专利名称：用于吸引并保持再生和修复细胞的生物基质的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及包含纤维蛋白生物基质或纤维蛋白凝块和细胞因子的药物组合物，以及在体内将所述组合物递送至疾病或损伤部位以吸引并保持再生和或修复干细胞和骨髓细胞及其分化子代的方法。·
背景技术：
有再生能力的干细胞具有通过在体内再生或修复组织来治疗人疾病的巨大潜力。多年来，已使用成体干细胞来治疗辐射或化疗之后的骨髓衰竭，以及许多先天性造血病状。通常，骨髓移植物是自体的(使用患者自己的干细胞)或同种异体的(使用兄弟姐妹或近亲的干细胞)。在某些生理或实验条件下，可诱导干细胞成为具有特化功能的细胞，例如血细胞或有节奏地跳动的心肌细胞；因此使它们适用于治疗人心脏病。使用从粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的外周血中收集的分离的CD34+干细胞(⑶34是细胞表面糖蛋白)来治疗缺血性心脏病的临床试验目前正在进行中(Losordo等，Circulation 115:3165-72,2007)。使用抗体选择技术(Isolex 300i, Baxter HealthcareCorp.，Deerfield, IL)从患者血液中收获表达⑶34+的细胞。然后将⑶34+细胞储存一段时间并且使用导管装置将其注射到缺血性心肌区域中。在不同的局部缺血的动物模型中进行的临床前实验已证明这些细胞在治疗缺血性疾病，特别是由冠心病和外周血管疾病诱导的局部缺血中具有临床效用(Taylor 等，DiabetesObes. Metab. 10 (SuppI. 4) :5_15，2008 ；和 Li 等，Thromb. Haemost. 95 :301-11，2006)。用于治疗疾病的细胞疗法在技术上和商业上都具有挑战性。首先，必须离体收集临床上有效用于治疗的足够数量的细胞。通常，这涉及收集自体细胞，然后将其重新注射回受者患者中。在这个过程期间，细胞必须维持于活的状态下一段时间，保持其再生潜力，并且不能在储存期间经历将引起患者不良反应的变化。另外，必须在体内使用导管或其它递送装置将细胞物理地递送至疾病或损伤部位。此外，在各个部位处的细胞收集需要部位特异性调节程序，其对这一方法的商业可行性产生不利影响。⑶34+细胞是主要由未成熟的骨髓细胞但还由一些未成熟的B细胞组成的异质群体。累积的证据表明CD34+细胞可能不充当治疗缺血性疾病的干细胞。例如，现已明确CD34+细胞不替换受损的肌肉细胞，并且它们也不直接并入新生血管中。相反，CD34+细胞以旁分泌方式起作用以通过释放可溶性促血管生成因子来刺激血管生成(angiogenesis)或增强血管形成(vascularization) (Hofmann 等，Circulation 111: 2198-2202, 2005)0纯化的⑶34+细胞主要呈现胚细胞表型(90%)。大约33%的⑶34+细胞共表达标记⑶45和Cdllb。当在体外培养时，这些⑶34+细胞丧失表达⑶34+标记的能力，并且随着时间增加CD45和CDllb的表达。与细胞表面标记表达的这一变化一致，较不成熟的胚细胞表型变化为分化程度较高的骨髓细胞类型，例如，髓细胞和前髓细胞。使用检查这些细胞支持内皮管(其为血管生成的前体)形成的能力的体外测定时，两种骨髓群体都表现出促血管生成活性。这些实验表明⑶34+整联蛋白的表达并非细胞具有促血管生成能力的必要要求。
已使用基因方法在小鼠中仔细检查血管的重新生成。具体来说，实验已表明新血管形成的一个重要组成部分是募集循环骨髓衍生的单核细胞，其共表达⑶45和Cdllb标记。这些实验还表明基质细胞衍生因子-I (SDF-I)在新血管形成部位处的局部表达对于将这些修复细胞保持于新生血管附近以及支持新血管形成是必不可少的。所述细胞可从生长血管的部位回收，并且已被证明可在体外通过分泌促血管生成的可溶性因子来刺激血管生成(Celll24:175-89，2006)。在本领域中存在对于刺激新血管形成的新型组合物和方法的需求。本文描述包含纤维蛋白凝块和SDF-I的组合物，以及使用所述组合物在体内将内源性修复骨髓细胞及其分化子代募集至特定部位的修复细胞治疗方法。以下公开描述此种组合物和方法的细节。发明概述本发明解决本领域中有关以下的一种或多种需求包含纤维蛋白凝块和细胞因子 或细胞因子组合的药物组合物、制备所述组合物的方法，以及在体内将所述组合物递送至疾病或损伤部位以吸引并保持修复骨髓细胞及其分化子代的方法。在具体方面，细胞因子是SDF-I。在其它方面，细胞因子是干细胞因子(SCF)。在进一步方面，所述凝块包含SDF-I和SCF的组合。在一个实施方案中，本发明包括包含纤维蛋白凝块和细胞因子或细胞因子组合的组合物。在一些方面，细胞因子选自由以下组成的组基质衍生因子-I (SDF-I)和干细胞因子(SCF)。在一方面，细胞因子是SDF-1。在其它方面，细胞因子是SCF。在进一步方面，细胞因子组合包含基质衍生因子-I (SDF-I)和干细胞因子(SCF)。在一些方面，纤维蛋白凝块包含任何基于纤维蛋白的止血剂或密封剂。在具体方面，纤维蛋白凝块是Tisseel 或Tisseel VHSD或Floseal ·=在一些方面，纤维蛋白凝块包含最终浓度为约lmg/ml至约100mg/ml的纤维蛋白原和最终浓度为约O. 5IU/ml至约250IU/ml的凝血酶。在其它方面，纤维蛋白凝块包含最终浓度为约10mg/ml的纤维蛋白原和最终浓度为约2IU/ml的凝血酶。在进一步方面，本发明组合物进一步包含磷酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲盐水溶液。在一些方面，所述组合物包含最终浓度为约I. Ong/ml至约50，000ng/ml的SDF-I。在其它方面，所述组合物包含最终浓度为约10ng/ml至约5，000ng/ml的SDF-I。在一些方面，所述组合物包含最终浓度为约I. 0ng/ml至约50，000ng/ml的SCF。在其它方面，所述组合物包含最终浓度为约 10ng/ml 至约 5，000ng/ml 的 SCF。在另一个实施方案中，本发明包括制备包含纤维蛋白凝块和细胞因子或细胞因子组合的组合物的方法。在某些方面，此类方法包括以下步骤将细胞因子或细胞因子组合与凝血酶混合，以及将所述细胞因子或细胞因子组合和凝血酶加入到纤维蛋白原中从而形成纤维蛋白凝块组合物。在一些方面，细胞因子选自由基质衍生因子-I (SDF-I)和干细胞因子(SCF)组成的组。在另一个实施方案中，本发明包括将修复细胞募集并保持于需要它的受试者的局部损伤或疾病部位的方法。此类方法包括将本文所述组合物中的任一种，以对于将修复细胞募集并保持于损伤部位有效的量递送至损伤或疾病部位的步骤。在一些方面，修复细胞是干细胞。在其它方面，修复细胞是骨髓细胞及其分化子代。在具体方面，修复细胞对于⑶34 (⑶34+)、⑶45 (⑶45+)，或⑶IIb (⑶IIb+)呈阳性。在某些方面，修复细胞对于CD34 (CD34+)、CD45 (CD45+)，和 CDllb (CDllb+)中的一种或多种呈阳性。
在另一个实施方案中，本发明包括治疗需要它的受试者的局部损伤或疾病部位的方法。此类方法包括将本文所述组合物中的任一种，以对于治疗损伤或疾病有效的量递送至损伤或疾病部位的步骤。在另一个实施方案中，本发明包括增强需要它的受试者的局部损伤或疾病部位的血管形成，或诱导需要它的受试者的局部损伤或疾病部位的血管发生的方法。此类方法包括将本文所述组合物中的任一种，以对于增强血管形成或诱导血管发生有效的量递送至损伤或疾病部位的步骤。在另一个实施方案中，本发明包括治疗受试者的局部缺血的方法。此类方法包括将本文所述组合物中的任一种，以对于治疗局部缺血有效的量递送至受试者的局部缺血部位的步骤。
在另一个实施方案中，本发明包括用于制备本文所述组合物中的任一种的试剂盒。此类试剂盒包括包含纤维蛋白原的第一小瓶或第一储存容器；包含凝血酶的第二小瓶或第二储存容器；和包含细胞因子或细胞因子组合的第三小瓶或第三储存容器，所述试剂盒任选地含有磷酸盐缓冲液及其使用说明书。在其它实施方案中，本发明包括本文所述组合物在制备药物中的用途。在一些方面，本发明包括本文所述组合物在制备用于募集并保持修复细胞于局部损伤或疾病部位的药物中的用途。在其它方面，本发明包括本文所述组合物在制备用于治疗局部损伤或疾病部位的药物中的用途。在一些方面，本发明包括本文所述组合物在制备用于增强局部损伤或疾病部位的血管形成，或诱导局部损伤或疾病部位的血管发生的药物中的用途。在一些方面，本发明包括本文所述组合物在制备用于治疗局部缺血的药物中的用途。虽然在本发明的各种实施方案中具体描述基于纤维蛋白的生物基质，但是例如胶原、明胶、合成水凝胶等的其它生物基质包括在本发明中。
本发明的其它特征和优势根据以下详述将变得明显。然而，应理解详述和特定实施例虽然指示本发明的具体实施方案，但是它们仅以说明的方式给出，因为本领域技术人员根据此详述可以明了本发明精神和范围内的各种变化和修改。附图
简述图I示出SDFl的两种同种型[SDF-1 α (图Ia)和SDF-1 β (图Ib)]与Tisseel VHSD的纤维蛋白原密封剂组分的结合传感图。图2示出SDF-I α在七天时间内从Tisseel VHSD纤维蛋白凝块中的累积释放。图3a描述Matrigel (BD Biosciences)中新分离的 CD34+骨髓细胞。Matrigel 测定表明在7天时间点，与单独内皮细胞相比，在存在CD34+细胞时内皮细胞管未退化。图3b示出共表达⑶45b和⑶Ilb的骨髓细胞在体外具有促血管生成性。图4a示出CD45+/CDllb+骨髓细胞在体内植入的Tisseel -SDF-1凝块上的募集。与不具有SDF-I的Tisseel 凝块相比，Tisseel -SDF-1凝块上募集了较多数目的共表达⑶45+和⑶Ilb的细胞。图4b示出与对照(PBS)相比，SDF-I增加了肌肉内注射的TisseehS-SDF-'!凝块对EGFP+和CD45+/CDllb+骨髓衍生细胞的体内募集。图4c示出体内干细胞抗原-I (Sca-I) +细胞的募集。在体内植入的Tisseel -SDF-1凝块募集较多数目的表达Scal的细胞，所述Scal为⑶34的鼠科同等物。发明详述
本发明提供可生物降解、生物相容的纤维蛋白生物基质或纤维蛋白凝块，其用于递送包括但不限于SDF-I和/或SCF的各种细胞因子。在某些方面，本发明提供纤维蛋白凝块的各种制剂，其递送细胞因子以募集修复细胞至疾病或损伤部位并且增加所述细胞在所述部位的保持时间。纤维蛋白凝块提供三维基质以递送细胞因子、募集修复细胞并模拟组织或器官中的体内环境。本发明提供纤维蛋白凝块的此类制剂及其使用方法。在详细地解释本发明的任何实施方案之前，应理解本发明的应用不限于在以下描述中阐明或在附图和实施例中示出的构造细节和组分布置。本文所使用的章节标题仅为了组织目的，而不应理解为限制所描述的主题。本申请中引用的所有参考文献都明确地以引用方式并入本文。本发明包括其它实施方案并且可以各种方式实践或实施。还应理解本文所使用的措辞和术语用于描述目的，而不应视为限制。术语“包括”、“包含”或“具有”及其变化形式意欲包括其后列出的项目和其等同物以及额外项目。·定义除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。以下参考文献为技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般定义Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY(第 2 版 1994);THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGYCffalker编，1988);THE GLOSSARY OF GENETICS,第5版，R. Rieger等(编)，Springer Verlag(1991)；以及 Hale 和 Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)。通篇使用以下缩写。EGFP 增强绿色荧光蛋白FACS 荧光激活细胞分选术GM-CSF 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子SDF-I 基质衍生因子-ISDF-I α 基质衍生因子-I αSDF-I β 基质衍生因子-I βHUVEC 人脐静脉内皮细胞IU国际单位kDa千道尔顿μ I 或 μ L 微升ml 或 mL 毫升ng纳克本文中应注意，除非上下文另外明确规定，否则在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代物。术语“纤维蛋白”、“纤维蛋白基质”、“纤维蛋白生物基质”、“纤维蛋白凝块”、“基于纤维蛋白的支架”、“纤维蛋白支架”、“纤维蛋白胶”、“纤维蛋白凝胶”、“纤维蛋白粘附剂”和“纤维蛋白密封剂”在本文中经常可互换使用，并且在本领域中是指包含至少纤维蛋白原组分和凝血酶组分的三维网状物。本发明包括如本文所述包含任何基于纤维蛋白的止血剂或密封剂的纤维蛋白凝块。
术语“细胞因子”是指一组不同的小分泌蛋白质，其在组织再生以及介导和调控免疫、炎症和造血中起关键作用。术语“细胞因子组合”是指本领域中已知的任何两种或更多种细胞因子，包括但不限于基质细胞衍生因子-I (SDF-I)和干细胞因子(SCF)。术语“SDF-1”或“SDF-la ”或“SDF-Ιβ ”是指基质细胞衍生因子-I多肽，其为属于趋化因子家族的小细胞因子。在各种方面，术语“SDF-1”和“SDF-la ”可互换使用。在其它方面，术语“ SDF-I ”和“ SDF-I β ”可互换使用。术语“SCF”是指干细胞因子多肽，其为属于趋化因子家族的细胞因子。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用于指经由肽键连接的氨基酸残基的聚合物。此等术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“蛋白质”通常是指大多肽。术语“肽”通常是指短多肽。合成多肽可例如使用自动化多肽合成器来制备。 特别应理解，本文公开的任何数值范围均包括从下限值至上限值的所有值，S卩，介于所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合都视为明确陈述在本申请中。例如，如果浓度范围被陈述为约1%至50%，则意图例如2%至40%、10%至30%，或1%至3%等的值明确地列举在本说明书中。上面列出的值只是具体意图的值的实例。在各种方面，范围在本文中表达为从“约”或“大约”一个具体数值起和/或至“约”或“大约”另一个具体数值止。当用先行词“约”将数值表达为近似值时，应理解所述范围中包括一些变化量。如本文所使用的多肽的“片段”是指小于全长多肽或蛋白质表达产物的多肽的任何部分。片段通常是全长多肽的缺失类似物，其中一个或多个氨基酸残基已从全长多肽的氨基末端和/或羧基末端去除。因此，“片段”是下面描述的缺失类似物的子集。本发明包括保持生物活性的多肽片段。例如，本发明包括本文公开的细胞因子的生物活性片段。如本文所使用的“类似物”是指相对于天然存在的分子在结构上大致相似并且具有相同或基本上相同的生物活性的多肽，尽管在某些情况下相似或相同的程度有所不同。类似物与类似物基于涉及以下的一种或多种突变自其衍生的天然存在的多肽相比，在其氨基酸序列的组成上有所不同(i)在多肽(包括如上所述的片段)的一个或多个末端和/或天然存在多肽序列的一个或多个内部区域中去除一个或多个氨基酸残基，( )在多肽的一个或多个末端(通常为“添加”类似物)和/或天然存在多肽序列的一个或多个内部区域(通常为“插入类似物”类似物)中插入或添加一个或多个氨基酸，或者(iii)将天然存在的多肽序列中的一种或多种氨基酸用其它氨基酸置换。基于被替换的氨基酸和进行替换的氨基酸的物理化学或功能相关性，置换为保守的或非保守的。本发明包括本文公开的细胞因子多肽的类似物。“保守修饰的类似物”是包含氨基酸被化学上相似的氨基酸保守置换的多肽。提供功能相似的氨基酸的保守置换表在本领域中是熟知的。以下八个组各自含有互为保守置换的氨基酸I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；5)异亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸⑴；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins (1984))。此类保守修饰的类似物是附加的并且不排除多态变异体、种间同源物和等位基因变异体。“等位基因变异体”通常是指占据同一基因座的基因的两种或更多种多态形式中 的任一种。等位基因变化形式通过突变自然地产生，并且可导致群体内的表型多态性。在某些方面，基因突变是沉默的(所编码的多肽没有变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。“等位基因变异体”也指由等位基因变异体的mRNA转录物衍生的cDNA，以及由其编码的蛋白质。如本文所使用的“变异体”是指多肽、蛋白质或其类似物，其经过修饰从而包含通常并非所述分子一部分的额外化学部分。在各种方面，此类化学部分调节所述分子的溶解性、吸收和/或生物半衰期。在各种其它方面，所述化学部分替代地降低所述分子毒性并且消除或减弱所述分子的任何不希望的副作用等。能够介导此类效应的部分公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980)中。使此类部分与分子偶联的程序在本领域中是熟知的。例如，在一些方面，变异体是具有化学修饰的细胞因子多肽分子，所述化学修饰赋予细胞因子多肽更长的体内半衰期。在一个实施方案中，多肽通过添加本领域中已知的水溶性聚合物来修饰。在相关实施方案中，多肽通过糖基化、聚乙二醇化和/或多唾液酸化来修饰。本发明包括本文公开的细胞因子多肽的变异体。如本文所使用的“可选择标记”是指编码酶或其它蛋白质的基因，所述酶或其它蛋白质赋予所述基因表达于其中的细胞或有机体可鉴定的表型变化，例如对于药物、抗生素或其它药剂的抗性，从而使得所述标记的表达或活性可经过选择以便加以利用(例如而不限于阳性标记，例如neo基因)或加以避免(例如而不限于阴性标记，例如白喉基因)。“异源性可选择标记”是指已插入其通常不存在于其中的动物基因组中的可选择标记基因。可选择标记的实例包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素(neo)、嘌呤霉素(Puro)、白喉毒素、磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、单纯性疱疹病毒I型胸苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶。在本发明的一方面，可选择标记是增强绿色荧光蛋白(EGFP)。EGFP适合作为用于表达研究的对照试齐U，并且在本文中按实施例中所描述的方法使用。本领域普通技术人员将会理解，本领域中已知的任何可选择标记都可用于本文所述的方法。术语“药剂”或“化合物”描述具有影响本发明中的生物参数的能力的任何分子，例如蛋白质或药物。 如本文所使用的“对照”可指活性对照、阳性对照、阴性对照或媒介物对照。如本领域技术人员所理解，对照用于确立实验结果的相关性，并且提供所测试情况的比较。如本文所使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理上可接受的载体”是指一种或多种适合于实现或增强本发明组合物的递送的配制材料。术语“有效量”、“有效的量”和“治疗有效量”各自指用于在受试者中实现如本文所阐明的可观察到变化的包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物的量。例如，在本发明的某些方面，有效量是在体内将干细胞或促血管生成骨髓细胞及其分化子代吸引并保持于纤维蛋白凝块所需的量。待治疗性使用的组合物的“有效量”、“有效的量”和“治疗有效量”将依赖于例如治疗背景和目的。术语“组合”是指本发明的一种或多种多肽或组合物。在一些方面，施用本发明分子的组合从而在损伤或疾病部位提供增加的血管生成或增强的血管形成。给予“受试者”其非植物、非原生生物的常规含义。在大多数方面，受试者是动物。在具体方面，所述动物是哺乳动物。在更具体方面，所述哺乳动物是人。在其它方面，所述哺乳动物是宠物或伴侣动物、驯养的农场动物，或动物园动物。在某些方面，所述哺乳动物是猫、犬、马或牛。纤维蛋白凝块在一些方面，本发明包括通过将纤维蛋白原组分与凝血酶组分混合而形成的纤维 蛋白凝块。纤维蛋白，又称为因子Ia，是参与血液凝结的纤维性非球状蛋白质。更具体地说，纤维蛋白由纤维蛋白原的裂解而产生，所述纤维蛋白原是由肝合成并且存在于血浆中的可溶性血浆糖蛋白。凝血级联中的过程将酶原前凝血酶活化成丝氨酸蛋白酶凝血酶，其负责将纤维蛋白原转化成纤维蛋白。然后，纤维蛋白分子组合从而形成长纤维蛋白丝，所述长纤维蛋白丝将血小板缠住，构成海绵体，其逐渐地形成复合聚合物，所述聚合物收缩从而形成血凝块。此硬化过程由称为纤维蛋白稳定因子或因子XIII的物质来稳定化。纤维蛋白凝块或纤维蛋白基质是尤其响应于损伤而将多种活组织聚拢在一起并且对其提供支持的蛋白质网状物。此纤维蛋白凝块利用凝血级联的最后阶段，在所述阶段中纤维蛋白原分子被凝血酶裂解，转化成纤维蛋白单体并且组装成原纤维，最后形成三维网状物中的纤维。同时，存在于溶液中的因子XIII (FXIII)在钙离子的存在下由凝血酶活化成因子Xllla。聚集的纤维蛋白单体和可能存在的任何剩余纤连蛋白通过形成新的肽键交联从而形成高分子聚合物。通过此交联反应，所形成的凝块的强度得到实质性增加。一般来说，凝块很好地粘附至伤口和组织表面，从而产生粘合和止血作用。(参见美国专利第7，241，603号)。因此，纤维蛋白粘附剂常常用作双组分粘附剂，其包含纤维蛋白原复合物组分以及另外含有钙离子的凝血酶组分。在本发明中，纤维蛋白凝块是包含至少纤维蛋白原组分和凝血酶组分的三维网状物，其可充当随着时间的推移递送细胞因子或细胞因子组合的支架。在一些方面，细胞因子是参与造血和干细胞增殖的任何细胞因子。在一些方面，细胞因子是SDF-I。在其它方面，细胞因子是SCF。在更具体方面，纤维蛋白凝块包含细胞因子组合。在具体方面，本发明包括SDF-I和SCF的组合。此种纤维蛋白基质或纤维蛋白凝块由损伤之后的身体自然地提供，但也可工程化改造为如本文所述的组织替代物从而加速愈合。纤维蛋白凝块由交联纤维蛋白网状物所构成的天然存在的生物材料组成，并且广泛用于生物医学应用中。例如，它用于控制手术出血、加速伤口愈合、封堵中空的身体器官或覆盖由标准缝合产生的孔洞，以及向暴露组织提供缓慢释放地递送的药物如抗生素。此种纤维蛋白凝块可用于修复身体损伤，并且可用于局部缺血部位。在生物医学研究中，纤维蛋白凝块已用于填补骨腔，以及修复神经元、心瓣膜和眼睛表面。纤维蛋白凝块还用于泌尿管、肝、肺、脾、肾和心脏中。在本发明中，纤维蛋白凝块用于身体的任何部位。纤维蛋白密封剂是一种来源于人和动物血液制品的手术组织粘附剂。纤维蛋白密封剂中的成分在应用期间相互作用，从而形成由纤维蛋白组成的稳定凝块。纤维蛋白密封剂用于控制手术出血、加速伤口愈合、封堵中空的身体器官或覆盖由标准缝合产生的孔洞，以及向暴露组织提供缓慢释放地递送的药物如抗生素。截至约2003年，在美国使用的所有纤维蛋白密封剂都是由血浆制备的，所述血浆取自仔细筛选的供者并且经过严格测试从而消除肝炎病毒、HIV-I和细小病毒。截至2003年，在使用中的所有纤维蛋白密封剂都具有两种主要成分，即来源于人或牛(家畜)血液的纯化的纤维蛋白原蛋白质和纯化的凝血酶。许多密封剂具有两种额外成分，即人血液因子 XIII和来源于牛肺的抑肽酶。因子XIII通过在纤维蛋白束之间形成交联来加强血液凝块。抑肽酶抑制分解血液凝块的酶。纤维蛋白密封剂的实例描述于美国专利第5，716，645,5, 962，405和6，579，537号中，并且所述纤维蛋白密封剂的实例可以冻干、冷冻或非冷冻液体形式获得。还设计出缺乏抑肽酶成分的纤维蛋白密封剂(EVICEL, Ethicon, Inc. , New Jersey)。本发明包括所有类型的纤维蛋白密封剂的使用。纤维蛋白密封剂的具体优势在于粘附剂/凝胶并非作为异物保持在其应用部位，而是恰好如在自然伤口愈合过程中被完全再吸收，并且被新形成的组织所替换。例如巨噬细胞和随后成纤维细胞的各种细胞迁移至凝胶中、裂解，并且再吸收凝胶材料并形成新的组织。纤维蛋白密封剂已用于原位形成纤维蛋白凝块或纤维蛋白凝胶，并且这些纤维蛋白凝胶已用于递送细胞和生长因子(Cox等，Tissue Eng. 10:942-954, 2004 ;和Wong等，Thromb. Haemost. 89:573-582, 2003)。在本发明的一些方面，使用作为下一代纤维蛋白密封剂的纤维蛋白密封剂，例如Tisseel (Baxter International Inc.)和Tisseel VaporHeatSolvent Detergent ( Tisseel VHSD) (Baxter International Inc·)。Tisseel VHSD是利用附加的病毒灭活步骤(溶剂/清洁剂[S/D]处理)开发的，从而为目前得到许可的Tisseel 产品提供额外的安全性和便利性。Tisseel VHSD适合用作在涉及心肺分流和脾脏损伤治疗的手术中的止血的辅助剂。在本发明的具体方面，纤维蛋白凝块由Tisseel 或Tisseel VHSD制备。在其它方面，使用例如Floseal (Baxterlnternational Inc.)的纤维蛋白密封剂。Floseal 是在2分钟或更短时间(止血的中值时间)内止住出血的有效止血基质。如上文所讨论，在一方面，纤维蛋白凝块由凝血酶和纤维蛋白原的单独溶液制备。将凝血酶和纤维蛋白原溶液加载至允许它们混合和组合的双管注射器中。当凝血酶和纤维蛋白原溶液组合时，凝块以与在正常血液凝结期间形成凝块的方式相同的方式，通过称为凝血级联的一系列化学反应形成。在级联结束时，凝血酶将纤维蛋白原分子分解为布置成束的纤维蛋白分子，然后所述纤维蛋白分子通过因子XIII交联从而形成使凝块稳定的网格或网样图案。用于制备可用作组织粘附剂的含纤维蛋白原制剂的另外的方法分别包括从冷沉淀物中制备的方法，其任选地具有用乙醇、硫酸铵、聚乙二醇、甘氨酸或丙氨酸进一步洗涤和沉淀的步骤，以及在己知血浆分级方法的范围内的从血浆中制备的方法(参照例如"Methods of plasma protein fractionation^,1980, ed. :Curling, Academic Press,第3-15 页，第 33-36 页和第 57-74 页，或 Blomb ck B.和 M.，"Purification of human andbovine fibrinogen", Arkiv. Kemi. 10, 1959,第 415 页 f.)。在一些方面，纤维蛋白凝块或纤维蛋白密封剂使用患者自身的血衆来产生。例如,CRYOSEAL(Thermogenesis Corp. , RanchoCordova, CA)或VIVOSTAT (Vivolution A/S, Denmark)纤维蛋白密封剂系统使得能够从患者的血浆制备自体纤维蛋白密封剂组分。纤维蛋白密封剂的组分可以冻干、深低温冷冻液体，或液体形式获得。如上所讨论，在各种方面，纤维蛋白凝块包含纤维蛋白原和凝血酶。纤维蛋白原和凝血酶的聚合时间受纤维蛋白原和凝血酶的浓度以及温度的影响。通过扫描电子显微术进行的纤维蛋白凝块表征揭示，在较低的纤维蛋白原浓度下粗纤维构成致密结构，而随着纤维蛋白原浓度的增加，可获得较细的纤维和较紧致的凝胶。在某些方面，通过在制备纤维蛋白凝块中使用的稀释缓冲液来修改纤维蛋白凝块结构。虽然凝血酶浓度影响聚合的程度似乎不如纤维蛋白原那么大，但是在限定的纤维蛋白原浓度下，纤维凝块纤维随着凝血酶浓度增加而逐步地变得更细。在进一步方面，纤维蛋白凝块还包含胶原、纤连蛋白和其它基质蛋白质。在另外的方面，纤维蛋白凝块是可生物吸收和生物相容的。其它生物基质 虽然在本发明的各种实施方案中具体地描述了基于纤维蛋白的生物基质，但是例如胶原、明胶、合成水凝胶等的其它生物基质包括在本发明中。在各种方面，与本文所述的基于纤维蛋白的生物基质一样，这些其它生物基质包含细胞因子或细胞因子组合。在具体方面，这些生物基质包含SDF-I、SCF或SDF-I与SCF的组合。细胞因子本发明包括包含一种或多种细胞因子的组合物和方法。术语“细胞因子”是一组不同的小分泌蛋白质的总名称，所述蛋白质在组织再生以及介导和调控免疫、炎症和造血中起关键作用。虽然“细胞因子”是用于这些较小分泌蛋白质的总名称，但是其它名称包括淋巴因子(由淋巴细胞产生的细胞因子)、单核因子(由单核细胞产生的细胞因子)、趋化因子(具有趋化活性的细胞因子)，和白介素(由一种白细胞产生并且作用于其它白细胞的细胞因子)，并且所有这些名称都被包括以供本发明使用。在具体方面，并且无限制地，细胞因子包括活化素、骨形态形成性蛋白质(BMP)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Flt-3/Flk-2配体、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素样生长因子-I和-2 (IGF-1和IGF-2)、干扰素-Y (IFN-Y )、白介素-I至-15 (IL-1至IL-15)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子、血小板衍生生长因子-AB(TOGF-AB)、干细胞因子(SCF)、基质细胞衍生因子_1 (SDF-I)、转化生长因子-β 0^1)、肿瘤坏死因子-0 (TNF- α )和血管内皮生长因子(VEGF)。基质衍生因子-I (SDF-I)在一些方面，本发明包括基质细胞衍生因子-I (SDF-I)多肽分子、其片段和类似物，以及包含这些分子的组合物。SDF-I是属于趋化因子家族的小细胞因子，其正式命名为趋化因子(C-X-C基元)配体12(CXCL12)。SDF-I通过对同一基因的选择性剪接而以两种形式产生,所述两种形式为 SDF-1 a /CXCL12a (SDF-1 α )和 SDF-1 β /CXCL12b (SDF-1 β )。在各种方面，使用两种形式，SDF-I α和SDF-I β，并且术语“SDF-1”在本文中可互换使用以指代一种或两种形式。趋化因子由形成两个二硫键的四个保守半胱氨酸的存在来表征。CXCL12蛋白质属于初始半胱氨酸对被一个间插氨基酸分隔的CXC趋化因子组。CXCL12通过经由CXCR4依赖性机制从骨髓中募集内皮祖细胞(EPC)而在血管生成中发挥重要作用。在本发明的某些方面，SDF-I在与凝血酶组分混合之前或在凝块已形成之后添加到纤维蛋白原组分中。含有SDF-I的纤维蛋白凝块随后将SDF-I从凝块中释放至环境中。所释放的SDF-I继而将细胞吸引至应用凝块的部位。纤维蛋白凝块内的相对高局部浓度的SDF-I有助于将细胞保持在凝块附近。在各种方面，这种制剂应用于患者的许多不同部位，例如Tisseel VH S D已经用于许多不同的手术应用中，并在其中表现出广泛的组织粘附性和相容性。干细胞因子(SCF)在一些方面，本发明包括又称为kit-配体、KL或青灰因子的干细胞因子(SCF)，多肽分子，其片段和类似物，以及包含这些分子的组合物。SCF是结合至c-Kit受体(⑶117)的细胞因子。SCF可以可溶性蛋白质形式和跨膜蛋白质形式存在，并且这两种形式都是正常 造血功能所需要的。在各种方面，使用这两种形式的SCF。SCF在造血(血细胞形成)、精子发生和黑素生成中发挥重要作用。在具体方面，SCF在胚胎发育期间的造血中发挥重要作用。例如胎肝和骨髓的造血发生的部位都表达SCF。不受理论约束，SCF可用来将造血干细胞(HSC)引导至其干细胞小生境(干细胞驻留的微环境)，并且SCF在HSC维持中发挥重要作用。在本发明的某些方面，SCF在与凝血酶组分混合之前或在凝块已形成之后添加到纤维蛋白原组分中。含有SCF的纤维蛋白凝块随后将SCF从凝胶中释放至环境中。所释放的SCF继而将细胞吸引至应用凝胶的部位。纤维蛋白凝块内的相对高局部浓度的SCF有助于将细胞保持在凝块附近。在各种方面，这种制剂应用于患者中的许多不同部位，例如Tisseel VHSD已经用于许多不同的手术应用中，并在其中表现出广泛的组织粘附性和相容性。细胞在一些方面，本发明包括使用包含细胞因子的纤维蛋白凝块在体内将修复或再生细胞募集至损伤或疾病部位的方法。在本发明的某些方面，修复细胞是干细胞。干细胞是具有在生命期内使组织再生的潜力的细胞。例如，骨髓(BM)或造血干细胞(HSC)的金标准测试是移植一种细胞并且拯救不具有HSC的个体的能力。在本发明的一些方面，修复细胞是骨髓细胞。骨髓细胞系一开始为在BM中产生的骨髓干细胞。在各种方面，髓性细胞成熟成为数种类型的血细胞，包括巨核细胞、红细胞、巨噬细胞、嗜伊红粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。在进一步方面，本发明包括骨髓细胞的分化子代。骨髓细胞诱导的血管生成在某些方面，本发明包括使用包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物在体内募集骨髓细胞及其分化子代，从而诱导血管发生或增强血管形成的方法。在成体中，血管生成对于伤口修复和炎症，以及对于例如子宫内膜再生的高度特化功能是必不可少的。在过去几年中的一个重要发现是鉴定出不同细胞类型在血管生成中的作用。与内皮细胞(EC)及其BM前体一样，骨髓系的BM衍生细胞异质群体促进血管生成过程。来源于常见BM衍生前体的这些细胞群体一直在外周血中循环，直到被特定化学引诱物募集至组织中。
在各种方面，干细胞被募集至包含细胞因子的纤维蛋白凝块。在一个具体方面，募集表达⑶34的细胞(⑶34+细胞)。⑶34+细胞是主要由未成熟的骨髓细胞但还由一些未成熟的B细胞组成的异质群体。累积的证据表明CD34+细胞可能不充当治疗缺血疾病的干细胞。纯化的⑶34+细胞主要呈现胚细胞表型(90%)。大约33%的⑶34+细胞共表达标记⑶45和Cdllb。因此，在各种方面，募集表达⑶45的细胞(⑶45+细胞)和/或表达⑶Ilb的细胞(CDllb+细胞)。CDllb+细胞是来源于骨髓的骨髓祖细胞，并且参与促进血管生成和淋巴管生成。在本发明的又一个进一步方面，表达⑶34、⑶45和⑶Ilb的一种或多种或组合的细胞被募集至纤维蛋白凝块。术语“增强血管形成”或“诱导血管发生”在本文中用于描述形成血管网状物的方式。血管发生(Vasculogenesis)和血管生成是藉以形成新血管的基本过程。在本领域中，血管发生定义为前体细胞(成血管细胞)分化成内皮细胞以及重新形成原始血管网状物，而血管生成定义为新毛细管从预先存在的血管中生长。毛细管形成或内皮管形成代表特化的 内皮细胞功能，并且是建立连续管腔的先决条件。本发明包括增强血管形成以及诱导或增强血管生成的组合物和方法。已使用基因方法在小鼠中仔细检查血管的重新生成。具体来说，实验已证明新血管形成的一个重要组成部分是募集循环骨髓衍生的单核细胞，其共表达⑶45和Cdllb标记。在其它方面，募集表达干细胞抗原-I (Sca-I)的细胞，所述干细胞抗原_1是⑶34的鼠科同等物。Sca-I是在不成熟的造血祖细胞上表达的鼠科细胞表面抗原，并且与其它标记一起界定造血干细胞。⑶34蛋白质是在早期造血和血管相关组织上显示表达的单通过跨膜(single-pass transmembrane)唾液粘蛋白家族的成员。组合物和方法本发明的方面提供用于再生医学的组合物和方法。在一方面，本发明提供包含生物相容基质或纤维蛋白凝块材料和细胞因子的组合物。在某些方面，细胞因子是SDF-I。在其它方面，细胞因子是SCF。纤维蛋白凝块的组分以合适的浓度添加，从而提供所需类型的控制释放。纤维蛋白原以包括但不限于以下的不同浓度添加约lmg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约 6mg/ml、约 7mg/ml、约 8mg/ml、约 9mg/ml、约 10mg/ml、约 llmg/ml、约 12mg/ml、约13mg/ml、约 14mg/ml、约 15mg/ml、约 16mg/ml、约 17mg/ml、约 18mg/ml、约 19mg/ml、约 20mg/ml、约 2lmg/ml、约 22mg/ml、约 23mg/ml、约 24mg/ml、约 25mg/ml、约 26mg/ml、约 27mg/ml、约28mg/ml、约 29mg/ml、约 30mg/ml、约 3lmg/ml、约 32mg/ml、约 33mg/ml、约 34mg/ml、约 35mg/ml、约 36mg/ml、约 37mg/ml、约 38mg/ml、约 39mg/ml、约 40mg/ml、约 4lmg/ml、约 42mg/ml、约43mg/ml、约 44mg/ml、约 45mg/ml、约 46mg/ml、约 47mg/ml、约 48mg/ml、约 49mg/ml、约 50mg/ml、约 60mg/ml、约 70mg/ml、约 80mg/ml、约 90mg/ml、约 100mg/ml、约 150mg/ml,和多达约200mg/ml (凝胶中的最终浓度)，或在必要时以中间浓度添加。在某些方面，纤维蛋白原以约10mg/ml和约20mg/ml的浓度添加。此外，纤维蛋白原可与任何合适浓度的凝血酶组合。凝血酶以包括但不限于以下的不同浓度添加约 0. liu/ml、约 0. 2IU/ml、约 0. 3IU/ml、约 0. 4IU/ml、约 0. 5IU/ml、约0. 6IU/ml、约 0. 7IU/ml、约 0. 8IU/ml、约 0. 9IU/ml、约 lIU/ml、约 I. lIU/ml、约 I. 2IU/ml、约I. 3IU/ml、约 I. 4IU/ml、约 I. 5IU/ml、约 2IU/ml、约 3IU/ml、约 4IU/ml、约 5IU/ml、约 6IU/ml、约 7IU/ml、约 8IU/ml、约 9IU/ml、约 10IU/ml、约 llIU/ml、约 12IU/ml、约 13IU/ml、约14IU/ml、约 15IU/ml、约 16IU/ml、约 17IU/ml、约 18IU/ml、约 19IU/ml、约 20IU/ml、约 21IU/ml、约 22IU/ml、约 23IU/ml、约 24IU/ml、约 25IU/ml、约 30IU/ml、约 35IU/ml、约 40IU/ml、约 45IU/ml、约 50IU/ml、约 60IU/ml、约 70IU/ml、约 80IU/ml、约 90IU/ml、约 lOOIU/ml、约110IU/ml、约 120IU/ml、约 130IU/ml、约 140IU/ml、约 150IU/ml、约 160IU/ml、约 170IU/ml、约 180IU/ml、约 190IU/ml、约 200IU/ml、约 225IU/ml、约 250IU/ml、约 275IU/ml、约 300IU/ml，或在必要时以中间浓度添加。在某些方面，凝血酶以约2IU/ml和约4IU/ml的浓度添加。在一些方面，本发明组合物包含比率在约O. 001至约100. O范围内的纤维蛋白凝块制剂(凝血酶与纤维蛋白原的比率)。在另一个方面，凝血酶与纤维蛋白原的比率在约O. 01至约10.0范围内。在各种方面，所述比率为约O. 04或约O. 05或约O. 11。本发明包括但不限于以下纤维蛋白原与凝血酶的比率约O. 001、约O. 005、约O. 01、约O. 02、约O. 03、约 O. 04、约 O. 05、约 O. 06、约 O. 07、约 O. 08、约 O. 09、约 O. I、约 O. 2、约 O. 3、约 O. 4、约 O. 5、约 O. 6、约 O. 7、约 O. 8、约 O. 9、约 I. O、约 I. I、约 I. 2、约 I. 3、约 I. 4、约 I. 5、约 I. 6、约 I. 7、约 I. 8、约 I. 9、约 2. O、约 2. I、约 2. 2、约 2. 3、约 2. 4、约 2. 5、约 2. 6、约 2. 7、约 2. 8、约 2. 9、约 3. O、约 3. I、约 3. 2、约 3. 3、约 3. 4、约 3. 5、约 3. 6、约 3. 7、约 3. 8、约 3. 9、约 4. O、约 4. I、约 4. 2、约 4. 3、约 4. 4、约 4. 5、约 4. 6、约 4. 7、约 4. 8、约 4. 9、约 5. O、约 5. I、约 5. 2、约 5. 3、约 5. 4、约 5. 5、约 5. 6、约 5. 7、约 5. 8、约 5. 9、约 6. O、约 6. I、约 6. 2、约 6. 3、约 6. 4、约 6. 5、约 6. 6、约 6. 7、约 6. 8、约 6. 9、约 7. O、约 7. I、约 7. 2、约 7. 3、约 7. 4、约 7. 5、约 7. 6、约 7. 7、约 7. 8、约 7. 9、约 8. O、约 8. I、约 8. 2、约 8. 3、约 8. 4、约 8. 5、约 8. 6、约 8. 7、约 8. 8、约 8. 9、约 9. O、约 9. I、约 9. 2、约 9. 3、约 9. 4、约 9. 5、约 9. 6、约 9. 7、约 9. 8、约 9. 9、约 10、约 15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95，和约100，或在必要时的中间比率。在本发明的具体方面，纤维蛋白凝块包含最终浓度为约lmg/ml至约100mg/ml的纤维蛋白原，和最终浓度为约0. 5IU/ml至约250IU/ml的凝血酶。在本发明的更具体方面， 纤维蛋白凝块制剂(纤维蛋白原(mg/ml)的最终浓度凝血酶的最终浓度(国际单位(IU)或单位(U)/ml)为约 10mg/2U 和约 20mg/4U。在本发明的各种方面，合成聚合物可与纤维蛋白混合从而形成可生物降解的混合凝块或基质。此类合成聚合物包括但不限于聚合物，例如聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯和可降解的聚氨酯，以及不可蚀解的聚合物，例如聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯酯聚合物和其它酰基取代的醋酸纤维素和其衍生物。
在一方面，本发明组合物包含纤维蛋白凝块和细胞因子。在具体方面，本发明组合物包含纤维蛋白凝块和SDF-1。在其它方面，本发明组合物包含纤维蛋白凝块和SCF。在各种方面，本发明组合物包含纤维蛋白凝块、SDF-I和SCF。在另一个方面，本发明提供纤维蛋白凝块在体内的递送，以便将修复细胞募集至手术或损伤部位，或身体中需要组织修复的部位。在一方面，施用包含纤维蛋白凝块和细胞 因子的组合物，其中细胞因子的浓度在每体积(ImL)纤维蛋白凝块约Ing至约50，OOOng的范围内。在另一方面，施用包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物，其中细胞因子的浓度在每ml纤维蛋白凝块约IOng至约5，OOOng的范围内。在各种方面，纤维蛋白凝块中的细胞因子以以下浓度施用约lng/ml、约2ng/ml、约3ng/ml、约4ng/ml、约5ng/ml、约6ng/ml、约7ng/ml、约 8ng/ml、约 9ng/ml、约 10ng/ml、约 20ng/ml、约 30ng/ml、约 40ng/ml、约 50ng/ml、约 60ng/ml、约 70ng/ml、约 80ng/ml、约 90ng/ml、约 100ng/ml、约 120ng/ml、约 140ng/ml、约 160ng/ml、约 180ng/ml、约 200ng/ml、约 300ng/ml、约 400ng/ml、约 500ng/ml、约 600ng/ml、约 700ng/ml、约 800ng/ml、约 900ng/ml、约 1000ng/ml、约 1100ng/ml、约 1200ng/ml、约 1300ng/ml、约 1400ng/ml、约 1500ng/ml、约 1600ng/ml、约 1700ng/ml、约 1800ng/ml、约 1900ng/ml、约 2000ng/ml、约 2500ng/ml、约 3000ng/ml、约 3500ng/ml、约 4000ng/ml、约 4500ng/ml、约 5000ng/ml、约 5500ng/ml、约 6000ng/ml、约 6500ng/ml、约 7000ng/ml、约7500ng/ml、约 8000ng/ml、约 8500ng/ml、约 9000ng/ml、约 9500ng/ml、约 10，000ng/ml、约20，000ng/ml、约 30，000ng/ml、约 40，000ng/ml，和约 50，000ng/ml。在某些方面，细胞因子以多达约10P,ug/ml和约lmg/ml的浓度施用。本领域技术人员将会认识到用于治疗的细胞因子的合适浓度因而部分地根据以下而变化纤维蛋白凝块的体积、纤维蛋白凝块递送到其上的组织部位、使用纤维蛋白凝块所针对的适应症、施用途径，和患者大小(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医师可滴定剂量并且修改所递送的浓·度以获得最佳治疗效果。递送在本发明的方面，所述组合物通过数种方式递送至患者。在一些方面，所述组合物肌肉内、腹膜内、颅内、在例如折断或断裂的骨或软骨的组织成分之间递送。在其它方面，所述组合物通过经由以下途径注射来肠胃外递送静脉内、大脑内(脑实质内)、脑室内、脑脊髓内、眼内、动脉内、关节内、门静脉内、直肠内、鼻内或病灶内途径。另外，所述组合物可通过其它方式引入哺乳动物中用于治疗，所述其它方式例如但不限于瘤内、外用(topical)、结膜下、膀胱内、阴道内、硬膜上、肋内、真皮内、吸入、经皮、经浆膜、颊内、溶解于口腔或其它体腔中、滴注至气道、通过气道吹入、注射到血管、肿瘤、器官等中，以及注射或沉积到哺乳动物体腔内。在具体方面，所述组合物通过手术递送。在另一个方面，所述组合物的递送靶向身体内任何部位。在某些方面，靶标身体部位位于神经、肝、肾、心脏、肺、眼睛、胃肠道器官、皮肤和/或脑中。在一方面，靶标身体部位是局部缺血部位。本发明包括用于将组合物递送至受试者中的许多不同媒介物。在一方面，使用通过针和注射器的直接注射。在某些方面，直接注射包括紧接在向受试者注射之前将纤维蛋白凝块与细胞因子混合在注射器中。在其它方面，本发明包括使用混合室(在注射器与针之间)来增加混合。在各种方面，本发明包括经由注射导管(用于较深的组织递送)、用于表面递送的喷雾剂，或通过植入预先制备的纤维蛋白凝块(皮下或组织床内较深处)来进行纤维蛋白凝块中的细胞因子的递送。在某些情况下，植入可经由注射或经由手术来执行。在需要时，所述组合物通过快速浓注或连续地通过输注，或通过植入装置来施用。替代地或另外地，所述组合物通过植入所述凝块已被吸收或包囊于其上的膜、海绵或另一种合适的材料来局部地施用。在使用植入装置时，在各种方面，将所述装置植入到任何合适的组织或器官中，并且所述组合物的递送可经由扩散、定时释放大丸剂或连续施用来进行。在某些方面，可能期望以离体方式使用或施用组合物。在此种情况下，将已从患者中取出的细胞、组织或器官暴露于所述组合物，然后再将所述细胞、组织和/或器官植入回患者中。在本发明的其它方面，将组合物递送至受试者的另外的方法对于本领域技术人员是明显的，包括持续递送或控制递送制剂形式的涉及纤维蛋白凝块的制剂。配制多种其它持续递送或控制递送装置的技术是本领域技术人员己知的 。在一方面，在受试者中的递送通过用注射器和针注射来进行。在某些方面，递送利用注射器和25号针进行。然而，各种大小的注射器和针也用于递送。在各种方面，所述注射器的大小可在介于O. 5至IOOcc之间的范围内。然而，注射器大小对于本发明而言不受限制。也可使用其它大小的注射器。在进一步方面，所述针的大小可在介于16与30号针之间的范围内。与注射器一样，针的大小对于本发明而言不受限制。在某些方面，使用注射器，通过静脉内输注或通过直接注射给予单次快速浓注。这种施用方式在手术患者(如果合适)中可能是理想的，所述患者例如接受心脏手术如冠状动脉分流移植手术和/或瓣膜置换手术的患者。在这些患者中，可施用纤维蛋白凝块的单次大丸剂输注。(注意施用药物量基于患者体重和状况并且由熟练医师判定)在其它方面，单次注射通过肌肉内给予。在本领域技术人员确定为合适时，可使用更短或更长的施用时间。如果组合物的较长期递送是理想的，则可执行间歇施用。在这些方法中，在本领域技术人员确定为合适时，在施用负荷剂量后，施用(i)第二负荷剂量和维持剂量(或多次维持剂量)，或者施用(ii)维持剂量或多次维持剂量而不施用第二负荷剂量。在各种方面，为了实现组合物在患者中的进一步递送，施用纤维蛋白凝块的维持剂量(或多次维持剂量)。维持剂量可以低于负荷剂量的水平，例如以负荷剂量的约1/6水平来施用。在维持剂量中待施用的具体量可由医学专业人员判定，目标是将包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物至少维持在靶标部位一段时间。当然，在本领域技术人员确定为合适时，维持剂量可在这个时间范围内的任何时点停用。在本发明的其它方面，递送利用导管进行。经由导管的递送可通过使用在本领域中可广泛获得的制品(例如输注泵和管材)来进行。选择用于这些方法中的导管和/或管材时考虑的一个重要标准是，这些制品(或这些制品上的涂层)的材料对于包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物的影响。可用于本发明方法的另外的导管相关制品可通过如下方法来鉴定确定在与药物施用中所使用的条件一致的条件下，制品的材料是否会改变包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物。给药本发明包括各种给药参数的使用。在一方面，细胞因子根据纤维蛋白凝块的毫升数，或根据需要它的受试者体重的公斤数来给药。在各种方面，受试者接受多次剂量或多次治疗操作(instances of treatment)。在某些方面,可向受试者重复给药以便增加或延长效果(未来几周、几个月，或甚至几年)。在给药时，纤维蛋白凝块移置肌肉和/或周围区域中的一定量的体积。因此，监测可被注射的细胞因子/凝块的体积是重要的。在一方面，待根据纤维蛋白凝块递送的细胞因子的最大量由所使用的纤维蛋白凝块组分的体积(大小)，以及治疗面积和受试者的大小决定。在一些方面，较大的受试者耐受较大体积的纤维蛋白凝块，使得增加细胞因子的给药或体积是理想的。本领域技术人员将会认识到用于治疗的合适剂量因而部分地根据以下而变化包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物递送到其上的组织部位、使用组合物所针对的适应症、施用途径，和患者大小(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医师可滴定剂量并且改变施用途径以获得最佳治疗效果。在某些方面，递送多个凝块。在本发明的其它方面，包含细胞因子的纤维蛋白凝块在多个时间点施用。凝块施用频率取决于多种参数。通常，临床医师施用组合物直到达到实现所需效果的剂量为止。因此，所述组合物可以单次剂量施用，或随着时间的推移以两次或更多次剂量(可含有或可不含有相同量的细胞因子)施用。合适剂量的进一步改进由本领域普通技术人员按常规进行，并且在由临床医师或本领域普通技术人员常规执行的任务范围内。合适的剂量可通过使用合适的剂量反应数据 判定。治疗和使用方法在本发明的方面，使用包含细胞因子的纤维蛋白凝块在体内将再生或修复细胞募集至某一部位，以供在由于疾病或包括手术损伤在内的损伤导致组织损坏或损失之后的组织再生或修复用。在某些方面，包含细胞因子的纤维蛋白凝块用于增强血管发生或诱导血管发生。本发明包括将本文所述的组合物用于任何这样的疾病或病状，即，可从施用包含细胞因子的纤维蛋白凝块以增加体内特定部位的血管形成中受益的疾病或病状。例如，由于血流损失所致的局部缺血、裂伤、极端温度、创伤或代谢或遗传性疾病所导致的组织损坏，是可从用纤维蛋白凝块中的细胞因子进行的治疗中受益的许多不同病状或疾病中的一种。其它疾病包括心血管疾病、糖尿病、自身免疫疾病、中风、脑和/或脊髓损伤、烧伤、骨缺损、肾缺血和黄斑变性。在另一方面，本发明组合物用于治疗缺血性或硬变性肝。在各种方面，本发明包括包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗局部损伤或疾病部位、增强局部部位的血管形成或治疗局部缺血。在某些方面，本发明组合物用于增强移植器官或组织的血管形成。移植的器官包括但不限于心脏、肾、肝、肺、胰脏、肠和皮肤。组织包括但不限于骨、肌腱、角膜、心瓣膜、静脉和臂。试剂盒另一个方面，本发明包括用于制备包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物，并将其施用至需要它的受试者的试剂盒。包含纤维蛋白凝块和细胞因子的组合物可有利地以试剂盒形式提供，所述试剂盒包含单独封装的量的纤维蛋白密封剂和凝血酶的。在另一方面，试剂盒可进一步包含来自另一个来源的细胞因子。或者，试剂盒可包括可在纤维蛋白凝块中递送，或者与纤维蛋白凝块和细胞因子的施用结合来递送的另外的生物药剂。在试剂盒的示例性实施方案中，试剂盒的每种组分单独封装在无菌包装中或易于灭菌的包装中。包括纤维蛋白原组分、凝血酶组分或细胞因子的生物药剂可提供在例如玻璃或塑料小瓶的容器中，并且可进一步承载或悬浮于适合于维持细胞因子或其它生物化合物的液体储存介质中。试剂盒可任选地进一步包括用于将纤维蛋白凝块引入受试者中的一个或多个注射器、导管或其它递送装置。试剂盒可任选地进一步包括一个或多个另外的容器，其各自储存可添加到纤维蛋白凝块中的药剂。试剂盒进一步包括例如用于制备和使用纤维蛋白凝块的印刷说明书。试剂盒的所有要素一起以合适量提供于盒子或其它合适的包装中。本文引用的每篇公布、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容均通过引用的方式以不与本公开相矛盾的程度并入本文。应理解本文所述的实施方案仅用于说明目的，本领域技术人员鉴于此可想出各种修改或改变，这些修改或改变包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。实施例本发明参照以下非限制性实施例更详细地描述，提供所述实施例是为了更全面地说明本发明，而不应被理解为限制本发明的范围。本领域技术人员将会理解这些实施例中描述的技术代表本发明人所描述的在实践本发明时运作良好的技术，并因此构成本发明实践的优选方式。然而，应认识到，本领域技术人员鉴于本公开应认识到在不背离本发明的精神和范围的情况下可对所公开的具体方法作出许多改变，并仍然获得相同或相似的结果。实施例I SDF-1 对Tisseel VHSD 具有亲和力这个实验的目的是测量SDF-I对Tisseel VHSD的亲和力。纤维蛋白密封剂/凝 块组分Tisseel VHSD与重组人SDF-1 a (rhSDF-1 α )之间的复杂相互作用使用表面等离子体共振(SPR)进行实时检查。在这个测定中，将金传感器芯片用Tisseel 的纤维蛋白密封剂蛋白质组分(FC)进行包被，所述包被是通过FC的赖氨酸残基与芯片之间的共价键进行的。(Tisseel 的FC包括纤维蛋白原纤连蛋白、白蛋白和其它蛋白质的混合物。)用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡传感器芯片，这通过使PBS在所述传感器芯片上流动来进行，并且确立基线。通过以O. I毫升/分钟注射五种浓度的rhSDF-Ι α (在约IOnM至约250ηΜ范围内)来替换PBS以研究结合的缔合和平衡相。使重组hSDF-Ι α在传感器芯片上通过，持续7分钟，然后停止注射并用pH 7. 4的PBS流替换。再观察相互作用的解离相7分钟。注射之间的再生是不必要的，因为rhSDF-Ι α从FC中自动解离。在一种浓度的rhSDF_l α结合并从FC中释放之后,测试另一种浓度。一系列传感图数据通过使用Graphpad的Prism4. O根据结合相互作用模型拟合所述数据来进行分析。所得传感图(图Ia)显示出由于SDF-I α结合FC而导致的折射系数随着时间的变化，并且指示SDF-Ia对Tisseel VHSD的FC具有显著的亲和力。使用SPR进行相似的实验以检查重组人SDF-I β (rhSDF-Ι β )与FC之间的相互作用。将新的金传感器芯片用FC包被，所述FC通过可接近的FC赖氨酸残基而与芯片共价键合。与上面提供的实验一样，使PBS在传感器芯片上流动，从而平衡所述传感器芯片并确立稳定的基线。通过以O. I毫升/分钟注射五种浓度的rhSDF-Ι β (在约25ηΜ至约500ηΜ范围内)来替换PBS以研究结合的缔合和平衡相。使重组hSDF-Ιβ在传感器芯片上通过，持续7分钟，然后停止注射并用pH7. 4的PBS流替换。再观察相互作用的解离相7分钟。注射rhSDF-Ι β之间的再生是不必要的，因为rhSDF-Ι β从FC中自动解离。一系列传感图数据通过使用Graphpad的Prism4. O根据结合相互作用模型拟合所述数据来进行分析。所得传感图(图Ib)显示出由于SDF-I β结合FC而导致的折射系数随着时间的变化，并且证明SDF-I β对Tisseel⑧VHSD的FC具有显著的亲和力。实施例2 制备纤维蛋白凝块以确定SDf-I体外释放的动力学这项研究的目的是确定SDF-I体外释放的动力学。纤维蛋白凝块通过用纤维蛋白原稀释缓冲液(FDB)稀释至20mg/ml纤维蛋白原的125 μ IFC和4000ng的SDF-1 α来制备。FDB含有3000KIU/ml抑肽酶、25mM柠檬酸钠、48mM氯化钠、333mM甘氨酸和15g/L人血清白蛋白。将SDF-Ia和凝血酶(4U的125 μ I)添加到FC中从而形成凝块。凝块中的最终浓度是10mg/ml纤维蛋白原、2000ng SDF-I α和2U凝血酶。使纤维蛋白凝块(凝胶)在25°C下聚合，然后用250 μ I含O. 1%人血清白蛋白的PBS清洗。将凝胶用250 μ I含O. 1%人血清白蛋白的PBS覆盖，并且在25°C下孵育I至7天。在第一天，从三个纤维蛋白凝块中移出上清液。将上清液储存在-20°C下并且弃去凝块。在第二天，再从三个凝胶中收集上清液。对于三个新凝胶重复这个过程，直到在第七天收集最后的凝胶的上清液为止。图2示出在七天内SDF-I α从来自Tisseel VHSD凝胶的纤维蛋白凝块中的累积释放。SDF-Ια浓度使用ELISA根据制造商说明书(R&DSystems, Minneapolis, MN)测定。SDF-I α的平均释放在6ng (第I天)至IOOng累积释放(第7天)之间,所述累积释放仅占添加到纤维蛋白凝块中的SDF-I α初始量的5%(100ng/2000ngxl00%)。这些结果表明含有SDF-I的纤维蛋白凝块释放并保持SDF-1。在体内，这些释放动力学可能会受到在7-8天内发生的Tisseel VHSD降解的影响。实施例3 Cd45和CDllb :分化和内皮管形成 这项研究的目的是研究⑶34+骨髓细胞在内皮细胞存在下的血管生成和分化能力。这项研究证明，CD34+细胞及其分化程度较高的子代在这个血管生成测定中都具有促血管生成活性。因此，在某些情况下，Tisseel-SDF-I明显表现出募集较成熟(分化程度较高)和不太熟(分化程度较低)的细胞的能力。将CD34+细胞从脐带血中分离，并且使用细胞离心涂片器、流式细胞仪分析和体外管形成测定中的Matrigel来加以评价。分别通过细胞离心涂片器和流式细胞仪分析证实，新分离的⑶34+细胞包含约91%的胚细胞和约85%的⑶34+。另外，对于⑶34/⑶Ilb/⑶45标记，细胞呈现约33%的三重阳性染色。然后使用利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的Matrigel管形成共培养测定来评价细胞的血管生成能力。在测定中，将HUVEC接种在Matrigel上，并且在不更换培养基的情况下让其生长7天。将存在和不存在CD34+细胞的情况下的内皮管形成在相位显微镜术下进行检查，并且在第24小时和第7天摄取图像(图3a)。虽然单独HUVEC不能维持它们的管结构，但是与CD34+细胞共培养的HUVEC维持管结构至少一周(参见图3a的右下图)。除了如上所述的血管生成(共培养)测定以外，让⑶34+细胞在具有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的Myelocult分化培养基中生长17天。在17天结束时，通过细胞离心涂片器和流式细胞仪分析证实CD34+细胞具有较高的分化程度约5-7%的胚细胞、约3-12%的⑶34+，并且约75%对于⑶Ilb/⑶45分化标记呈双重阳性。当针对促血管生成活性对这种分化程度较高的群体进行评价时，这种群体也能够以与分化程度较低的⑶34+细胞类似的方式维持培养物中的内皮管形成至少一周。在这两种情况下，这两种骨髓细胞群体都具有促血管生成活性(参见图3b)。不受理论约束，似乎Tisseel-SDFl中SDF-I的募集分化程度较高的骨髓群体的能力有可能会增强原位新血管形成。实施例4 使用Tisseel SDF-1 α和Tisseel-SCF-1在体内慕集和保留修复细胞这项研究的目的是检查在使用具有和不具有SDF-I α的Tisseel情况下修复细胞的体内募集和保留。将具有SDF-1 a (300ng) (Tisseel-SDF-1 α )和不具有SDF-1 a (300ng)(Tisseel)的Tisseel凝块皮下植入到鼠科动物后肢中。每只小鼠均在两条腿中接受Tisseel凝块植入物,使得一条腿接受Tisseel植入物而另一条腿接受Tisseel-SDF-l α植入物。在植入后的第一天、第二天、第三天和第四天从小鼠中回收Tisseel凝块。迁移至凝块中的⑶34+细胞使用胰蛋白酶-EDTA消化处理来去除。从Tisseel植入物中回收的表达Cd45、Cdllb和Scal的细胞的数目使用荧光激活细胞分选术(FACS)来量化。这个实验的结果(图4a)表明，与不具有SDF-I的凝块相比，Tisseel-SDF-I凝块上募集了较多数目的共表达⑶45和⑶Ilb的细胞(⑶45/llb+)。类似地，Tisseel-SDF-I募集了较多数目的表达CD34的鼠科同等物Scal的细胞(参见图4c)。在所有四个时间点，统计分析(ANOVA)指示细胞数量的增加对于CD45/llb+群体是统计上显著的。具体来说，对于Scal+群体，P值为O. 002，而对于共表达CD45和CDllb的细胞(⑶45/1 Ib+)，P值为O. 003。还利用经由肌肉内(肌肉内(i.m.))注射施用的Tisseel +SDF-la代替植入物来进行小鼠后肢研究。对于这些研究，从供者小鼠(EGFP+C57BL/6转基因小鼠(JacksonLabs))的股骨和胫骨骨髓(BM)中分离出增强绿色荧光蛋白(EGFP)+细胞。除了 毛发和红细胞以外，这些转基因小鼠在所有细胞中组成型表达EGFP。经由尾静脉注射将EGFP+BM细胞(500万个)注射到受者非EGFP+小鼠中。在第2天和第4天处死受者小鼠，取出肌肉内注射部位，将其消化并且针对EGFP+、CD45+和CDllb+细胞的存在进行评价。图4b中的结果表明，在第2天和第4天，与不具有SDF-I α的肌肉内注射部位(Tisseel 对照；PBS/0. 1%BSA)相比，在含有SDF-I α的肌肉内注射部位中检测到较高百分比的EGFP+、CD45+ 和 CDllb+细胞。还利用经由肌肉内(肌肉内(i.m.))注射施用的Tisseel +SDF来代替植入物进行小鼠后肢研究。对于这些研究，小鼠的一条后肢中接受肌肉内注射(50μ I包含SCF(300ng)的Tisseel )。对照小鼠的一条后肢中接受不具有SCF的Tisseel (50 μ I)的肌肉内注射。在后肢注射之后，小鼠接受如上面在SDF-Ια实验中所述的EGFP骨髓细胞(500万个)。在第2天和第4天处死受者小鼠，取出肌肉内注射部位，将其消化并且针对EGFP+和Sca-I+细胞的存在进行评价。这个实验的结果表明，与对照相比，可在经治疗的动物中检测到较高百分比的EGFP+Sca-Ι+细胞，指示Tisseel 中的SCF有助于在体内募集并保持更多的再生和/或修复细胞。本发明已根据发现或提出包含本发明实践的具体方式的具体实施方案进行描述。本领域技术人员将会明了，在不背离本发明范围和精神的情况下可以对所描述的本发明作出各种修改和变化。虽然本发明结合具体实施方案加以描述，但是应理解所要求保护的本发明不应当不适当地受限于此类具体实施方案。事实上，意图对于相关领域技术人员而言明显的所描述的实施本发明的方式的各种修改落在所附权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种组合物，其包含纤维蛋白凝块和细胞因子或细胞因子组合。
2.如权利要求I所述的组合物，其中所述细胞因子选自由基质衍生因子-I(SDF-I)和干细胞因子(SCF)组成的组。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述细胞因子是SDF-I。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述细胞因子是SCF。
5.如权利要求I所述的组合物，其中所述细胞因子组合包含基质衍生因子-I(SDF-I)和干细胞因子(SCF)。
6.如权利要求I所述的组合物，其中所述纤维蛋白凝块包含任何基于纤维蛋白的止血剂或密封剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述纤维蛋白凝块是Tisseel 或Tisseel VHSD。
8.如权利要求I所述的组合物，其中所述纤维蛋白凝块包含最终浓度为约lmg/ml至约100mg/ml的纤维蛋白原和最终浓度为约0. 5IU/ml至约250IU/ml的凝血酶。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述纤维蛋白凝块包含最终浓度为约10mg/ml的纤维蛋白原和最终浓度为约2IU/ml的凝血酶。
10.如权利要求I至9中任一项所述的组合物，其进一步包含磷酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲盐水溶液。
11.如权利要求2所述的组合物,其包含最终浓度为约I.Ong/ml至约50，000ng/ml的SDF-I。
12.如权利要求11所述的组合物，其包含最终浓度为约10ng/ml至约5，000ng/ml的SDF-I。
13.如权利要求2所述的组合物，其包含最终浓度为约I.Ong/ml至约50，000ng/ml的SCF。
14.如权利要求13所述的组合物,其包含最终浓度为约10ng/ml至约5，000ng/ml的SCF。
15.一种制备包含纤维蛋白凝块和细胞因子或细胞因子组合的组合物的方法，所述方法包括以下步骤将所述细胞因子或细胞因子组合与凝血酶混合，以及将所述细胞因子和凝血酶添加到纤维蛋白原中从而形成所述纤维蛋白凝块组合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞因子选自由基质衍生因子-I(SDF-I)和干细胞因子(SCF)组成的组。
17.一种用于将修复细胞募集并保持于需要它的受试者的局部损伤或疾病部位的方法，所述方法包括将如权利要求I至14中任一项所述的组合物，以对于募集并保持修复细胞于所述损伤部位有效的量递送至所述损伤或疾病部位的所述步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述修复细胞是干细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述修复细胞是骨髓细胞及其分化子代。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述修复细胞对于⑶34(⑶34+)、⑶45 (⑶45+)或CDlIb (CDlIb+)呈阳性。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述修复细胞对于⑶34(⑶34+)、⑶45 (⑶45+)和CDllb (CDllb+)中的一种或多种呈阳性。
22.一种用于治疗需要它的受试者的局部损伤或疾病部位的方法，所述方法包括将如权利要求I至14中任一项所述的组合物，以对于治疗所述损伤或疾病有效的量递送至所述损伤或疾病部位的所述步骤。
23.一种增强需要它的受试者的局部损伤或疾病部位的血管形成，或者诱导需要它的受试者的局部损伤或疾病部位的血管发生的方法，所述方法包括将如权利要求I至14中任一项所述的组合物，以对于增强血管形成或诱导血管发生有效的量递送至所述损伤或疾病部位的所述步骤。
24.一种治疗受试者的局部缺血的方法，所述方法包括将如权利要求I至14中任一项所述的组合物，以对于治疗局部缺血有效的量递送至局部缺血部位的所述步骤。
25.一种用于制备如权利要求I至14中任一项所述的组合物的试剂盒,所述试剂盒包含 (a)包含纤维蛋白原的第一小瓶或第一储存容器； (b)包含凝血酶的第二小瓶或第二储存容器；以及 (c)包含细胞因子或细胞因子组合的第三小瓶或第三储存容器，所述试剂盒任选地含有磷酸盐缓冲液及其使用说明书。
26.—种如权利要求I至14中任一项所述的组合物在制备药物中的用途。
27.一种如权利要求I至14中任一项所述的组合物在制备用于募集并保持修复细胞于局部损伤或疾病部位的药物中的用途。
28.—种如权利要求I至14中任一项所述的组合物在制备用于治疗局部损伤或疾病部位的药物中的用途。
29.—种如权利要求I至14中任一项所述的组合物在制备用于增强局部损伤或疾病部位的血管形成，或诱导局部损伤或疾病部位的血管发生的药物中的用途。
30.一种如权利要求I至14中任一项所述的组合物在制备用于治疗局部缺血的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及包含纤维蛋白凝块和细胞因子的药物组合物，以及在体内将所述组合物递送至疾病或损伤部位从而吸引并保持再生或修复干细胞或骨髓细胞及其分化子代的方法。
文档编号A61L24/10GK102781464SQ201180011808
公开日2012年11月14日 申请日期2011年1月10日 优先权日2010年1月8日
发明者万达·西顿, 希里·尤里尔·瓦拉奇, 斯蒂芬·L·史密斯, 沙恩·多诺万, 洛里达纳·坎波, 詹妮弗·坎贝尔 申请人:巴克斯特医疗保健股份有限公司, 巴克斯特国际公司