。而Laverman等的研究与上述Ishida的结果存在一定矛盾:首次注射磷脂剂量分别为0.05,0.5,5.0 μ mol/kg的PEG化脂质体，二次注射PEG化脂质体(磷脂剂量5.0μ mol/kg)时均能产生ABC现象(Laverman P, Carstens MG, Boerman 0C, et al.Factorsaffecting the accelerated blood clearance of polyethylene glycol—liposomes uponrepeated injection [J].J Pharmacol Exp Ther, 2001, 298: 607 - 612)。当固定首次注射剂量为5.0 μ mo I磷脂/k g，二次注射的PEG化脂质体剂量为15或50 μ mo I磷脂/kg时，产生的ABC现象比5.0 μ mol磷脂/kg组明显减弱。最近文献(Repeated Injection ofHigh Doses of Hemoglobin-Encapsulated Liposomes (Hemoglobin Vesicles) InducesAccelerated Blood Clearance in a Hemorrhagic Shock Rat Model DRUG M ETABOLISMAND DISPOSITION 2011,39 (3):484 - 489)报道，即使高剂量也会产生ABC现象。PEG修饰密度目前能够诱导产生ABC现象的PEG化脂质体均以PEG-DSPE为长循环材料，因此有研究者专门对PEG-DSPE在处方中的比例对ABC现象的影响进行考察。首次注射PEG化脂质体中PEG-DSPE占处方脂质摩尔比分别为0、5、10、15% (磷脂剂量为0.001μ mol/kg)，5天后注射PEG化脂质体(磷脂剂量为5.0 μ mol/kg, PEG-DSPE在处方中的摩尔比例为5%)，结果发现ABC现象发生的程度与PEG-DSPE的比例存在明显的反相关:含有0% PEG-DSPE的脂质体(即普通脂质体)不产生ABC现象；含有5% PEG-DSPE的脂质体可以诱导产生明显的ABC现象，且伴随肝聚集量显著增加。进一步增加PEG-DSPE的含量(10、15%)，与5%组相比，二次注射脂质体的清除速率与肝聚集呈现降低趋势，但仍显著高于对照组(P〈0.01) (Ishida T, Harada M, Wang XY, et al.Accelerated blood clearanceof PEGylated liposomes following preceding liposome injection: Effects of lipiddose and PEG surface-density and chain length of the first-dose liposomes [J].J Control Release , 2005, 105: 305 - 317)。Ishida 等也发现增加 PEG-DSPE 的比例能减弱PEG化脂质体对ABC现象的诱导。与首次剂量中PEG-DSPE含量低(小于5 mol%)的脂质体相比，若首次注射脂质体中PEG-DSPE含量高(大于10 mol%),则其后注射的PEG化脂质体的肝脏蓄积量减少(Ishida T, Ichikawa T, Ichihara M, et al.Effect of thephysicochemical properties of initially injected liposomes on the clearance ofsubsequently injected PEGylated liposomes in mice [J].J Control Release, 2004,95: 403 - 412)。PEG的分子量有研究表明，首次注射摩尔比均为5%的PEG2000-DSPE和PEG5000-DSPE修饰脂质体(0.001 μ mol磷脂/kg)，5天后注射PEG2000-DSPE修饰的标记脂质体(5 μ mol磷脂/kg)，均产生明显的ABC现象(未考察二次注射PEG5000-DSPE修饰脂质体)(Ishida T, Maeda R, Ichihara M, et al.Accelerated clearance of PEGylatedliposomes in rats after repeated injections [J].J Control Release, 2003, 88:35 - 42)，因此认为PEG的分子量对诱导ABC现象没有影响。Ishida等的结论恰恰相反:首次注射PEG5000-DSPE修饰脂质体诱导ABC现象的程度远远低于首次注射PEG2000-DSPE修饰脂质体，PEG5000-DSPE和PEG2000-DSPE修饰脂质体组的肝聚集量分别为35.3±3.8%和78.7±8.8%，表明首次注射脂质体中PEG分子量的增加可以在一定程度上减弱ABC现象。PEG化制剂粒径Dams等的研究表明:ABC现象与首次注射PEG化脂质体的粒径、表面性质和放射性标记均无关。未标记的小(85 nm)或大(400 nm)PEG化脂质体均会引起二次注射PEG化脂质体的血液清除速度显著增加，产生明显的ABC现象。注射间隔Dams等发现能够诱导ABC现象的两次注射最小时间间隔为5天；Ishida等证明两次注射间隔为7天时ABC现象最为强烈。从上述影响ABC现象各因素的分析可知:对于PEG化载体，通过调节其注射剂量、粒径或所修饰PEG的分子量等因素难以避免ABC现象的产生；而降低PEG修饰密度虽然可以消弱ABC现象的强度甚至避免其产生，但PEG化制剂的长循环优势亦随之丧失；当给药间隔小于5天或更少时虽然可以减弱或消除ABC现象的产生，但是PEG化制剂的优势正在于延长了活性物质的血液循环半衰期，降低给药频率，某些PEG化制剂的循环半衰期甚至超过100小时，所以将给药间隔缩短至5天以内并非理想选择，即使在较短给药间隔的情况下，多次给药也会产生ABC现象；我们课题组的研究发现，通过可断裂PEG脂质衍生物修饰脂质体或囊泡可以消除或减轻ABC现象(Xu H, Wang KQ, Deng YH, et al.Effectsof cleavable PEG-cholesteroI derivatives on the accelerated blood clearance ofPEGylated liposomes.Biomaterials, 2010; 31 (17):4757-63.),但可断裂 PEG 脂质衍生物对于延长脂质体、囊泡或乳剂等制剂的血液循环时间效果不大。Judge等(JUDGE, A.，MCCLINT0CK, K., PHELPS, J.R., et al., Hypersensitivity and loss of disease sitetargeting caused by antibody responses to PEGylated liposomes[J].Mol Ther,2006，13(2): 328-337.)使用烷基链长度不同的PEG脂质衍生物对脂质体进行修饰，其诱导ABC现象的能力随烷基链的缩短而降低，但烷基链较短的PEG脂质衍生物易从所修饰的脂质体或乳剂等表面脱落，因此也不能使相应的PEG化制剂获得理想的血液循环效果。虽然Doxif在临床使用中并未观察到典型的ABC现象，这可能是由于其中的药物具有较强的免疫系统毒性而在一定程度上抑制了免疫反应，或是由于注射剂量较大因而ABC现象较弱，但是Doxi Γ在静脉注射给药时仍然会发生过敏反应(HSRs )，其与ABC现象可能有关(另外，我们在进行低剂量重复注射研究中发现，Doxif也存在ABC现象)。而随着越来越多的PEG化制剂逐渐步入临床研究环节，它们在临床试验或上市后使用中所潜伏的与ABC现象相关的严重问题和风险也将日益凸显，所以急需一种解决ABC现象的切实可行的方法。
发明内容
由于ABC现象的发生会对实验对象产生伤害甚至引起死亡，所以我们使用药动学特征与人类相似的比格犬作为模型动物`，寻找解决ABC现象的方法，所得实验结果可以在很大程度上用于指导人用PEG化制剂的开发。我们在对实验动物重复注射PEG化制剂后ABC现象的产生情况进行深入研究后惊人地发现，对于PEG化乳剂、PEG化固体脂质纳米粒、PEG化脂质体和PEG化囊泡等PEG化载体，通过对注射间隔进行巧妙地选择，可以减弱甚至完全消除ABC现象对二次注射PEG化制剂药动学的影响。我们提出的注射方案可以保证二次，或之后的第三次、第四次注射的PEG化制剂不会从血液中快速清除，从而借助其长循环作用实现药物的治疗效果。要实现本发明所述的减弱或者消除PEG化制剂的加速血液清除现象，须采用如下的技术方案:
一种消除或减弱加速血液清除现象产生的方法，即PEG化制剂的注射间隔不小于30天。本发明所述注射间隔可以选择不小于60天。本发明所述注射间隔可以选择不小于90天。作为优选，所述注射间隔不小于60天或不小于90天；作为更优选，所述注射间隔不小于90天。
本发明所述的在PEG化制剂的注射方式，指通过静脉注射或是静脉滴注的方式给予用药对象，也可利用其它注射类型，如皮下注射、肌肉注射和硬膜外注射等；或者是利用已知多种类型的注射给药设备，例如使用可植入泵或非植入的可便携或非便携型的注射泵。注射方式可以是连续输注、间歇输注或脉冲输注。注射速度可以不同，就如临床上静脉注射和静脉滴注的区别。本发明中所述聚乙二醇化制剂(PEG化制剂)是PEG化乳剂、PEG化脂质体、PEG化固体脂质纳米粒、PEG化胶束、PEG化囊泡、PEG化微乳、PEG化纳米粒、PEG化纳米结构载体或PEG化蛋白。如公知的，PEG化制剂，特别是其中的是PEG化乳剂、PEG化脂质体、PEG化固体脂质纳米粒、PEG化胶束、PEG化囊泡、PEG化纳米粒、PEG化微乳或PEG化纳米结构载体是采用聚乙二醇脂质衍生物(PEG脂质衍生物)所修饰的，PEG脂质衍生物中PEG与脂质链段通过酯键或酰胺键或者醚键相连。 聚乙二醇脂质衍生物例如:聚乙二醇-留醇类衍生物如聚乙二醇-胆固醇、聚乙二醇-胆固醇琥珀酸酯(PEG-CHEMS)、聚乙二醇-胆固醇碳酸甲酯等，聚乙二醇-磷脂类衍生物如聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)、聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺等；聚乙二醇-二酸甘油酯或单酯如聚乙二醇-二硬脂酰甘油、聚乙二醇-二棕榈酰甘油、聚乙二醇-二肉豆蘧酰甘油等;聚乙二醇-脂肪酸或脂肪酸酯衍生物等如聚乙二醇-硬脂酸、聚乙二醇-棕榈酸、吐温、苄泽、卖泽、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)等。PEG衍生物还可以是Diacylglycerol-PEG(公司名称NOF America Corporation),其结构式如下:
权利要求
1.一种消除或减弱加速血液清除现象产生的方法，即聚乙二醇化制剂的注射间隔不小于30天。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述注射间隔为不小于60天。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述注射间隔为不小于90天。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述注射包括静脉注射、皮下注射或肌肉注射。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述聚乙二醇化制剂是聚乙二醇化乳剂、聚乙二醇化脂质体、聚乙二醇化固体脂质纳米粒、聚乙二醇化胶束、聚乙二醇化囊泡、聚乙二醇化微乳、聚乙二醇化纳米粒、聚乙二醇化纳米结构载体或聚乙二醇化蛋白。
6.根据权利要求 1的方法，其特征在于，所述聚乙二醇化制剂为临床上的预防、诊断或治疗制剂。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了一种可以消除或减弱加速血液清除现象产生的方法，通过合理选择PEG化制剂的注射间隔可以消除或避免加速血液清除现象的产生。所述PEG化制剂的注射间隔不小于30天，优选不小于90天，所述聚乙二醇化制剂为临床上的预防、诊断或治疗制剂。按照本发明所述方法进行PEG化制剂的注射给药，可以减轻或完全消除加速血液清除现象，从而避免可能发生的严重的器官毒性反应或类似过敏反应，并能保证PEG化制剂的药效。
文档编号A61K47/34GK103169981SQ20111043132
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者邓意辉, 佘振南, 王龙, 严米娜, 王春玲, 赵永雪 申请人:沈阳药科大学